게놈 DNA에서 도보로 5 hydroxymethylcytosine의 선택적 캡처

요약

설명이 쉽고 밀도에 독립적 인 강화를위한 비오틴 링커를 전송할 클릭 화학에 이어, 5 HMC에 azide - 포도당를 전송하는 β-glucosyltransferase (β-GT)를 사용하여 두 단계 라벨 프로세스입니다. 이 효율적이고 특정 라벨 방식은 차세대 시퀀싱을 통해 매우 낮은 배경과 높은 처리량 epigenomic 매핑과 5 HMC의 농축이 가능합니다.

초록

5 methylcytosine (5-MC)는 인간 게놈 DNA의 총 cytosines의 ~ 2-8%를 구성하고 유전자 발현, 게놈 무결성 유지, 부모의 각인, X-염색체 불 활성화, 규제 등의 생물학적 기능의 광범위한 영향을 개발, 노화, 암 ^1. 최근 산화 5 MC, 5 hydroxymethylcytosine (5 HMC)의 존재는 배아 줄기 (ES) 세포와 neuronal 세포 ^2-4, 특히 포유류의 세포에서 발견되었습니다. 5 HMC는 TET 가족 철 (II) / α-ketoglutarate에 따라 달라 dioxygenases ^{2, 3} 5 - MC 촉매의 산화에 의해 생성됩니다. 5 HMC는 배아 줄기 (MES) 세포, 정상 조혈 및 malignancies, 그리고 접합자 ^{개발이 5-10의} 유지에 참여 제안합니다. 더 나은 5 HMC의 기능을 이해하기 위해서는 안정적이고 간단한 시퀀싱 시스템이 필수적입니다. 전통 bisulfite 배열은 5 - MC ^{11 일부터} 5 HMC을 구별 할 수 없습니다 12 포도당 잔기를 추가 박테리오파지 효소 활용, 라벨 및 5-HMC를 캡처 할 수있는 매우 효율적이고 선택적 화학 접근 방식을 개발했습니다.

여기 5 HMC의 선택적 화학 라벨에 대한 간단한 두 단계 절차를 설명합니다. 첫 번째 라벨 단계에서, 게놈 DNA의 5 HMC는에서 5 HMC에 6 azide 포도당를 전송하는 방식으로, β-GT, T4 박테리오파지에서 glucosyltransferase로 6 azide-포도당 촉매으로 표시됩니다 수정 cofactor, UDP-6-N3-Glc (6 N3UDPG). 두 번째 단계, biotinylation에서 이황화 비오틴의 링커는 클릭 화학으로 azide 그룹에 연결되어 있습니다. 두 단계는 게놈 지역에서 5 HMC의 풍부한 관계없이 라벨 매우 낮은 배경을 제공 완료로 이어지는, 매우 구체적이고 효율적이다. 5 HMC의 후 biotinylation, 5 HMC 함유 DNA 조각을 한 후 선택적으로 캡처되어밀도 독립적 인 방식으로 streptavidin 비즈를 사용합니다. 그 결과 5 HMC 강화 DNA 조각은 차세대 시퀀싱 등의 다운 스트림 분석을 위해 사용될 수있다.

우리의 선택 레이블 및 캡처 프로토콜은 다양한 / 변수 5 HMC의 abundances과 게놈 DNA의 소스에 해당 높은 감도를, 수여. 이 프로토콜의 주요 목적은 자사의 다운 스트림 응용 프로그램 (예., 차세대 시퀀싱은 게놈의 5 HMC 배포를지도)이지만, 단일 분자입니다 실시간 SMRT (DNA) 시퀀싱과 호환됩니다 5 HMC의 단일 기본 해상도 시퀀싱을 제공 할 수.

프로토콜

1. 게놈 DNA 조각

원하는 크기 범위로 sonication을 사용하여 조각 게놈의 DNA는 게놈 전체 시퀀싱 플랫폼에 가장 적합합니다. (우리는 보통 ~ 300 BP에 sonicate.) 1% 아가로 오스 겔 (그림 1)에 조각 게놈의 DNA의 크기 분포를 확인합니다.

2. DNA 준비

게놈 DNA의 5 HMC의 풍부한에 따라 시작 DNA 금액을 확인합니다. 5 HMC 수준이 다른 조직 유형에 크게 다르므로, 시작 DNA의 금액은 샘플 5 HMC 수준에 따라 달라집니다. 예제 표 1을 참조하십시오.

