생체 마우스 Neuroepithelium에서 단일 세포 분열의 라이브 영상

요약

여기에서 우리는 필요한 도구를 개발 생체 라이브 영상은 마우스 E8.5 neuroepithelium에서 단일 세포 분열을 추적

초록

우리는 형광 마커와 배아 마우스 neuroepithelium의 배양 조각의 라이브 영상을 통합하는 시스템을 개발했다. 우리는 추적 혈통 유전 셀에 대한 기존의 마우스 선을 이용했다 : 타목시펜 유도 크레 라인과 크레-매개 재조합에 DsRed를 표현하는 크레 기자 라인. 타목시펜의 상대적으로 낮은 수준을 사용함으로써, 우리는 우리가 각각의 세포 분열을 따르도록 허용하는 세포의 작은 수의 재조합을 유도 할 수 있었다. 또한, 우리는 Olig2-EGFP 유전자 변형 라인 ^1-3를 사용하여 소닉 고슴도치 (쉬) 신호에 대한 전사 반응을 관찰하고 우리는 섬모 마커, Sstr3-GFP ^4를 표현 바이러스 배양 슬라이스를 감염시켜 섬모의 형성을 감시. 이미지 순서 neuroepithelium, 우리는 신경 튜브를 절연, E8.5에서 배아를 수확, 이미징 챔버에 적절한 배양 조건에서 신경 슬라이스를 장착 시간 경과 공 촛점 이미징을 수행 하였다. 우리의 예생체 라이브 영상 방식은 우리가 생리학 관련 방식으로 차 섬모 형성과 쉬 응답 상대 타이밍을 평가하기 위해 단일 세포 분열을 추적 할 수 있습니다. 이 방법은 쉽게 구별 형광 마커를 사용하여 적응하고 필드에게 현장에서 실시간으로 세포의 행동을 모니터링되는 도구를 제공 할 수 있습니다.

프로토콜

성인 마우스는 기계 자궁 전위에 의해 안락사 있습니다. 모든 동물 절차 IACUC에 모리 대학의 바이오 안전성위원회에 의해 승인되었습니다.

1. 배아 생성

1. 크로스 타목시펜 유도 크레 라인 CAGGCreER 및 dsRedCre 기자 선 (전이 (CAG-Bgeo, -는 DsRed * MST) 1Nagy) (그림 1) ^5,6. 딸 세포, 간 CAGGCreER 및 Olig2-EGFP BAC 형질 전환 생쥐 (전이 (Olig2-EGFP) EK23Gsat) (그림 1) ^7,8과 DsRed를 줄 쉬 응답 상대 타이밍을 모니터링 할 수 있습니다.
2. 100 % 에탄올에 타목시펜을 녹여 크레 발현과 세포의 작은 하위 집합에서 DsRed를 라벨을 유도하는 배아 6.5 (E6.5)에서 임신 여성에 체중 40g 당 2.5 밀리그램 타목시펜의 복강 내 주입을 수행합니다.
3. 48 시간 나중에, 배아를 해부 형광 현미경을 사용하여 DsRed를 긍정적 인 배아를 식별 문화 접시로 전송하고 observ생체 이미징 동안 전자 단일 세포 분열 (아래 참조).

2. 전체 마우스 배아 문화

1. 10 %의 신생아 송아지 혈청과 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 (P / S) ^9로 보충 DMEM/F12 (1:1)를 포함하는 미리 예열 세척 매체에 E8.5 배아를 해부.
2. 직접 형광 현미경 37 ° C 가열 무대에서 해부, 장소 배아 후와 GFP 및 / 또는 DsRed를 플러스 (아래 참조)로 식별합니다.
3. L-글루타민과 보충 페놀 레드없이 50 %의 Sprague-Dawley 계 수컷에서 혈청 쥐와 50 %의 DMEM/F12 (1:1)를 포함하는 사전 평형 배지 500 μL 강하의 1 %에 2 배아까지 이동 0.85 % 염화나트륨 및 P / S ⁹ 1 M의 HEPES.
4. 증발을 방지하고 배양 접시는 37 ° C, 5 % CO ₂ 배양기에 배아를 포함하는 전송 매체를 통해 평형 가벼운 미네랄 오일의 얇은 층 (0.1 cm)를 적용합니다.

