개인 신장 세포 암에서 단백질 표현 변화를 탐험하기 위해 역 위상 단백질 배열 (RPPA)의 사용

요약

RPPA이 휘황이라는 항체를 사용하여 동시에 심문을 할 수 니트로 셀룰로스 슬라이드에 인쇄 샘플 수백의 단백질 표현을 할 수 있습니다. 이 기술은 투명 세포 신장 암에서 약물 치료 이질성의 효과를 연구에 적용되었습니다.

초록

현재 전이성 투명 세포 신장 세포 암에 대한 치료 치료, 질병의 commonest 변형이 없습니다. 이 치료 저항에 핵심 요소가 질병 ^(1)의 분자 복잡한 것으로 생각됩니다. 같은 티로신 키나제 억제제 (TKI) sunitinib의 타겟 치료가 사용되어 왔지만, 환자의 단지 40 % 1 년 ² 안에 원래대로 돌아가는 이들 환자의 절대 다수와 함께 응답합니다. 신장 세포 암 환자에 고유 및 취득 저항 등의 질문은 ³ 관련성이 있습니다.

효과적인 맞춤 치료를 개발의 궁극적 인 목표로, TKIs에 저항을 연구하기 위해, 대상 치료의 특정 기간 이후 순차 조직은, 만성 골수 양 백혈병 ^(4)에 성공적으로 입증 한 접근 방식을 필요합니다. 그러나 신장 세포 암종 이러한 전략의 응용 프로그램은 B의 높은 수준에 의해 복잡신장 세포 암종 ^5,6뿐만 아니라 다른 고체 종양 ^7의 기능입니다 oth 간 및 intratumoral 이질성. transcriptomic와 유전자의 차이로 인해 Intertumoral 이질성은 잘도 유사한 프리젠 테이션, 무대와 종양의 등급 환자에 설립되어 있습니다. 또한이 더욱 분자 이질성을 대표 할 가능성이 RCC에 큰 형태학 (intratumoral) 이질성이 있다는 것을 분명하다. 통합 형태학의 분석 및 Fuhrman 등급의 RCC 종양에 대한 상세한 매핑 및 분류는 proteomic 분석을위한 대표 지역의 선택을 할 수 있습니다.

RCC ⁸ 단백질 기반의 분석으로 인해 병리 실험실에서의 광범위한 상황에 매력적입니다하지만, 그 응용 프로그램은 특정 항체 ^9의 제한된 가용성으로 인해 문제가 발생할 수 있습니다. 역 위상 단백질 배열의 점 얼룩 자연 (RPPA), 항체 특이성은 반드시 B로 인해전자 사전은 - 확인, 사용 항체의 이러한 엄격한 품질 관리로 최고의 중요성입니다. 이러한 제한에도 불구하고 점 얼룩 형식은 하나의 니트로 셀룰로스 슬라이드로 샘플 수백 인쇄 수 있도록 검정 소형화을 허용하지 않습니다. 인쇄 슬라이드 그런 다음 멀티플렉싱을 허용, 대상 특정 기본 항체와 휘황 분류 이차 항체를 이용하여 서양 분석과 유사한 방식으로 분석 할 수 있습니다. 슬라이드에있는 모든 샘플에서 차동 단백질 표현식은 다음보다 비용 효율적이고 높은 처리량 방식으로 형광의 상대적 수준을 비교하여 동시에 분석 할 수 있습니다.

프로토콜

1. 형태학 및 분자 종양 이질성의 확인

1. 종양 -80 ° C의 냉동고에서 제거 드라이 아이스에 보관.
2. 약 1cm ³ 부분으로 종양을 나눈다. 각 종양 서로에 대해 섹션을 고유 한 이름으로 라벨의 원래 위치를 매핑합니다. 스토어 샘플 -80에서 개인 cryovials에서 ° C 사용할 준비가 될 때까지.
3. 코트 샘플 10월 및 -22 ° C.에 그라 이오 스탯에 절단
4. 샘플 Hematoxylin과 Eosin의 counterstaining 방법을 사용하여 얼룩이.
5. 냉동 섹션의 현미경 분석들이 ccRCC 자연, 가능한 종양 및 등급 (냉동 섹션에 Fuhrman 등급 1을 4 대 차별화 할 도전 낮은 등급 높은 등급 또는 혼합 고 / 저 등급)에 대한의을 보장합니다. 그림 1 A & B (H & E 염색 높은 낮은 혼합 학년).
6. 단백질 추출 각 종양 내의 각 morphologically 서로 다른 지역에서 4 샘플까지 선택합니다.

