압력 Myography를 사용 쥐과 저항 동맥의 기능을 평가

요약

압력 myography에서 혈관의 손상 작은 세그먼트는 두 개의 작은 캐 뉼러에 장착하고 적절한 내강 압력으로 가압. 여기, 우리는 마우스 3의 혈관 이완 반응을 측정하는 방법을 설명 ^{회 주문 장간막 동맥 _{1 - / -}} 압력 myography를 사용하여 마우스.

초록

압력 myograph 시스템은 작은 동맥의 기능 평가에 절묘하게 유용에 적합한 전층 압력으로 가압. 압력 myography에서 달성 근처 생리적 조건은 혈관 침대의 생체 내 행동을 추정 할 수있는 약물 및 생리적 자극에 고유 반응의 심도 특성을 허용합니다. 압력 myograph은 기존의 와이어 myographs에 비해 여러 가지 장점이 있습니다. 예를 들어, 작은 저항 혈관 엄격하게 제어 및 생리학 관련 강내 압력에서 공부하실 수 있습니다. 여기, 우리는 아세틸 콜린에 대한 응답으로 혈관 이완에 페닐와 preconstricted ³ 차 ^주문 장간막 동맥 (긴 3-4밀리미터)의 기능을 공부합니다. 장간막 동맥은 60 mmHg로 일정한 압력으로 유지되는 압력 및 봉인 시스템에 연결된 두 개의 캐 뉼러에 장착되어 있습니다. 혈관의 루멘 및 외경 continuou 있습니다교활한는 각각 페닐 아세틸 콜린 님의 질문에 답변 혈관 수축과 혈관 이완의 실시간 정량을 허용 비디오 카메라를 사용하여 촬영.

심혈관 질환의 원인을 연구하는 압력 myography의 적용을 설명하기 위해, 우리는 전신 고혈압의 쥐 모델에서 내피 세포 의존적 혈관 기능을 평가 하였다. 수용성 구아닐산의 cyclase의 ^{(- / -} sGCα _1)의 α ₁ 소단위의 결핍 생쥐 때 129S6 (S6) 배경 (sGCα ₁ ^-/-S6)에 고혈압하지만하지 않는 경우 C57BL / 6 (B6) 배경 (sGCα에 ₁ ^-/-B6). 압력 myography를 사용하여, 우리는 보여 저해하는 내피 세포 의존적 혈관 이완에 sGCα ₁ 결핍이 발생합니다. 혈관 장애는 sGCα _1보다 sGCα ₁ ^-/-S6에서 더 뚜렷하다 ^-/-B6 마우스, 가능성 contributisGCα ₁ ^-/-B6 마우스에 비해 sGCα ₁ ^-/-S6의 높은 혈압 NG.

압력 myography 그로 인하여 심혈관 질환을 기본 메커니즘에 대한 우리의 통찰력을 보강, 혈관 수축과 이완에 다양한 자극의 효과를 평가하는 데 사용할 수있는 비교적 간단하지만, 민감하고 기작 유용한 기술이다.

서문

압력 myograph 시스템은 작은 동맥, 정맥 등 혈관의 생리적 기능과 특성을 측정하는 데 사용됩니다. 동맥이나 정맥의 손상 작은 세그먼트는 두 개의 작은 유리 캐 뉼러에 장착하고 용기 생체 특성 (그림 1과 2)에있는 그것의 대부분을 유지할 수 있도록 적절한 내강의 압력으로 가압된다. 압력 myograph에 가까운 생리적 조건은 고립 된 혈관의 고유 특성 (예를 들어, 근원 성 톤)의 조사를 허용, 혈관 침대의 생체 내 행동을 반영합니다. 근육 수축은 힘 센서 ^1에 직접 기계적 커플 링에 의해 평가되는 와이어 myography, 이상 압력 myography의 장점 중 일부는 반면, 혈관 시스템 개발의 전체 저항을 정의하는 마이크로 저항 동맥, 공부 할 수있는 (I) 포함 와이어 myograph 더 큰 도관 동맥, (ⅱ) t로 제한됩니다더 와이어 (ⅲ) 선박의 자연 형태가 잘 유지되는, 혈관 내강을 통과 할 필요가 없기 때문에 내피 세포를 손상하는 모자의 위험이 감소되고, (IV)는 용기 치수는 폭 넓은 범위에서 공부하실 수 있습니다 압력이나 전단 응력 ^2.

