액포와 세포질의 pH 측정<em&gt; 생체 내</em&gt; 효모 세포 현탁액의

요약

액포와 세포질 pH는 라이브 효모 측정 할 수있다 ( S. cerevisiae의) 특정 세포 구획에 국한 비례 형광 염료를 사용하여 세포. 우리는 효모의 공포에 지역화 BCECF-AM, 그리고 세포질 비례 산도에 민감한 GFP (효모 pHluorin)와 세포질 산도와 액포 산도를 측정하기위한 절차를 설명합니다.

초록

액포와 산도 세포질이 높은 효모 세포의 조절과 전체의 pH 항상성에 중요한 역할을 차지한다. 우리는 공포 또는 세포질로 지역화 산도에 민감한 형광 물질을 사용하여 생체 내에서의 pH 비례 측정을위한 프로토콜을 설명합니다. 액포 pH는 그 아세 톡시 메틸 에스테르 형태로 세포에 도입하면 효모 공포에 지역화 BCECF를 사용하여 측정됩니다. 세포질 pH는 효모 발기인, 효모 pHluorin의 통제하에 표현 산도에 민감한 GFP로 측정됩니다. fluorimeter에서 효모 세포 현탁액의 형광 비율을 측정하는 방법이 설명되어 있습니다. 이러한 프로토콜을 통해 다른 조건 하에서, 또는 다른 효모 돌연변이의 pH 단일 시점의 측정이 비교되었고 시간이 지남에 따라 산도의 변화를 모니터링하고 있습니다. 이 방법은 높은 처리량 실험 형광 플레이트 리더 형식에 맞게 조정되었습니다. 다른 AP에 비례 pH 측정의 장점현재 사용 가능한 실험 문제 및 해결하고, 이러한 기술의 향후 사용에 대한 전망의 접근 방법도 설명합니다.

서문

의 pH 항상성은 모든 생물 ^1,2 역동적이고 고도로 통제 프로세스입니다. 생화학 적 과정은 밀접하게 산도에 의해 규제되고, 세포 환경은 주민 효소의 최적 활동을 할 수 있도록 좁은 산도 범위로 조정됩니다. 그러나 세포의 pH 항상성은 환경 산도, 대사 변화, 특정 신호 전달 경로의 급격한 변화에 도전 할 수 있습니다. 또한, 세포 내 pH는 중요한 신호로 자신을 제공 할 수 있습니다. 마지막으로, 많은 세포 소기관이 세포 소기관 특정 기능에 대한 주변의 세포질에서 독특하고 필수적인 lumenal의 pH 값을 유지합니다.

높은 진핵 생물 ^2의 pH 항상성 메커니즘의 효모 인 Saccharomyces cerevisiae의 주가는 숫자입니다. 리소좀 / endocytic 통로의 산성 세포 소기관으로, pH는 주로 많은 exchan와 협력하여 행동, 고도 보존 액포 양성​​자 translocating ATPase의 (V-ATPase의)에 의해 제어됩니다산도 기울기에 따라 제르. 모든 진핵 세포는 양성자 수출 메커니즘이 있습니다. 에 곰팡이와 식물, 플라즈마 막에서 두 번째, 독특한 프로톤 펌프, Pma1, 수출 신진 대사 양성자와는 세포질 pH와 세포막 전위의 주요 결정 요인이 될 것으로 생각됩니다. S.의 유전 적 유연성 cerevisiae의 및 상업적 중요성은, 그것의 pH ^{항상성이 공부를위한} 매우 중요하고 흥미로운 모델을 만들었습니다.