3.바이러스 감염

1. neuroepithelium의 레이블 섬모하기 위해서는, E8.5 배아를 포함하는 배양액 500 μL 평형 하락 Sstr3-GFP 렌티 5 ~ 10 μL, 약 2 백만 비리를 추가합니다.
2. 문화의 18 시간 후, 바이러스를 씻어 내고 신경관 슬라이스를 준비하는 세척 매체의 몇 방울에 감염된 배아를 전송합니다.

4. 라이브 영상에 대한 신경 튜브 슬라이스 준비

1. 1 %의 한천 코팅 접시에, 마이크로 칼 크기 0.025 mm를 사용하여 미리 예열 세척 매체 E8.5 태아의 신경관을 해부하다.
2. 35mm 폴리-L-라이신 코팅 유리 바닥 접시에 페놀 레드 않고 평형 배양액 150 μL 드롭 고립 된 신경관 복부 측면을 놓습니다.
3. 를 위해 유리 커버 슬립의 좁은 조각에 의해 100 % 순수 석유 젤리 및 장착 신경관 주위에 녹은 초 왁스 (IKEA에서 촛불) 부드럽게 눌러 만든 1:1 혼합물의 소량을 넣어샘플을 고정시킨다.
4. 평형 가벼운 미네랄 오일의 얇은 층 (~ 0.1 cm) (그림 2)와 접시를 커버.

5. 이미징 및 시간 경과 공 촛점 현미경을 살고

1. 온도 조절 환경 챔버를 갖추고 공 초점 거꾸로 현미경 스캐닝 니콘의 A1R 레이저 아래 장소 접시, 37으로 설정 ° C, 5 % CO _2.
2. 40X 기름 침지 목적 사용 Olig2-GFP와 DsRed를 양성 세포를 모니터링하는 동안 GFP 표시 섬모와 DsRed를 양성 세포를 기록 60X 기름 침지 목표를 사용합니다.
3. 시간 경과 이미징 조건을 설정하는 NIS 요소 소프트웨어를 엽니 다. 매 10 분 1.5 μm의 (40X 목적)와 0.4 μm의 (60X 목적)의 간격이 최대 8 ㎛의 간격으로 Z-스택에 25 μm의 최대를 획득. 필요한 경우 488와 561 nm의 여기 파장 및 전송 채널을 사용합니다. 512 X 512 사이즈로 이미지를 획득. INT의 여러 사용자 정의 영역을 설정erest 동시에 녹음을 수행 할 수 있습니다.
   스캔 속도 1, 선 평균 2 및 핀 구멍의 크기 (61, 이미지의 레이저 전력 및 밝기 최적의 노출로 사용 낮은 레이저 강도 (4.5 %까지 EGFP 488분의 405 mCherry 561의 경우 최대 11 %)로 조정되었다 DsRed를위한 μM, Olig2 28.1 μM, SSTR3GFP 72 μm의, DsRed를하고 SSTR3GFP을위한 61.3 μm의, DsRed를하고 Olig2 위해 58 μm의). 유전자 인코딩 형광 기자의 사용은 우리가 낮은 레이저 파워의 밝기를 감지 할 수있었습니다.
4. Imaris 3D 재구성 소프트웨어를 사용하여 기록 된 데이터를 분석합니다.

6. 면역

1. 유리 접시에 1 시간 동안 얼음에 4 % 파라 포름 알데히드 / 0.1 M 인산 버퍼 (4 ° C)에서 배아 또는 격리 된 신경 튜브를 고정합니다.
2. 샘플에게 얼음에 PBS에서 2 시간 (4 ° C) (변경 PBS 몇 번)와 하룻밤 또는 배아 싱크까지 30 % 자당 / 0.1 M 인산 버퍼에 넣어 씻는다.
3. -80에서 드라이 아이스 및 저장 ° C.에, 10 월에 동결을 포함 피그라 이오 스탯 (10 ㎜)에 단면을 erform.
4. 1 % 열 - 불 활성화 된 양 혈청을 포함하는 세척 용액에 10 분간 0.1 % PBS에 트리톤 X-100에 대한 슬라이드를 씻으십시오.
5. 농도를 다음에서 세척 용액에 기본 항체를 희석 : 쥐 단일 클론 항-RFP (5F8), 1:200, 토끼 반대로 Arl13b 혈청 1:1500 및 마우스 단클론 항-Arl13b 1시 5분 (295B/54) 토끼 반대로 Olig2 1:300, 마우스 monoclonals PAX6, 쉬와 Nkx2.2 모두 1:10과 Ki67 1:500 클론 토끼. 평면 가습 챔버 슬라이드 당 150 ㎕의 주위에 추가 건조 방지와 4에서 밤에 남겨 ° C로 파라 필름 (parafilm)와 커버
6. 세 번, 20 분마다 상온에서 세척 용액에 슬라이드를 씻으십시오.
7. 1:200 농도 세척 솔루션 차 항체 알렉사 플 루어 488, 568, 350 희석. 핵 얼룩 훽스트 1:3,000 또는 TO-PRO-3 1:500을 사용합니다. 슬라이드 당 150 μl를 추가, 빛으로부터 보호 가습 챔버 실온에서 1 시간을 둡니다.
8. 세척 용액 TW에서 슬라이드를 씻으십시오오 시간, 실온에서 30 분마다.
9. 마운트는 24 시간 내에 골드 안티 - 페이드 시약 및 뷰를 연장 80 %에 슬라이드.

