신생아 Subventricular 지대 Electroporation

요약

우리는 신생아 subventricular 영역 electroporation라고 최소한 침입 기술을 보여줍니다. 기술은 신생아 새끼의 측면 심실에 플라스미드 DNA를 주입하고 전달하는 전기 전류를 적용 구성되어 있으며, 유전자 신경 줄기 세포를 조작

초록

신경 줄기 세포 (NSCs)는 라인 출생 후의 측면 심실하고 뉴런, astrocytes, 그리고 ependymal 세포 ¹ 등 여러 세포 유형에 상승을 제공합니다. 분자 NSC 자기 갱신, 노력에 대한 책임 경로와 차별화를 이해하는 것은 활용 뇌를 수리하고 더 나은 중추 신경계 장애를 이해하는 독특한 가능성에 중요합니다. 포유류의 시스템의 조작에 대한 이전 방법은 전체 동물의 ² 단계에서 유전 공학의 시간이 소요 비싼 노력이 필요했습니다. 따라서, 연구의 대부분은 체외 또는 무척추 동물의 NSC 분자의 기능을 살펴 보았다.

여기, 우리는 신생아 subventricular 구역 (SVZ) electroporation로 언급됩니다 신생아 NPCs를 조작 할 수있는 간단하고 빠른 방법을 보여줍니다. 비슷한 기술은 배아 NSCs을 공부하는 10 년 전 개발 및 cortica에 대한 연구를 도와 왔으며리터 개발 ^3,4. 최근이는 출생 후의 쥐 forebrain은 ^5-7 공부 적용되었습니다. 이 기술 SVZ NSCs과 자손의 강력한 라벨의 결과입니다. 따라서, 출생 후의 SVZ electroporation은 포유류의 NSC 유전 공학을위한 비용 및 시간 효율적인 대안을 제공합니다.

프로토콜

이 절차는 예일 IACUC 요구 사항에 따라 수 있습니다. 과학자들은 IACUC 가이드 라인은 자신의 기관 요구 사항에 따라 승인 및 준수되어 있는지 확인해야합니다.

1. 제 1 항. DNA, 솔루션 및 유리 피펫의 준비

1. 고순도 (OD 280분의 260> 1.80) 높은 농도 (μg / μl> 2.5) 독소가없는 DNA를 생성 할 수 있습니다.
2. 22 μm 필터를 통해 0.9 % 생리 식염수와 멸균 필터를 준비합니다.
3. 장소 10cm 화재 광택 붕규산 유리 모세관 튜브 (OD : 1.5 mm, ID : 1.10 mm) 모델 kanthal 와이어와 PP-830 Narishige PC-10 유리 피펫 풀러에. 70.5에서 한 단계 가중 풀다운 ° C.에 풀러를 설정 원형 집게와 팁을 해제하고 계단 가장자리에 해부 현미경으로 검사한다. 15 분을위한 UV 램프 아래에 베벨 팁과 장소. 당겨 피펫은 팁의 가장자리에서 2mm에서 표시해야합니다.
4. 무게 / 볼륨 빠른 그린 soluti 0.1 % 준비건조 빠른 그린과 혼합 살균 필터 0.9 % 생리 식염수로 있습니다.