2. 종양 샘플에서 단백질 추출

1. 10월에서 종양 샘플을 잘라 버릴거야.
2. 용해 버퍼 990 μl 수있는 2 ML 튜브에 조직의 장 50-75 MG [50 MM 트리스 - HCL (산도 7.5), 5 MM EGTA (산도 8.5), 150 MM NaCl] aprotinin (시그마 A6279) (10 밀리그램과 보충 / ML), 인산 가수 분해 효소 억제제 칵테일 2 (시그마, P5716), 인산 가수 분해 효소 억제제 칵테일 3 (시그마, P0044)와 프로테아제 억제제 칵테일 (로슈, 11836153001).
3. 각 튜브에 하나 5mm의 스틸 볼을 추가하고 두 번 각 5 분 기간이 지나면 TissueLyser를 사용하여 균질화의 수준을 확인 5 분을 위해 50Hz에서 균질화.
4. 뒤에 강철 공을두고 피펫을 사용하여 새 2 ML 튜브에 균질 샘플을 전송합니다.
5. 4 ° C.에서 30 분 동안 13,000 XG에서 centrifuging 전에 각 샘플에 트리톤 X-100의 10 μl를 추가합니다
6. 신선한 microcentrifuge 튜브에 supernatants를 전송합니다.
7. BCA 분석을 (그림 2)를 사용하여 단백질 농도를 결정합니다.
8. 1 MG / ML에서 단백질 농도를 정상화.

3. 항체 확인

1. 서부 얼룩에 대한 단백질 샘플을 (적절한 셀 라인 또는 조직에서 추출) 준비하고 10 % SDS-PAGE 젤에서 실행됩니다.
2. 4에서 하룻밤 니트로 셀룰로스 막에 샘플을 전송 ° C.
3. 상온에서 1 시간에 리튬 오호 오디세이 차단 버퍼 (PBS에서 50:50에 희석)에 멤브레인을 차단합니다.
4. 제조업체에서 리튬 오호 오디세이 차단 버퍼의 기본 항체를 (PBS에서 50:50에 희석) 희석 희석 1,000에 일반적으로 1 권장합니다.
5. 4 ° C.에서 밤새 차 항체의 멤브레인을 품다
6. 0.1 % PBS-Tween20 (, 1 ML Tween20 / 1L PBS PBS-T)를 구성합니다.
7. 5 분 (X3)에 대한 실온에서 PBS-T의 멤브레인을 씻으십시오.
8. 오디세이 차단 버퍼 (PBS에서 50:50에 희석) 0.01 % 1:10,000 희석에서 SDS (1.5 μl/15 ML)에 차 항체를 휘황 라벨이 표시된 희석.
9. 차의 멤브레인을 품다부드러운 진동과 45 분 동안 실온에서 항체 - 그것이 마지막 스캔 작업이 완료되었으며, 같은 시간까지 빛으로부터 멤브레인을 보호하는 것이 중요합니다.
10. 어둠 속에서 막을 유지 5 분 (X3), 동안 실온에서 PBS-T의 멤브레인을 씻으십시오.
11. 다시 어둠 속에서 막을 유지 잔여 Tween20을 제거하는 5 분 (X3), 동안 실온에서 PBS의 멤브레인을 씻으십시오.
12. 어둠 속에서 필터 종이에 평면 멤브레인을 누워 건조한 공기 할 수 있도록 - 건조 할 수있는 멤브레인의 신호를 향상시키고 배경을 줄일 수 있지만, 벗겨하고 다시 프로빙하기에 쓸모 렌더링 할 수 있도록합니다.
13. LiCor 오디세이 스캐너에 멤브레인을 검사합니다. 이 스캔되어 같은 시간까지 어둠 속에서 막세요.
14. 만 정확한 분자량의 하나의 지배적 인 밴드를 생성 항체을 선택합니다. 그림 3은 RPPA와 함께 사용하기위한 허용 및 허용되지 않는 항체의 예를 보여줍니다.

4. RPPA PRInting

1. 단백질 lysates는 MicroGrid II 로봇 반점을 찍는를 사용하여 니트로 셀룰로스 - 코팅 유리 슬라이드 (Fastslides-워트 먼지)에 발견되었다. 사용 슬라이드 샘플이 발견 된에이 패드가 포함되어 있습니다. 각 패드는이 경우 100 샘플에 동일한 샘플 발견되었습니다. 다른 사용 가능한 형식은 1, 8 및 16 패드 슬라이드가 포함되어 있습니다. 패드의 높은 번호를 작은 각에 발견 할 수 있습니다 샘플의 수입니다.
2. 오 2 배 dilutions 일련의 각 샘플에서 만든 각 그 다음 (샘플 당 15 곳의 총의 결과) 세중의에 발견되었다.

