수술 표본에서 인간 췌장 섬의 레이저 Microdissection을위한 개선 된 프로토콜

요약

레이저 microdissection은 실질의 미세한에서 선택한 셀의 복구를 할 수있는 기술입니다. 여기 transcriptomic 연구에 사용되는 수술 표본에서 인간의 췌장 섬을 획득을위한 프로토콜을 설명합니다. 우리 프로토콜은 따라서 자신의 컬렉션을 촉진 인간의 베타 세포의 고유 autofluorescence을 향상시킵니다.

초록

레이저 microdissection (LMD)는 실질 ^1,2의 미세한에서 선택한 셀과 조직의 복구를 할 수있는 기술입니다. 해부 세포는 이러한 transcriptomic 또는 proteomic 연구, DNA 평가 나 염색체 분석 ^2,3 등 조사의 다양한 사용할 수 있습니다. LMD의 특히 어려운 응용 프로그램은 RNA ^(4)의 lability로 인해 셀이 같은 췌장 등의 RNases의 풍부 조직 분석하던 때 특히 눈에 띄는 될 수 transcriptome 분석이다. 대상 세포의 빠른 식별 및 수집을 가능하게 microdissection 프로토콜은 조직 처리 시간을 단축 할 수 있으며, 결과적으로, RNA의 보존을 보장하기 위해이 설정에 필수적입니다.

여기 transcriptomic 연구 ^5에 사용되는 수술 표본에서 인간의 췌장 베타 세포를 획득을위한 프로토콜을 설명합니다. 0.5-1에 대한 C의 췌장의 작은 조각m ³ sectioning 때까지 즉시 2 Methylbutane 차가운에 냉동 조직 - 테크 10월 컴파운드에 포함 resected의 췌장의 표본의 건강 나타나는 여백,에서 절단하고, -80에 저장 ° C 있었다. 10 μm 두께의 40 시리얼 섹션은 1-2 분의 그라 이오 스탯 내부 건조하고, -80에 저장 유리 슬라이드, ° C.에 개별적으로 전송, -20 ° C 설정에 따라 그라 이오 스탯을 삭감했다

즉시 레이저 microdissection 절차 전에 섹션은 얼음 차가운 백퍼센트에서 두 1 분 incubations하여 얼음처럼 차가워에서 수정 갓 30 초에 70 %의 에탄올을 준비, 얼음 차가운 DEPC - 처리 물에 5-6 딥으로 세척하고, 건조 된 에탄올은 4 분 동안 크실렌 (조직 탈수에 사용되는)에 의해 다음, 조직 섹션 3-5 분 동안 나중에 한 후 공기 건조했다. 중요한 것은, 모든 단계는 크실렌의 부화를 제외하고 얼음처럼 차가운 시약을 사용하여 수행되었습니다 - 이전에 설명 된 프로토콜을 ⁶ 이상 수정. UT얼음 차가운 시약의 ilization는 베타 세포의 고유 autofluorescence의 발음 증가로 이어진, 그들의 인정을 촉진. microdissection를 들어, 4 개의 섹션은 각 시간 건조했다 : 두 수분과 표백에서 조직을 보호하기 위해 호일로 싼 50 ML 튜브에 배치 된, 나머지 두 사람은 즉시 microdissected되었습니다. 이 절차는 (AutoLPC) 모드를 Catapulting 자동 레이저 압력을 채용 PALM MicroBeam 악기 (Zeiss)를 사용하여 수행되었습니다. 40-60 분보다 더 이상 필요 넷 cryosections에서 베타 세포 / 작은 섬의 해부의 완성. 셀은 한 AdhesiveCap으로 수집, 10 μl 용해 버퍼로 lysed되었습니다. transcriptomic 분석을 위해 각 단일 RNA 시료는 10 셀 microdissected 샘플, 피코 순수 RNA 절연 키트 (악튜러스)를 사용하여 RNA 추출 다음을 조합하여 얻은 것입니다. 이 프로토콜은 따라서 자신의 신속하고 정확한 인식과 C을 촉진, 인간의 베타 세포의 고유 autofluorescence을 향상ollection. 이 절차의 추가 개선 2 형 당뇨병과 관련된 변경 사항을보다 잘 이해 가능한 의미와 함께, phenotypically 다른 베타 세포의 절개를 사용하도록 설정할 수도 있습니다.