2. 제 2 항. 동물 준비, 유리 피펫 로딩 및 플라스미드 주입

1. 유리 페트리 접시 4 미리 차가운에, 케이지 0-1 새끼 개별적으로 출생 후의 일 장소를 제거 ° C, 그리고 서부 유럽 표준시 얼음에 위치.
2. 약 5 분 후, 도보로 핀치 응답을 이용하여 anesthetization의 상태를 결정합니다. 심실 주사는 전혀 움직임이 발생하지 않으면, 주제 새끼.
3. 그것은 빠르고, 녹색, DNA, 그리고 생리 식염수의 조합 빠른 증발, 결정화 및 유리 피펫의 봉쇄 될 수 있습니다하는 것이 중요합니다. 따라서, 주식 솔루션과 주사 직전에 parafilm로 나누어지는 1-2 μl를 생성합니다.
4. 당겨 유리 피펫으로 전체 aliquoted 볼륨을 대기음.
5. 엄지와 덜 지배적 인 손의 검지 손가락 사이의 강아지의 머리를 잡아.
6. 램프를 켜십시오D는 광선 이외의 강아지의 머리를 누르고 있습니다. 필요한 경우, 강아지가 반사 빛의 양을 줄이기 위해 머리에 염분 넣어. 심실 이제 조명해야합니다.
7. 당신의 지배적 인 손을 사용하면 (그림 1A 및 1B)에 가장 가까운 측면 심실에 바늘을 삽입합니다. 주사의 사이트는 lambdoid 봉합과 눈과 시상 봉합에 측면 2mm에서 약 등거리 있어야합니다. 삽입은 측면 심실에 침투을 보장해야하는, P0 강아지에 대한 2mm 마크에 피펫을 꺼냈다. 동시에, 당신은 intracranial 압력의 릴리스에서 피펫으로 CSF의 작성 다시 볼 수 있습니다. 플라스미드의 주입을 도와 intracranial 압력을 줄이기 위해 pup.Step 2.8의 머리에 그립을 느슨하게. 공기 압력을 주입기 (Picospritzer, 파커)를 사용하여 측면 뇌실에 플라스미드의 약 0.5 μl를 삽입.

3. 제 3 항. Electroporation 및 복구

1. SEt 5 평방 펄스, 950 밀리 초 간격으로 100 볼트 50 밀리 초 / 펄스에 대한 electroporation 발생기​​의 전압. 플라스미드 electroporation의 공간 특이성은 무료 전송의 방향에 의해 결정됩니다. 닫기주의 SVZ ^(8)를 따라 줄기 세포 인구의 이질성을 부여 게재 위치를 제공해야합니다. 증식과 세포 운명의 속도의 차이는 복부 - 등쪽과 뱃 부리 장식이있는 - 꼬리 위치 ^9,10에 대한 확인되었습니다.
2. 일단 플라스미드는 딥 트위터 전극은 PBS로, 주입된다. 이 단계는 요금이 전송을 극대화하고 저항으로 인한 화상을 방지하는 것입니다.
3. 플라스미드 주사의 사이트 (그림 1C 및 1D)에 ipsilateral 귀 근처에있는 강아지의 등 측면 벽에 긍정적 인 전극을 배치합니다. 의 강아지 코에 contralateral 반구 복부 측면에 부정적인 전극을 배치합니다.
4. 펄스 foots를 눌러 현재 송금을 시작합니다마녀는 등쪽에서 ~ 25 ° 각도 간격을 사용하여 측면에 전극 페달하고 지나간다.
5. 장소 5 분의 가열 패드에 새끼를 electroporated. 부드럽게 부드러운 자극과 새끼 매 30 초를 회전 할 수 있습니다.

결과

트위터 전극의 "탁"운동 (그림 1E) 다음 등쪽의, 등쪽의 측면, 그리고 측면 subventricular 구역과 인접 거의 모든 요골 glia의 라벨에 신생아 subventricular 영역 electroporation 결과이다. 그러나, electroporation은 각 실험의 요구에 맞는하지만 전극을 샅샅이 및 비디오 상세과 같은 특정 위치와 방향을 사용하지 할 수 있습니다. dorsally 현지화 반경 glia 이러한 안감에서 심실의 측면 부분을 다?...

토론

다음은 세부 신생아 SVZ의 electroporation의 기술, 신속하고 견고 라벨 및 SVZ의 줄기 세포와 자손을 조작 할 수있는 기술을. electroporation 다른 기술에 비해 가지고 몇 가지 장점이 있습니다. 첫째, 세포의 초점 라벨에 따라, 하나는 세포 자율적와 비 세포 자율적 인 효과를 판별 할 수 있습니다. inducible 시스템을 사용하여 둘째, 유전자 조작 한 사전이나 신경 통합 후 효과를 비교할 수 있습니다. 또한, 하...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
시약의 이름	회사	카탈로그 번호	코멘트 (선택 사항)
중형 연마 붕규산 배관	셔터 악기	BF150 - 110-10
듀얼 스테이지 유리 Micropipette 풀러	Narishige	PC-10H
빠른 그린	피셔 과학	0521192205
ECM 830 스퀘어 웨이브 펄스 발생기	하버드 장치	45-0052
Tweezertrodes	하버드 장치	45-0488
광섬유 광원	피셔 과학	12-562-36
텅스텐 할로겐램프	우시오 미국, Inc의	1002247
Picospritzer II	파커 악기	052-0312-900