5. RPPA 단백질 감지

1. 초과 LiCor 차단 버퍼에 젖은 슬라이드 (PBS에서 50:50에 희석). 흔들 플랫폼에서 1 시간에 RT를 품다.
2. 원하는 농도에 LiCor 차단 버퍼 (PBS에서 50:50에 희석)에 차 항체 800 μl를 준비하고 얼음 계속.
3. 중은 (i) 단일 프레임 칩 클립에서 슬라이드를 마운트또는 (ii) 'FastFrame의 4 베이 슬라이드 홀더 그래서 시일이 슬라이드 및 배양 챔버 사이에 형성되는.
4. 우물에서 잔류 버퍼를 제거하고 각각의 우물에 600 μl 차 항체를 추가 할 수 있습니다.
5. 4에 밤새 플랫폼을 흔들에 봉인 된 서부 유럽 표준시 상자 및 배양에 슬라이드와 챔버를 배치 ° C.
6. 0.1 % PBS-Tween20 (; 100 μl 십대 초반 1백분의 20 ML PBS PBS-T)를 구성합니다.
7. 추운 방에서 슬라이드를 제거하고 신중하게 각 우물에서 차 항체를 제거합니다.
8. PBS-T 600 μl를 추가하고 5 분 (X3)에 대한 RT에서 플랫폼을 흔들에 슬라이드를 씻으십시오.
9. 오디세이 차단 버퍼 (PBS에서 50:50에 희석) 0.01 % 첫 번째 인스턴스에서 1:2,000 희석 (1 μl / 2 ML)에서 SDS에 diluting하여 휘황 - 라벨 차 항체를 준비합니다.
10. 우물에서 버퍼를 제거하고 각각의 우물에 600 μl 휘황 - 라벨 차 항체를 추가합니다. 부드러운 진동과 45 분 동안 실온에서 보조 항체를 배양 -가이 마지막 스캔 작업이 완료되었으며, 같은 시간까지 빛으로부터 멤브레인을 보호하는 것이 중요합니다.
11. 상온에서 600 μl PBS-T에서 잘하고 간단히 세척 (X3)에서 차 항체를 제거합니다. 통신사에서 슬라이드를 제거 적당한 용기에 전송하고 어둠 속에서 막을 유지, 15 분에 대한 초과 PBS-T에 씻는다.
12. 다시 어둠 속에서 막을 유지, 잔여 십대 초반-20을 제거하는 PBS-T 및 15 분 동안 실온에서 PBS에 대한 추가 세탁 막을 제거합니다.
13. 10 분 50 ° C의 오븐에 Fastslide 건조 후 리튬 오호 오디세이 스캐너에 스캔합니다. 이 스캔 될 때까지 어둠 속에서 슬라이드세요.
14. 보조 항체 / 사용 항체에 따라 680 nm의 및 / 또는 800 nm의에서 슬라이드를 스캔합니다. 2 색 검출을 위해 항상 교차 반응성을 최소화하기 위해 매우 간 adsorbed 차 항체를 사용합니다. 기본 및 보조 항체에주의 선택은 2 색을 감지하기 위해 필요합니다. 주요 중요성의 선택은두 가지 기본 항체에 대해 다른 호스트 종 (예를 들면 토끼 및 마우스). 이 쉽게 구별 방출 스펙트럼과 염색으로 분류됩니다 항 토끼 반 마우스 보조 항체에 의한 차별 할 수 있습니다.
15. 이미지 파일은. tiff 파일로 저장됩니다. 그림 4는 (스캔 파일의 이미지).