세포 기관 산성화의 주요 드라이버 일뿐만 아니라, V-ATPases 매우 효소를 통제하고 우리의 실험실은 V-ATPase의 규제 메커니즘을 이해에 관심이 있습니다. 이 목표를 향해, 우리는 액포와 세포질의 pH 생체 pH 측정에 사용하고있다 : 1) 돌연변이의 효과 타협 V-ATPase의 활성을 조사하기 위해 포도당 박탈 및 readdition 2로 변경 세포 조건)에 대한 응답을 모니터링하는 데, 3) COOR를 탐험세포 소기관 및 플라즈마 막 양성자 펌프 ^3-5 조율 활동. 이러한 실험은 효모 세포에서 사용할 의무가 강력한 비례 산도 지표의 개발을 통해 가능하게되었다. . 포유 동물 세포의 세포질 산도를 측정하기 위해 널리 사용되었습니다, 효모 액포에 축적 - 플랜트 등 첫번째 BCECF ((6) carboxyfluorescein 2'7' - 비스 - (2 - 카복시 에틸) -5) 것으로 나타났다 대신 세포질 ^6. BCECF 현지화의 차이는 BCECF-AM (BCECF의 아세 톡시 메틸 에스테르) 및 액포 유지 ^6에서 아세 톡시 메틸 에스테르의 분열에 대한 가능성이 책임 액포에있는 많은 가수 분해 효소에 기인하고있다. 알리 등 ^7. 더 BCECF를 사용하여 액포의 pH 측정을 개발하고 형광 플레이트 리더 형식으로 이러한 측정을 적응. 브렛 등. 플라스미드 매개 R을 표현하여 효모의 세포질 산도를 측정하는 수단으로 효모 pHluorin 소개효모 특이 적 프로모터 ⁹ 통제 atiometric 산도에 민감한 GFP ^8.

BCECF 효모 pHluorin 모두의 여기 스펙트럼은 산도에 민감, 그래서 그들은 하나의 발광 파장에서 측정 된 두 여기 파장,에서 형광의 비율은 pH가 ^8,10의 측정을 제공하는 비례의 pH 지표로 사용됩니다. 이러한 효모 액포와 세포질 pH 센서는 모두 단일 셀 및 인구 기반 측정에 사용되었습니다. 단일 세포 측정은 ^6,11 형광 현미경 및 이미지 분석에 의해 수행됩니다. 두 파장에서의 액포 또는 세포질 형광 각 셀에 대해 측정됩니다. 인구 기반의 측정은 적절한 형광 기능을 갖춘 마이크로 플레이트 리더 중 하나 또는 fluorimeter에서 수행됩니다. 그것은 죄수 중에 이러한 포도당 같은 구성 요소의 추가에 대한 쉬운 접근을 제공하기 때문에 우리는 일반적으로 fluorimeter 우리의 측정을 수행 한tinuous 운동 측정. 액포와 세포질의 pH 측정을위한 우리의 현재 실험실 프로토콜은 아래에 나열되어 있습니다; 둘은 쉽게 마이크로의 분석에 적용됩니다.