3. β-GT 촉매 반응 (포도당 전송 반응)

1. 1 시간에 37 ° C 물 목욕의 표 2와 배양에 명시된 바와 같이 혼합물을 pipetting하여 섞는다.
2. 부화 후, DNA의 10 μg을 당 사용 QIAquick 염기 제거 키트와 반응을 정리열. 열 30 μl 물 Elute과 조화를 이루고 있습니다.

4. Biotinylation 반응 (클릭 화학)

1. 150 μm의 최종 농도 (즉, 30 μl DNA 솔루션에 따라 솔루션을 작업 5 μl)에 용출 DNA 솔루션 (3 단계에서) DBCO-SS-PEG3 - 비오틴 공액 작업 솔루션 (1 MM)를 추가합니다.
2. 2 시간에 37 ° C 물 목욕에 pipetting 및 배양하여 섞는다.
3. QIAquick 염기 제거 키트와 반응을 정리. 이상적인 총 용출 볼륨은 100 μl입니다.
4. 마이크로 리터 규모 분광 광도계 (예를 들면., NanoDrop)를 사용하여 복구 DNA 금액을 수량화.

5. 5 HMC 함유 DNA의 캡처

1. 제조업체의 지시에 따라 1X B & W 버퍼 1 ML과 Dynabeads MyOne Streptavidin C1의 50 μl 3 번 씻으십시오. 자기 스탠드로 구슬을 분리합니다.
2. 복구 biotinylated D에 배 B & W 버퍼의 동등한 볼륨을 추가세척 구슬로 NA (100 UL).
3. 회선 근의 부드러운 회전 실온에서 15 분에 품다.
4. 자기 스탠드로 구슬을 분리하고 1X B & W 버퍼 1 ML과 구슬에게 3 번 씻는다.
5. 회선 근의 부드러운 회전 상온에서 2 시간에 신선하게 조리 된 50 ㎜의 DTT의 100 μl의 구슬을 잠복기하여 DNA를 Elute.
6. 자기 스탠드로 구슬을 분리합니다. DTT를 제거 할 수있는 제조 지침에 따라 마이크로 바이오 스핀 6 열로 eluent와 부하를 대기음. 대상 DNA는 이제 솔루션입니다.
7. EB 버퍼의 10 μl의 Qiagen PCR MinElute 정화 키트 및 elute의 DNA에 의해 이전 단계에서 용출 DNA를 정화. 농도가 20 NG / UL보다 높은 경우 큐빗 Fluorometer, 또는 NanoDrop를 사용하여 DNA를 정량화. DNA는 다운 스트림 게놈 전체 시퀀싱 도서관 준비 할 준비가되었습니다.

6. 대표 결과

품질 O 경우F 게놈 DNA가 높은, β-GT와 biotinylation 반응 후 일반적인 복구 수율은 ~ 60-70% 있습니다. 그러나, 캡처 효율은 샘플의 5 HMC 수준에 따라 서로 다른 조직 유형 상당히 다릅니다. 일반적으로, 뇌 게놈의 DNA에 대한 캡처 효율은 ~ 4-9%이며, 일부 극단적 인 경우에 효율은 12 %까지 도달 할 수 있습니다. ES 세포의 경우 평균 캡처 효율은 신경 줄기 세포에 대한 ~ 0​​.5 %로 대조적으로, ~ 2-4%입니다. 본 최저 효율은 지금까지 암 세포의 게놈 DNA에 대한했습니다. 모든 농축 DNA는 표준 차세대 도서관 준비 프로토콜 준비가되었습니다. 또한 캡처 한 DNA는 또한 관련 프리 머를 사용할 경우 입력 DNA에 비해 몇 조각의 강화를 감지하는 실시간 PCR을위한 템플릿으로 사용할 수 있습니다.

1 그림. 에 Sonicated 인간 게놈의 DNA 조각1퍼센트 아가로 오스 겔. 1X TE 버퍼 120 μl 인간의 IPS 세포로부터 격리 게놈 DNA의 10 μg은 sonication 장치 (Covaris)를 사용하여 sonicated되었습니다. sonication 후, sonicated DNA의 2 μl은 sonicated DNA 조각의 크기를 비교하는 DNA 마커의 100 BP를 사용하여 1퍼센트 아가로 오스 겔에로드했습니다.