6. 데이터 분석

1. MicroVigene 소프트웨어 (VigeneTech, 칼라일, MA, USA)를 실행합니다.
2. 엽니 다. RPPA 슬라이드의 검사를 포함하는 TIFF 이미지 파일을.
3. RPPA 슬라이드의 이미지에 오버레이 할 수있는 그리드를해야합니다 미리 정의 된 템플릿 파일을 선택합니다.
4. 클릭하여 그리드를 표시, 관심 (ROI) 버튼의 영역을 정의합니다.
5. RPPA 장소를 통해 그리드를 배치합니다. 그림 6A (이미지 이상의 격자의 이미지).
6. 모든 투자 수익 (ROI)을 강조하기 위해 모두 선택 버튼을 클릭합니다.
7. 모두 찾기를 클릭합니다. MicroVigene이 autom합니다atically 투자 수익 (ROI)을 찾아, 관광 명소를 찾아 배경을 빼야 모든 먼지를 제거하고 장소를 정할.
8. RPPA 슬라이드에있는 모든 샘플에 대한 결과를 가져보기 희석 곡선 버튼을 클릭합니다.
9. 희석 데이터 저장을 클릭합니다.
10. 각 샘플은 5 희석 포인트에서 인쇄되기 때문에 세중의에서 각 분석 15 점, 오류의 위험을 줄이고 커브 피팅의 품질을 향상 있습니다. MicroVigene는 항원 - 항체 결합 반응 속도론의 sigmoid 곡선을 생산하기위한 모든 부분을 포함 4 매개 변수 물류 - 로그 모델 "Supercurve"알고리즘 (그림 6B)를 생산하고 있습니다. 가정은 동일한 항체 - 항원 바인딩 속도론는 일반적인 응답 곡선에 맞게 배열에있는 모든 장소를 활용하여 따라서도 다른 샘플에 각각의 샘플 지점에 자리를하고있다하면 곡선 피팅 ^10,11의 신뢰를 높일 수 있다는 것입니다
    Y = + ((BA) / (1 + E (C * D-솔직히 (X)))
    x는 dilutio입니다N 요소와 Y는 신호 강도입니다.
    샘플은 비교적 분석에 supercurve로 사람들을 매핑 한 후 x 값의 중간 지점에있는 Y 값에 대응 y0 값을 사용하여 분석 할 수 있습니다.
11. 그림 7에서와 같이 Microsoft Excel 및 플롯 y0의 데이터를 내 보냅니다.
12. Intratumoral 단백질 차이는 ANOVA 프레임 워크의 치료 및 처리 치료 환자에 대해 개별적으로 계산되었습니다. 모든 분석 단백질의 데이터를 결합 분산 배포판은 맨 - 휘트니 시험 (MWT)로 비교했다. 잘못된 검색 속도 (루즈 벨트)이 수정은 ¹² 적용, 각각의 단백질에 대한 Intratumoral 차이는 정상 상태와 homoscedasticity의 가정이 Lillefours 및 Fligner 테스트를 사용하여 각각 평가 개최 F-테스트에 비교했다. 치료 및 처리 환자 샘플 사이의 차동 단백질 표현식은 학생의 t-테스트를​​ 사용하여 각 단백질에 대한 테스트 된 곳 정상 상태 및 homoscedasticity 가정S는 달리 MWT이 수행되었습니다 충족 된, 루즈 벨트는 결합 t-테스트 및 MWT 값을 ^12으로 적용되었습니다. 단백질에 대한 단백질 표현과 분산 피어슨 상관의 의의는 표준 접근 방식을 사용하여 추정 된 [R 참조]와 루즈 벨트는 ^12을 적용했습니다.

결과

스캔 RPPA 슬라이드의 예는 680과 800 nm의 표시 채널을 모두 그림 4은 (i)에서 볼 수 있습니다. 파장, 그림 4 (II)에 의해 이미지를 분리하면 분석 할 RPPA 슬라이드와 그림 4 (III)를 결정 개별 단백질의 발현에 각 패드를 할 수 있습니다. 그림 4에서 볼 수 있듯이 (iii) 본 샘플에서 개별 단백질의 표현은 Gelsolin이 훨씬 낮은 단백질 표현이 cMYC에...

토론

여기에 제시된 RPPA 방법은 단백질 분석의 널리 사용하지만 비교적 낮은 처리량 서부 얼룩 기술에 대한 높은 처리량 대안을 나타냅니다. 방법은 샘플 수백 분석 동시에 셀 라인과 조직 샘플의 다양한 선택의 주요 단백질의 직접 비교할 수 비교 반 정량적으로 할 수 있습니다. 다른 항체 종과 멀티플렉싱은 더 여러 항체를 동시에 사용할 수 있도록 기술의 힘을 증가시킵니다. 여기에 제시된 예는 종?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
시약의 이름	회사	카탈로그 번호
aprotinin	시그마	A6279
인산 가수 분해 효소 억제제 칵테일 2	시그마	P5726
인산 가수 분해 효소 억제제 칵테일 3	시그마	P0044
프로테아제 억제제 칵테일	로슈	11836153001
트리톤 X-100	트리톤-X	T8787
리튬 오호 오디세이는 버퍼 차단	리튬 오호	927-40000
TissueLyser	Qiagen	85,600
MicroGrid II 로봇 감적	Biorobotics
FastFrame의 4 베이 슬라이드 홀더	워트 먼지	10486001
FAST 슬라이드 - 2 패드	워트 먼지	10485317
IRDye 680LT 염소 안티 - 마우스 IgG	Licor	926-68020
IRDye 800CW 염소 안티 - 토끼 IgG	Licor	926-32211