마이크로 혈관을 공부하는 것은 고혈압과 같은 심혈관 질환의 변형 된 혈관 톤에 기여하는 병태 생리 및 분자 메커니즘을 이해하는 데 도움이 큰 도관 동맥을 공부하는 것보다 더 많은 정보가 될 수 있습니다. 예를 들어, 8 주 동안 쥐에게 고지방식이를 공급과 관련된 내피 세포 기능의 손상이 있지만 대동맥 고리에 2 ^차 주문 장간막 동맥 ³ (그림 3)에서 설명 될 수있다. 압력 myography의 또 다른 장점은 가압 용기의 본질적인 근원 성 수축이 있는지, 그리고이 현상의 내피 세포의 역할과 기능을 연구 할 수있다. 여기, 우리는 DESCR장애인 산화 질소 (NO) cGMP의 신호의 설정에서 마우스 장간막 ³ 차 ^주문 저항 동맥의 혈관 반응성을 연구하는 압력 myograph의 사용을 IBE.

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프로토콜

1. 용액의 조제

1. 500X EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 재고 : 500 MG EDTA-나 ₂ • 2H ₂ O의 무게를 50 ML 탈 이온수에 용해. 상온에서 보관하십시오.
2. KCl을이 솔루션을 탈분극.
   1. 3.69 g의 NaCl, 18.64 g KCl을, 0.36 g _황산 마그네슘 무수, 0.41 g KH ₂ PO _4, 0.46 g 염화칼슘 ₂ • 2H ₂ O : K10X 재고 솔루션을 준비합니다 250 ML 탈 이온수에 용해. 상온에서 보관하십시오.
   2. 100 ML 최종 KCl을이 솔루션 1X를 탈분극의 경우 : 0.21 _NaHCO3를, 90 ML 탈 이온수에 0.18 g의 포도당을 녹여. K10X 원액 10 ㎖를 추가합니다. 500X EDTA 용액 95 μl를 추가합니다. 잘 섞는다. 4 ° C.에 저장 일주일 이내에 사용하십시오.
3. 실험의 날 (1 리터) 신선한 HEPES-PSS 솔루션을 준비합니다.
   1. 6.96 g의 NaCl, 0.35 g KCl을, 0.288 g _황산 마그네슘 • 7H ₂ O, 0.1605 g KH ₂ PO _4, 2.38 g의 HEPES. 100 ㎖에 용해탈 이온수. 플라스크 A.로 표시
   2. 0.312 g 염화칼슘 ₂ • 2H ₂ O 100 ML 탈 이온수에 용해. 플라스크 B.로 표시
   3. 1.25 g _NaHCO3를, 0.991 g 포도당. 98 ML 탈 이온수에 용해. 플라스크 C.로 표시
4. 플라스크 C.이 큰 플라스크에 700 ML 탈 이온수을 가지고있는 500X EDTA 2 ㎖를 추가합니다. 연속 소용돌이로 교반 큰 플라스크에 플라스크 A, B 및 C의 내용을 붓는다. 수산화 나트륨과 7.4 산도를 조정합니다.

2. 약물 사용

1. 페닐 (10 ^-2 M) 10 ㎖ 탈 이온수 20.37 밀리그램을 녹인다. -80에서 나누어지는 1 ML 및 저장 ° C. 직렬 실험의 날에 10 ^-3, 10 ^-4, 10 ^-5, 10 ^-6 몰 / L를 얻기 위해 희석.
2. 아세틸 콜린 (10 ^-2 M) 10 ㎖ 탈 이온수 18.17 밀리그램을 녹인다. -80에서 나누어지는 1 ML 및 저장 ° C. 직렬 10 ^-3, 10 ^-4, 10 ^-5, 10 ^-6을 얻기 위해 희석몰 / 실험의 날에 L.