프로토콜

1. 인간 췌장 조직의 동결

1. 지방 조직, 혈관, 신경 및 메스와 핀셋과 비 parenchymal 조직을 제거하고 조각 (~ 0.5-1 cm 조각)로 췌장 조직을 잘라.
2. Cryomold의 중심에 하나 췌장 조직 조각을 놓고, 차가운 조직 - 테크 10월 컴파운드로 완전히 커버. 그의 아래 액체 질소에 미리 냉각 2 Methylbutane와 스냅 - 동결로 덮여 있습니다 병에 Cryomold을 놔. -80 ° C.에있는 냉동 샘플을 저장

2. 냉동 섹션의 작성

1. RNA의 변성을 피하기 위해 모든 단계에 걸쳐 장갑을 착용한다.
2. 멀리 차가운 100 % 에탄올과 RNase와 그라 이오 스탯 나이프, 표본 홀더와 붓를 청소합니다. 그라 이오 스탯 내부의 냉동 조직을 배치합니다.
3. 조직, 칼과 붓 -20 ° C.에 도달 할 때까지 기다리 기다리는 동안 그라 이오 스탯 챔버 내부 SuperFrost 플러스 슬라이드와 사전 시원한 그들을 레이블을조직 -20 ° C.에 도달 할 수에 대한
4. 표본 홀더에있는 조직 - 테크 10월 컴파운드를 적용하고 상단에 고정 된 조직을 배치합니다.
5. 조직 - 테크 10월 컴파운드이 고정되면 cryoblock을 다듬과 면도날과 조직 - 테크 10월 컴파운드의 초과를 제거합니다.
6. 췌장 조직 블록에서 40 연속 10 μm 슬라이스 총 자른다. 또한 우리는 microdissection 과정에서 조각 안에 섬의 식별을 용이하게 할 수있는 췌장 섹션의 개요 도면에 저장되는 제 1 및 중간 조각을 절단하는 것이 좋습니다.
7. 칼 블레이드의 섹션 준수하여야 할 만 지역을 따뜻하게하기 위해 손가락 (장갑으로 덮여)으로 슬라이드의 뒷면을 터치하여 SuperFrost 플러스 슬라이드의 중앙에 섹션을 전송합니다.
8. -20에서 그라 이오 스탯 내부의 섹션 1-2 분 ° C, 당신이 드라이 아이스에 배치 슬라이드 상자에 넣어 그 이후에 말린다. 섹션을 저장-80에서 ° C.
9. 필요한 경우, 종이 수건과 차가운 100 % 에탄올로 칼 블레이드를 청소.

3. 냉동 섹션 탈수

1. 시약 준비 : 30 ML 신선하게 조리 된 70 % 에탄올, 30 ML DEPC - 처리 물, 2x30 ML 100 % 에탄올과 50 ML Cellstar 튜브 (팔콘)로 30 ML의 크실렌을 흘려, 오한과 얼음에있는 모든 시약을 (크실렌 제외) 유지.
2. 100 % 에탄올과 RNaseZAP와 후드 작업 공간을 청소하십시오.
3. 다음과 같은 과정이 cryosections가 : 얼음 차가운 DEPC - 처리 물에 5-6 빠른 딥을 씻고, 30 초에 얼음 차가운 70 % 에탄올에 해결, 크실렌의 4 분에 품다, 얼음 차가운 100 % 에탄올에 1 분에 두 번 탈수 실내 온도 (25 ° C), 3 ~ 5 분에 대한 건조 공기에서. cryosections 또 한 쌍의로이 단계를 반복합니다.
4. 빛과 습기에서 보호하기 위해 알루미늄 호일로 싼 50 ML Cellstar 관으로 백업 뒤로 두 건조 cryosections를 삽입합니다.

4. PALM MicroBeam, Zeiss와 베타 세포의 레이저 Microdissection

1. RNaseZAP과 현미경을 청소하고 RoboMover의 접착제 모자를 탑재합니다.
2. 필터 세트 09 (여기 : 450-490 nm의, 방출> 515 nm 정도), AutoLPC 모드, 50 %의 레이저 에너지 65 %, 레이저 초점, 100 % 레이저 속도, AutoLPC 샷 사이에 5 μm 거리, 6 μm 거리 다음 설정을 설정합니다 -10,100 : 선에 높이를 작동.
3. 무대에 하나의 슬라이드를 삽입합니다.
4. 미세 시각화 (5 배 또는 10 배 렌즈) 아래 autofluorescent 베타 세포를 찾습니다.
5. 40x 렌즈로 전환, "자유형"선택 도구를 사용하여 베타 세포를 선택하고 레이저를 사용하여 사진을 microdissect.
6. 한 AdhesiveCap로 4 탈진 cryosections의 조직을 캡처합니다.
   1 주석 : 한 건조 cryosection의 베타 세포를 해부 할 수있는 시간이 될 것입니다 조직 섹션의 rehydration을 피하​​기 위해 10-20 분 이상이 아니어야합니다저하 RNA.
   2 의견 : 검사 점으로 무대를 이동 한 후 육안 검사에 의해 성공적으로 microdissection 프로세스를 확인합니다.

