대장암의 Orthotopic 마우스 모델

요약

이게 맹장에 피하 종양의 조각의 cecal 벽이나 이식으로 암 세포 현탁액의 주입 : 두 기술이 모델을 확립하는 데 사용할 수 있습니다. 이 모델은 대장암의 자연 진행을 공부하고 대장암에 대한 새로운 치료 요원을 테스트하는 데 유용합니다.

초록

전통 피하 종양 모델은 대장암을 연구에 이상적보다 적습니다. 그들의 자연적인 위치에 성장하는 암 세포를 특징 대장암의 Orthotopic 마우스 모델, 높은 성실과 인간의 질병을 복제합니다. 두 기술은이 모델을 수립하는 데 사용할 수 있습니다. 두 기술과 유사하며 맹장의 노출에 대한 마우스 마취와 개복술을 필요로합니다. 한 기술은 cecal 벽에 대장암의 세포 현탁액의 주입을 포함한다. 암 세포 먼저, 문화, 재배 때 subconfluent 수확 및 단일 세포 현탁액으로 준비하고 있습니다. 세포의 작은 볼륨 누출을 피하기 위해 천천히 주입합니다. 다른 기술은 맹장에 피하 종양의 조각의 이식을 포함한다. 이전에 설립 피하 대장암 종양을 가진 마우스는 euthanized되고 종양은 멸균 기술을 사용하여 제거됩니다. 종양이 작품은 다른 마우스에 이식을위한 작은 조각으로 나뉘어져 있습니다. 이전 이식하는 cecal 벽은 가볍게 종양 세포 침투를 용이하게하기 위해 손상되었습니다. 차 종양과 간 metastases을 개발하는 시간은 기술, 세포주, 및 사용 마우스 종류에 따라 달라집니다. 이 orthotopic 마우스 모델은 대장암의 자연 진행을 공부하고 대장암에 대한 새로운 치료 요원을 테스트하는 데 유용합니다.

프로토콜

I. 셀 준비

1. 대장암 세포는 문화에 재배 언제 subconfluent 수확한 수 있습니다.
2. 단일 세포 현탁액은 인산에 준비하는 것은 생리 버퍼와 얼음에 보관.

II. 종양 준비

1. 이전에 설립 피하 대장암 종양을 가진 마우스는 euthanized이다.
2. 피하 종양은 2-3밀리미터 조각으로 살균 기술을 사용하여 제거하고 나누어져 있습니다
3. 종양이 조각은 인산에 보관하는 것은 얼음 호수 버퍼.

III. 마우스 준비

참고 : 저희 연구실에서는 마우스를 마취하는 isoflurane 흡입 사용; 또는 하나는 동일한 효과를 달성하기위한 주사용 anesthetics을 사용할 수 있습니다

1. 마취의 깊이는 발가락 핀치를 사용하여 평가됩니다. 발가락 핀치와 반사 철회도 없을 것입니다.
2. 항생제는이 시점에서 주어진 수 있습니다.
3. 이전 면도되었다 anesthetized 마우스는, 적절하게 배치됩니다.
4. 복부는 betadine 솔루션을 준비하고 있습니다.
5. 복부와 외과 사이트는 살균 방식에 draped 있습니다.

IV. 개복술

1. 작은 닉은 피부에 이루어집니다
2. 복부 벽 근육이 파악하고 부축입니다
3. 복강은 입력과 가위의 단일 블레이드가 떨어져 내부 복부 내용을 추진하는 데 사용됩니다
4. 절개는 2~3cm로 확장

이게 맹장의 V. 노출

1. 그 맹인 끝나는 파우치로이게 맹장은 식별 및 exteriorized입니다
2. 이게 맹장은 미리 절단, 멸균 거즈를 사용하여 마우스의 나머지 부분으로부터 격리
3. 따뜻한 생리는 맹장의 촉촉한을 유지하는 데 사용됩니다

VI. Cecal 장벽에 셀의 분사

1. 27 G 또는 미세한 바늘이 cecal 벽에 전지의 50 μL 볼륨을 삽입하는 데 사용됩니다
2. 주사 바늘을 제거
3. 사출 사이트가 더 유출을 보장하지 검사입니다
4. 이게 맹장은 복강에 반환됩니다