3. 마우스

남성 WT와 sGCα ₁ ^{- / -} S6와 B6 배경에 마우스는이 연구를 통해 조사 하였다. sGCα ₁ ^{- / -} 기술 이전에 ^4,5로 생성되었다. 주택과 실험 동물 (쥐)와 관련된 절차는 매사 추세 츠 종합 병원, 보스톤, MA의 연구 동물 관리에 분과위원회에 의해 승인되었습니다.

4. 장간막 동맥의 혈관 반응성의 측정

1. 와 쥐를 안락사 펜 토바 비탈 (200 ㎎ / kg, IP). 복강을 열고 장간막 조직을 해부. 분리 및 결합과 지방 조직의 무료 ³ 차 주문 장간막 동맥을 해부하고 얼음처럼 차가운에 HEPES-PSS 95 % O ₂ / 5 %, 15 분 CO _2와 사전 평형 솔루션입니다. 동맥 배치 아니 장간막에서 분기 2 ~ 3 mm 길이의 고리를 잘라동맥. 혈관에는 혈액이 없을 때 마이크로 배 수준에서 동맥과 정맥을 구별하는 것은 문제가있다. 그것을 밖으로 해부하기 전에 여전히 동물에 그대로있는 동안 따라서, 우리는 용기를 식별하는 것이 좋습니다.
2. 입구와 출구 밸브를 통해 10 ML의 주사기의 도움으로 HEPES-PSS 용액을 압력 myograph 챔버 (DMT 모델 110P & 11P 버전 1.31, 그림 2)의 유리 캐 뉼러를 입력합니다. 과도한 압력이 캐 뉼러에 연결된 깨지기 쉬운 센서를 손상시킬 수 있으므로 정맥 충만 부드럽게하고 신중하게 수행해야합니다. 작성 후 캐 뉼러 단단히 입구와 출구 밸브를 모두 닫습니다.
3. 오른쪽 정맥 위에 용기의 한쪽 끝을 탑재하고주의 깊게 나일론 봉합사의 한 미세 가닥을 묶어. 주사기의 도움으로, 세척 및 흡입 밸브를 통해 HEPES 용액을 용기에 채우십시오. 가까운 용기에 왼쪽 정맥에 가져와 그것에 용기의 다른 쪽 끝을 마운트합니다. 나일론 봉합사로 묶어. 채우기챔버까지 HEPES 용액을 10 ㎖로와. 조심스럽게 주사기의 도움으로 유입 밸브를 통해 HEPES 용액을 눌러 누출을 확인합니다.
4. myograph에와 비디오 카메라에 따라 챔버를 설치합니다. 챔버에서 산소와 열 (37 ° C)를 시작합니다. 밸브가 닫혀있을 때, 첫 번째 HEPES 솔루션 저수지 튜브 P1과 급수 밸브를 연결합니다. 관에는 거품이 없어 질 때까지 튜브를 통해 모든 거품과 솔루션 패스를 할 수 있습니다. 밸브를 엽니 다.
5. 관 P2 압력 레귤레이터 오는 챔버의 왼쪽 밸브를 연결합니다. 모든 거품을 다시 확인합니다. 전체 시스템의 모든 거품이나 누설이 없어야합니다.
6. 묘 인터페이스 패널이나 소프트웨어의 압력 메뉴로 이동 흐름을 돌리는 동안 펌프를 켭니다.
7. 프로그램을 열고 COLLECT을 클릭합니다. 용기는 이제 화면 (그림 3)에서 볼 수 있어야합니다. 배는 monitori을 허용 현미경에 장착 된 카메라로 시각화NG와 혈관 내강, 혈관의 직경 및 두께 분석.
8. 점차적으로 묘 인터페이스 패널이나 프로그램 P1 압력을 선택하여 P1 밸브를 통해 interluminal 압력을 높이는 다음과 같이 압력 값을 입력, 5 mmHg로 → 10 → 20 → 40 → 60 mmHg로. 장력을 조정하거나 수직 또는 세로 micropositioner (그림 2)의 도움으로 따라 변형, 배는 언젠가 비틀거나 압력이 증가하면서 나선상하는 경향이있다. 60 mmHg로에서 선박 평형을 37 ° C 45 분 이상. 평형 동안 예열 HEPES 한 번 목욕 솔루션을 변경합니다.
9. KCl을 탈분극 용액 10 mL를 적용, 완전히 평활근 세포를 탈분극 최대 수축을 달성하기 위해 목욕에, 37 ° C에서 prewarmed. 안정 수축 후 HEPES 용액 3 회 매 10 분에 목욕을 씻어.
10. 안정과 재생산에 의해 내피 세포의 혈관 및 무결성의 가능성을 확인페닐의 추가 (10 ^-5 M) 및 아세틸 콜린 ible 반응 (10 ^-5 M). HEPES 용액 10 분 간격으로 3 번 씻어.
11. (10 ^-5 M) 페닐 추가 선박을 preconstrict하고, 안정적인 수축을 얻을되었을 때, 아세틸 콜린의 증가 복용 ^(10-9, 3 × 10의 연속 추가로 누적 농도 혈관 확장 반응 곡선 (CRC)을 수행 ^{- 9,} 10 ^8, 3 × 10 ^-8, 10 ^7, 3 × 10 ^{-7, 10-6,} 3 × 10 ^-6, 10 ^-5 M). 마지막 투여 후, HEPES 용액으로 3 회 새로운 CRC를 시작하기 전에 매 10 분 헹구십시오.
12. 2 밀리미터 EGTA을 포함하는 ^{2 +} 무료 PSS에게 CA를 적용하여 수동 내강의 직경을 결정합니다. 모든 매개 변수를 계산하는 데 사용되는 각 용량 반응 (그림 4)에 대한 기록 트레이싱 측정 루멘 직경에서.
13. 퍼크로 모두 아세틸 콜린 이완 반응을 표현페닐의 preconstriction 후 내강 직경 entage 변화는 다음 방정식을 사용하여, 페닐 수축 후 칼슘이없는 직경 직경의 차이와 비교 :
14. 백분율 팽창 = 100 % X [(D _X - D _I) / (D _{캘리포니아 자유로운} - D _I)], D는 측정 된 루멘 지름 및 X, I, 그리고 캘리포니아 자유로운 작용제의 각 복용량 동맥 직경을 나타냅니다 (X), 초기 직경 다음은 (I) 수축 페닐 및 CA ^{2 +} 프리 버퍼 (CA-무료).