프로토콜

1. BCECF-AM을 사용하여 생체 내에서 액포의 pH 측정

1. 밤새 원하는 매체에 측정 할 효모 균주의 50 ML 액체 문화를 성장. 목표는 (OD600 (600 nm에서 흡광도) 서스펜션 약 0.8 측정) 중반 로그 단계에서 세포를 가지고있다.
2. 원심 분리하여 펠렛 효모 세포. 성장 매체 이전에 무게 된 microcentrifuge 관에 전송 0.6 ㎖에 펠렛을 resuspend을. 60 초 동안 2,000 XG에서의 microcentrifuge에 다시 펠렛은 세포. 가능한 완벽하게 뜨는을 제거하고 세포 펠렛을 무게. 0.5 g / ㎖ (W / V)의 최종 농도에 펠렛을 resuspend을,이 볼륨의 문화는 약 200 밀리그램의 세포 펠렛 및 버퍼 200 μl를 제공합니다 400 μL의 최종 볼륨을 제공하기 위해 추가됩니다.
3. DMSO에 준비 12 밀리미터 주식에서 50 mm의 최종 농도에서 세포 현탁액에 BCECF-AM 추가 할 수 있습니다. 후 잘 입고 혼합30 분 동안 30 ° C에서 세포를 ubate. 흔들 플랫폼 또는 롤러 드럼.
4. 세포가 배양되는 동안, 보정 버퍼를 준비합니다. 50 MM의 HEPES (4 - (2 - 히드 록시 에틸)-1-piperazineethanesulfonic 산), 50 mM의 KCl을 50 mM의 NaCl을 0.2 M 암모늄 아세테이트, - 보정 버퍼는 50 mM의 MES를 ((N-모르) 에탄 산 2) 포함 10 MM 나트륨 아 지드, 10 MM 2-deoxyglucose 및 산도로 조절은 수산화 나트륨이나 염산의 보정 범위에 해당하는 값입니다. (주의 : 아 지드 화 나트륨은 매우 독성 및 취급에주의해야합니다.) 야생 형 세포에서의 pH 측정을 위해, 우리는 (6.5,하지만 더 많은 알칼리성 액포 산도가 예상 돌연변이에 대한 pH가 5.5에 여러 보정 혼합물을 준비 할 VMA 돌연변이), 우리는 추가, 높은 산도 버퍼를 준비합니다.
5. 나누어지는 2 15 ML 원뿔 튜브에 각각의 산도에 대한 보정 버퍼의 ML, 최종 110 μM의 모 넨신의 농도가 15 μM nigericin, R을 제공하는 모 넨신 (15 밀리미터 주)와 nigericin (2 MM의 주식을)를 추가espectively. 와류 믹서에 잘 섞는다. (주의 : 모 넨신 및 nigericin 모두가 독성 및주의하여 취급해야합니다.)
6. 의 microcentrifuge에서 2,000 XG에서 30 초 동안 원심 분리하여 BCECF-AM의 배양 시간이 완료되면 펠렛 세포 현탁액. 세포를 resuspend을 위와 포도당과 원심 분리기 부족한 성장 매체 1 ML입니다. 일단이 세척 단계를 반복 한 다음 포도당없이 성장 배지 200 μL에 펠렛을 resuspend을. 얼음에 위치.
7. 위의 준비 각 pH 보정 튜브에 세포 현탁액의 20 μl를 추가합니다. 30-60 분 동안 30 ° C에서 알을 품다. 롤러 드럼.
8. 교대 여기 파장 450 nm의 490 nm의 535 nm의에서 방출 파장에서 모두 측정 할 수 fluorimeter을 설정합니다. 30 ° C.에 샘플 챔버의 온도를 설정 큐벳의 혼합물의 연속 교반 모든 측정을 수행합니다.
9. 1 mM의 MES의 1.96 ML을 (세포의 성장 배지의 pH에​​ 따라 pH가 5 ~ 7로 조정 추가차 실험 설계). 큐벳에 세포 현탁액의 20 μl를 추가합니다. 형광 측정을 시작합니다. 우리는 지속적인 운동과 다른 실험 시간 포인트 데이터를 모두 수집합니다. 지속적인 운동 데이터의 경우, 우리는 5 분 동안 매 6 초 측정을 수행 한 후 50 mm의 최종 포도당 농도 포도당을 추가하고 5-10 분 동안 측정을 계속합니다. 단일 시간 지점 측정을 위해, 우리는 일반적으로 1에서 측정을 수행하고 5 분. 큐벳에 세포의 추가 후, 운동 측정에서와 같이 포도당을 추가하고 다른 측정 5 분 소요. 포도당 첨가 한 후. 이러한 추가는 변경 될 수 있으며, 추가 구성 요소 (억제제 등)도 추가 할 수 있습니다.
10. 실험 측정이 완료된 후, 30 ° C 배양에서 교정 튜브를 제거하고 fluorimeter 큐벳에 각각 전체 2 ㎖ 볼륨을 전송할 수 있습니다. 매 5 초마다 각 샘플에 대한 30 초 총에 (1.8 참조) 동일한 설정에서 형광을 측정합니다.
11. Microsoft Excel로 형광 데이터를 내보낼 수 있습니다. (우리 fluorimeter 들어,이 엑셀에 탭으로 구분 된 양식 가져 오기 텍스트와 같은 데이터의 수출이 필요합니다.) 각 교정 혼합물을 450 nm의 490 nm에서 형광의 비율을 계산하여 보정 곡선을 얻습니다. 형광 비율은 다음 보정 곡선을 얻을 수 산도 대 그려집니다.
12. 형광 비율을 실험 데이터를 변환하고 표준 곡선을 사용하여 pH를 계산합니다. 액포 pH는 다음 시간 (pH 변화의 역학)에 대한 플롯이나 다양한 조건 (그림 1)에서 또는 다른 돌연변이 균주에 비해 수 있습니다.