VII. 이게 맹장에 종양의 이식

참고 : cecal 벽에에 세포를 주입하는 것 외에도 대안 접근 방식은이게 맹장에 종양을 이식하는 것입니다

1. 8 스티치의 수치는 6-0 또는 7-0 크기의 봉합사를 사용하여 맹장에 배치됩니다
2. cecal 벽면은 살짝 손상
3. 그런 다음, 종양이 작품은 위치이다
4. 스티치가 아래로 묶여있다
5. 이게 맹장은 복강에 반환됩니다

VIII. 마우스 복벽 폐쇄 및 복구

1. 마우스 복벽는 3-0 또는 4-0 크기 봉합사로 3 중단 바늘을 사용하여 폐쇄
2. 또는, 하나는 간단한 실행 바늘을 사용할 수 있습니다
3. 포스트 수술 진통제와 액체 볼러스이 시점에서 주어진 수
4. 마우스가 마취에서 회복하기 위해 허용됩니다.

참고 : 흡입 anesthetics로이 일반적으로 30 초 소요

IX. 검색 결과 - 기본 종양 및 간 전이

기본 종양 - 현장에 표시 (A)와 neovascularization의 증거 (B)로, H & E 염색법에 종양 로컬 침략 아르 (C)

간 Metastases - 표시 예 생체내 (D)

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토론

마우스 피하 종양 모델 확립 및 모니터링 쉬운 있지만,이 모델은 대장암의 원래 해부 사이트를 복제할 수 없다는 분명하다. microenvironment의 차이로 인해, 피부 아래에 성장 대장암 세포들은 표현형을 변경하고 거의 항상 ^1,2를 진보와 전이에 실패 표시되었습니다. 사실, 치료 종양 반응은 암세포가 이소성 (피하) 대 orthotopic 위치 ^3의 이식 여부에 따라 크게 달라질 수 있습니다. 그들의 자연적인 위?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture media and components			will vary depending on cell line used
Phosphate Buffered Saline	BioWhittaker	17-512F	also sold by a number of other vendors
15 mL centrifuge tubes, polypropylene	Corning	430790
6 well plates with lid	BD Biosciences	353046
Iris forceps, straight, serrated tips	World Precision Instruments, Inc.	15914	best to have a pair of these instruments
Iris dissecting scissors, straight, sharp	World Precision Instruments, Inc.	14393
Needle Holder (regular)	World Precision Instruments, Inc.	14109
Needle Holder (Castroviejo)	World Precision Instruments, Inc.	14137
Cidex Plus	World Precision Instruments, Inc.	7364	instruments should be autoclaved periodically, but may also be sterilized by soaking in Cidex
6-0 or 7-0 suture			for cecum; courtesy of Department of Surgery, UCSF
3-0 or 4-0 suture			for abd wall; courtesy of Department of Surgery, UCSF
Anesthetic machine / Isoflurane	J.A. Baulch and Associates	3206	also sold by a number of other vendors
Heating Pad, disposable, 6" x 6"	Prism Technologies	20419
Tape, orange, 13 mm x 13 m	Fisher Scientific	15901F	for restraining anesthetized mouse
Pro-Cord/Cordless Trimmer	Oster Professional Products	78997-010	for shaving mouse fur
Betadine	Fisher Scientific	19-027132	may also be purchased at any medical supply store
2 x 2 gauze, 3-ply	Johnson & Johnson	7635	may also be purchased at any medical supply store
Sterile Field, Barrier, 16" x 29"	Johnson & Johnson	0905	may also be purchased at any medical supply store
Cotton tipped applicators, 6"	Fisher Scientific	14-960-3Q	may also be purchased at any medical supply store
Syringe, 10 cc, Luer lock tip	BD Biosciences	309604
Syringe, 1 cc, tuberculin, slip tip	BD Biosciences	309602
27 1/2 G needle	BD Biosciences	305109
30 G needle	BD Biosciences	305106