5. Microdissected 베타 세포 농축 조직의 용해

1. RoboMover에서 AdhesiveCap를 제거합니다.
2. AdhesiveCap의 뚜껑과 42에서 거꾸로을 길러 ° C를 30 분에에 Pipet 10 μl 추출 버퍼 (XB, PicoPure RNA 분리 키트, 악튜러스).
3. 10,000 XG에서 스핀 다운 및 드라이 아이스에 lysate를 넣어. RNA 추출이 수행 될 때까지 -80 ° C에 저장합니다.
4. 반복 3 단계를 반복합니다.) 5.) 다른 모든 섹션과.

6. RNA 추출

1. 10 개의 10 μl lysates을 결합
2. 70 % 에탄올 (DNase 처리 포함)에 1:1 비율 추출 버퍼 (XB)를 사용하여 PicoPure RNA 분리 키트, 악튜러스의 프로토콜에 따라 실온에서 협력하여 RNA 격리와 함께 진행합니다.

7. RNA 분석

1. 애질런트 2100 Bioanalyser (PicoChip)을 사용하여 품질과 수량의 분석에 대해 1 μl RNA를 사용합니다. 정량 평가는 칩 병렬로로드 표준 RNA를 참조로 이루어집니다.

결과

그림 1에 도시 된 바와 같이, 수정 건조 프로토콜은 이전의 게시 된 프로토콜 ^6에 비해 베타 세포의 autofluorescence의 개선을 이끌었다. 설명 프로토콜 적용, 39 수술 췌장 표본의 각 31'544'704 μm ^세 조직 / 췌장 표본의 평균 (: - 81'522'153 μm ³ 8'742'390 범위) 40 시리얼 cryosections를 생성하는 데 사용 된 표 1에 표시된. 이 150 μm의 직경, 또는 3...

토론

우리는 수술 췌장 표본의 인간 섬의 레이저 microdissection (LMD)에 대한 신뢰할 수있는 접근 방법을 설명합니다. LMD 현미경을 사용할 수 있다고합니다,이 절차는이를 모두 비 당뇨병과 2 형 당뇨병 환자 과목에서 인간의 작은 섬 소재에 대한 액세스를 증가, 부분 pancreatectomies를 수행하는 연구 기관에서 구현 될 수 있습니다. 이 작은 섬 고립에 제공 pancreata의 소수 주어진 특히 해당됩니다. 의 Favourable ?...

자료

시약의 이름	회사	카탈로그 번호	코멘트
2 Methylbutane (이소 펜탄)	로스	3927.1
AdhesiveCap (불투명, 500 μl)	ZEISS	415190-9201-000
Cellstar 튜브 (50 ML)	greiner 바이오 - 원	210 261	지원 스커트로
Cellstar 튜브 (50 ML)	greiner 바이오 - 원	227.261
디 에틸 pyrocarbonate (DEPC)	시그마	D 5758
드라이 아이스
절대 에탄올	VWR	20821.310
액체 질소
브러쉬를 페인트
PALM MicroBeam	ZEISS
필 - 편도 삽입 금형 (립니다), 12 X 12mm	ProSciTech	RR12	탑 내부 22x22 mm, 깊이 21mm
악튜러스 PicoPure 냉동 RNA 분리 키트	응용 Biosystems	KIT 0,204
플라스틱 클램프
면도칼
RNase 무료 DNase 세트	Qiagen	79,254
RNaseZAP	시그마	R 2020
메스 /외과 블레이드	테크노는 잘라 내기	2800111
SuperFrost 플러스 부착 현미경 슬라이드	열 과학	J1800AMN​​Z	25x75x1.0 mm
조직 - 테크 10월 컴파운드	사쿠라	4583 또는 0807000022
족집게	브라운	BD168R
크실렌	VWR	28975.291