2. 효모 pHluorin을 사용하여 VIVO에서 세포질의 pH 측정

1. 표준 프로토콜에 의해 플라스미드 효모 pHluorin하여 원하는 효모 균주를 변환 및 보충 최소 배지 부족 우라실 (SC-우라실)에 형질 전환을위한 선택합니다.
2. 중반 로그 단계 (OD에 SC-유라의 변형 세포의 50 ML 액체 문화를 성장 _{600 = 0.8 이하).}
3. 액포 산도하지만, 세포질 pH 측정, 일반적으로 pH를 6-8 적합한 pH 범위에 버퍼에 설명 된대로 교정 표준을 준비합니다. 보정 버퍼 나누어지는 2 ㎖는 몇 15 ML 원뿔 튜브에 원하는 산도를 조정했습니다. (1.4) 위에서 설명한대로 모 넨신 및 nigericin를 추가하고 잘 섞는다.
4. 위에서 설명한대로 원심 분리하여 세포를 수확하고, 성장 배지 600 μL에 펠렛을 resuspend을. 30 초 동안 5,000 rpm으로 원심 분리하여 무게 microcentrifuge 관 및 펠렛 세포에 전송합니다. 다시 포도당 (SC-우라실, 포도당), 펠렛 세포없이 성장 매체 1 ML에서 펠렛을 resuspend을 반복하십시오. 최종 원심 분리 한 후, 같은 철저 가능한 상층 액을 제거하고 세포 펠렛을 무게. 아니 포도당과 SC-우라실 0.5 g / ML의 최종 농도로 세포를 resuspend을.
5. 보정 버퍼의 각 튜브에 세포 현탁액의 20 μl를 추가하고 와류 믹서에 잘 섞는다. 3 품다0 ° ~ 60 분 동안 회전하는 드럼 로터 C.
6. 파장 405 및 485 nm의 여기 및 508 ㎚의 발광 파장에 대한 fluorimeter을 설정합니다. BCECF 측정을 위해 위에서 설명한대로 하나의 시점이나 운동 측정 및 혈당의 추가로 진행합니다.
7. 보정 샘플의 형광을 측정하고 BCECF (1.10-1.11 참조)로 보정 곡선을 생성합니다. 형광 비율 대 산도의 줄거리는 대부분의 세포질 pH 측정 (pH가 6.0-8.0) ^9의 범위에서 선형이기 때문에, 실험 형광 비율 측정은 쉽게 산도로 변환됩니다.

결과

50 밀리미터 MES pH를 5로 버퍼링 된, 그림 1은 다양한 매체에서 자란 야생 형 효모 세포 (YEPD 효모 추출물 - 펩톤 - 덱스 트란)에서 얻은 액포의 pH 데이터를 제공합니다. 배지의 pH는 특히 최소 배지 하룻밤 성장하는 동안 매우 극적으로 변화 할 수 있기 때문에 우리는 종종 버퍼 매체에 세포를 성장하고, 우리는 성장 배지의 pH가 액포의 pH 응답하기 ^{3에 영향을} 미칠 수있는 것으로 ?...

토론

우리의 pH 항상성 측면의 숫자를 해결하기 위해이 프로토콜을 이용했다. 예를 들어, 우리는 ^4,5 야생 형과 V-ATPase의 결핍 돌연변이 세포의 세포질과 산도 반응을 비교했다. 우리는 또한 포도당 ³ 액포의 pH 응답에 변경된 성장 조건, 특히 세포 산도의 효과를 조사했다. 중요한 것은, 우리가 관찰 응답은 양적 pH 측정의 다른 방법과와 양성자 펌프의 변경된 활동을 설명하는 생화 학적 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Spectrofluorometer	Horiba Jobin Yvon	Model Fluoromax-4	Temperature control and stirring capability are desirable.
BCECF-AM	Invitrogen/Molecular Probes	B1150	Prepare a 12 mM stock in dry DMSO, store as aliquots at -20 °C
monensin	Sigma	M5273	Toxic.
nigericin	Sigma	N7143	Toxic.
MES	Sigma	M8250