5. 통계 분석

모든 연속적인 측정은 평균 ± SEM을로 표현됩니다. 장간막 동맥 혈관 반응이 반복 - 조치 양방향 ANOVA로 분석된다. 모든 경우에, P는 <0.05를 통계적으로 유의 간주됩니다.

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결과

NO는 중앙 인간 ⁶ 및 동물 모델 ⁷ 모두에서 혈압 항상성 유지에 관여하지 않습니다. 혈관 평활근의 이완을 제어 할 수있는 능력이 용해 구아닐산 cyclase의 (SGC), cGMP의 ⁸ 생성 헴 함유 heterodimeric 효소에 의해 매개된다. 최근에는 혈압 - 수정 유전자 변형 인간 ⁹ 혈압 조절에 SGC의 관련성을 보여주는 sGCα ₁ sGCβ ₁ 유전자를 포함하는 현장에서 발견되었다. ?...

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토론

마우스는 부분 때문에함으로써 인간의 병태 생리에 대한 마우스 모델을 생성하는 유전자 변형을 소개 할 수있는 가능성, 많은 연구자에 대한 선택의 실험적인 모델입니다. 혈관 활성 작은 저항의 상태가 아니라 더 큰 도관 혈관은 주로 혈관 시스템 ^(11)을 통해 혈액의 흐름의 조절을 정의합니다. 같은 쥐 같은 작은 동물에 저항 동맥의 크기는 미세 혈관 기능을 연구하는 와이어 myograph의 사...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
NaCl	Fisher Scientific	BP358
CaCl2 (2H2O)	Fisher Scientific	C79-500
KCl	Sigma	P9333
MgSO4	Fisher Scientific	M65-500
KH2PO4	Sigma	P3786
NaHCO3	Fisher Scientific	BP328
NaOH	Fisher Scientific	S318
D-Glucose	Sigma	G8270
EDTA	Fisher Scientific	BP121
HEPES	Sigma	H3375
Phenylephrine	Acros Organics	AC20724
Acetylcholine	Sigma	A6625
Pressure Myograph System	DMT