결과

여기에서 우리는 E8.5 마우스 neuroepithelium 내에서 단일 세포 분열의 생체 라이브 영상을 시행 하였다. 개별 셀에 레이블을 지정하려면, 우리는 재조합 ^5,6 (그림 3A)에 DsRed를 표현 크레 기자 라인을 포함하는 셀의 하위 집합에 Cre 호텔 재조합을 유도. 따라서, 48 시간 후에 우리는 생체 이미징 (그림 4A-D) 중 하나의 세포 분열을 관찰 할 수 있었다. ^1-3,?...

토론

우리 전직 생체 시스템은 우리가 직접 실시간으로 개발 neuroepithelium 내에서 단일 세포 분열을 관찰 할 수 있습니다. 예를 들어 우리는 마우스 배아 신경관에서 세포 분열을 검토하고 섬모 형성이나 쉬 응답 중 하나를 감시. 우리는 우리의 기술 생리 학적으로 관련 데이터를 제공 나타내는 고정 부분 (n은 = 178)의 결과와 일치 하였다 우리의 이미징 결과 (N = 24)을 확인했다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Z/RED line (STOCK Tg(CAG-Bgeo,-DsRed*MST)1Nagy/J	Jackson Laboratory	005438
Olig2-eGFP line (STOCK Tg(Olig2-EGFP)EK23Gsat/Mmcd	MMRRC,	010555-UCD
CAGGCreER	Jackson Laboratory	003724
Tamoxifen	Sigma	T5648
DMEM/F12 (1:1)	GIBCO	21041-025
Newborn calf serum	Lonza	14-416F
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140-122
Rat Serum SD male	Harlan Bioproducts	4520
1M Hepes	BioWhittaker	17-737E
L-Glutamine	GIBCO	21041-025
Light mineral oil	Sigma	M8410
Sstr3-GFP lentivirus	Emory Viral Core
Micro-knife, size 0.025 mm	Electron Microscopy Sciences	62091
35 mm poly-L-lysine coated glass bottom dish	MatTek	P35GC-0-10-C
100% Petroleum Jelly	Kroger	FL9958c
A1R Laser Scanning Confocal Inverted Microscope	Nikon
NIS Elements software	Nikon
Imaris 3D software	Bitplane AG	Imaris 7.2.3
OCT	Tissue-Tek	4583
Cryostat	Leica	CM1850
Heat-inactivated sheep serum	Invitrogen	16210-072
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151
Parafolmaldehyde	Sigma	P6148
Phosphate Buffer	Lab made
Rat monoclonal anti-RFP (5F8)	Chromotek	110411
Rabbit anti-Arl13b serum	NeuroMab
mouse monoclonal anti-Arl13b 1:5	NeuroMab
Rabbit anti-Olig2	Chemicon	AB9610
Mouse monoclonals Pax6	Developmental Hybridoma Bank	Pax6
Mouse monoclonalsShh	Developmental Hybridoma Bank	5E1
Mouse monoclonals Nkx2.2	Developmental Hybridoma Bank	74.5A5
Rabbit polyclonal Ki67	Abcam	AB15580
Alexa Fluor 488	Molecular Probes	A11029
Alexa Fluor 568	Molecular Probes	A11031
Alexa Fluor 350	Molecular Probes	A11046
H–chst	Fisher	AC22989
TO-PRO-3	Invitrogen	T3605
ProLong Gold anti-fade reagent	Invitrogen	P36934