구성 요소	음량	최종 농도
물	_ μl
10 X β-GT 반응 버퍼	2 μl	1 X
최대 10 μg의 게놈의 DNA에	_ μl	최대 500 μl / NG
UDP-6-N 3-Glc (3 ㎜)	0.67 μl	100 μM
β-GT (40 μM)	1 μl	2 μM
총 볼륨	20 μl

조직 게놈의 DNA (높은 5 HMC 내용> 0.1 %)의 경우 I)

구성 요소	음량	최종 농도
물	_ μl
10 X β-GT 반응 버퍼	10 μl	1 X
20 μg의 게놈의 DNA에	_ μl	최대 500 μl / NG
UDP-6-N3-Glc (3 ㎜)	1.33 μl	100 μM
β-GT (40 μM)	2 μl	2 μM
총 볼륨	40 μl

II) 줄기 세포 게놈의 DNA (평균 5 HMC 내용 ~ 0.05 %)의 경우

구성 요소	음량	최종 농도
물	_ μl
10 X β-GT 반응 버퍼	10 μl	1 X
최대 50 μg의 게놈의 DNA에	_ μl	최대 500 μl / NG
UDP-6-N3-Glc (3 ㎜)	3.33 μl	100 μM
β-GT (40 μM)	5 μl	2 μM
총 볼륨	100 μl

III) 암 세포 게놈의 DNA (낮은 5 HMC 내용 ~ 0.01 % 용)

표 1. 입력 DNA와 선택 화학 라벨 방식에 의한 다양한 5 HMC 수준으로 샘플을 사용하여 라벨 반응 금액의 예.

견본	5 HMC 수준	시작 DNA (μg)	라벨 후 복구 (구슬로 입력) (μg)	복구 수율	풀다운 DNA (NG)	풀다운 얻을 수
성인 마우스 소뇌	0.4 %	10	7.5	75%	236	3.1 %
출생 후의 일 7 마우스 소뇌	0.1 %	11	9	82%	140	1.6 %
마우스 ES 세포 E14	0.05 %	60	42	70%	350	0.8 %

표 2. 마우스 뇌 조직 및 ES 세포의 대표 결과입니다.

토론

5 hydroxymethylcytosine (5 HMC)는 특정 포유류의 세포 유형에서 상당한 양의 최근 확인 epigenetic 수정 존재입니다. 여기에 제시된 방법은 5 HMC의 게놈 전체의 분포를 결정하기위한 것입니다. 우리는 5 HMC의 수산기 그룹에 azide 그룹을 포함하는 엔지니어링 포도당 잔기를 전송하는 β-glucosyltransferase T4 박테리오파지를 사용합니다. azide 그룹은 화학적으로 포유류의 genomes에 5 HMC 함유 DNA 조각의 감지, 연관성 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
이름	회사	# 카탈로그를	논평
			시약
5M 나트륨 염화물 (NaCl)	Promega	V4221
0.5M pH8.0 Ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산))	Promega	V4231
1M Trizma베이스 (트리스) pH7.5	Invitrogen	15567-027)
HEPES 1M, pH7.4	Invitrogen	15,630
염화 마그네슘 (MgCl 2) 1M	Ambion	AM9530G
디메틸 sulfoxide (DMSO)	시그마	D8418
십대 초반 20	피셔 BioReagents	BP337-100
DBCO-SS-PEG3 - 비오틴 공액	화학 도구를 클릭합니다	A112P3
1,4 - Dithiothreitol, ultrapure (DTT) Superpure	Invitrogen	15508-013
QIAquick 염기 제거 키트	Qiagen	28,304
마이크로 바이오 스핀 6 열	바이오 RAD	732-6222
Dynabeads MyOne	Invitrogen	650-01
Streptavidin C1
Qiagen PCR MinElute 정화 키트	Qiagen	28,004
UltraPure 아가로 오스	Invitrogen	16500500
UDP-6-N 3 포도당	활성 Motif로	55,013
			효소
β-glucosyltransferase (β-GT)	뉴 잉글랜드 Biolab	M0357
			장비
Sonication 장치	Covaris
데스크탑 원심 분리기
열탕 목욕	피셔 과학
젤 실행 장치	바이오 RAD
NanoDrop1000	열 과학
Labquake 튜브 쉐이커	Barnstead
Labquake 튜브 쉐이커	Thermolyne
자기 분리 스탠드	Promega	Z5342
큐빗 2.0 Fluorometer	Invitrogen
			시약 설정 10 X β-GT 반응 버퍼 (500 MM의 HEPES 산도 7.9, 250 MM MgCl 2) 2 X 구속력과 (10 MM 트리스 산도 7.5, 1 ㎜ EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 2 M NaCl, 0.02 % 십대 초반 20) (B & W) 버퍼를 세척 .