Photothrombotic 국소 빈혈 : 마우스 스트로크 연구를위한 최소 침습 및 재현성 광화학 대뇌 피질의 병변 모델

요약

Photothrombosis 매우 재현성 방식으로 관심 분야의 작은 잘 구분 경색을 유도하기위한 빠르고, 최소 침습 기술입니다. 그것은 형질 전환 생쥐에서 뇌의 가소성을 기본 세포 및 분자 반응 연구를 위해 특히 적당하다.

초록

photothrombotic 치기 모델은 이전에 주입 빛에 민감한 염료의 사진 활성화의 수단으로 주어진 대뇌 피질의 영역 내에서 허혈성 손상을 유발하는 것을 목표로하고있다. 조명에 따라 염료 활성화 중항 산소를 생성합니다 후속 혈소판 응집 결국 국부적으로 혈액 흐름의 중단을 결정 혈전 형성과 혈관 내피 세포막의 손상 구성 요소. 처음 1977 년 로젠 엘 - Sabban에 의해 제안 된이 방법은 나중에 쥐의 뇌에서 1985 년에 왓슨 향상과 현재 모델의 기초를 설정했습니다. 또한, 유전자 변형 마우스 라인의 증가 여부는 더 photothrombosis 모델에 대한 관심을 높이기 위해 기여했다. 간단히, 감광성 염료 (로즈 벵골) 복강 내 주입하고 혈류를 입력합니다. 차가운 광원에 의해 조명 될 때, 염료 활성화되고 지역의 결과, 혈소판 활성화 및 혈전증과 혈관 손상을 유발혈액의 흐름이 중단. 광원 재현하고 비 침습적 방법으로 관심의 대뇌 피질의 지역을 대상으로 할 수 있습니다 개두술의 필요없이 그대로 두개골에 적용 할 수 있습니다. 마우스는 다음 봉합하고 일어나 허용됩니다. 허혈성 손상의 평가는 신속 페닐-tetrazolium 염화물 또는 크레 실 바이올렛 염색을 수행 할 수 있습니다. 이 기술은 정확한 세포의 특성이나 기능 연구에 매우 유리하다 작은 크기와 잘 구분 된 경계의 경색을 생산하고 있습니다. 또한, 형질 전환 생쥐에서 뇌의 가소성을 기본 세포 및 분자 반응 연구를 위해 특히 적당하다.

서문

21 세기의 시작 부분에서, 허혈성 뇌졸중은 장기 장애 ¹ 스트로크 ²⁰⁰⁴ 약 5.7 백만 명의 사망자를 차지하고있는 사망률 전세계의 두 번째 원인의 두 번째 원인을 나타내는 치명적인 질환이다. 에 배치 된 수많은 노력에도 불구하고, 뇌졸중 후 기능 회복을 개선 할 수있는 효과적인 치료는 아직 없습니다. 그들은 허혈성 손상의 병태 생리의 모델링을 허용하고 생체 내에서 서로 다른 신경 전략의 효능을 테스트 할 뇌졸중의 동물 모델은 널리 뇌졸중 연구 분야에 사용됩니다. 이러한 모델의 대부분은 다른 모델은 일반적으로 특정 영역, 모터 및 체성 감각 피질에 작은 크기의 병변을 연구하기 위해 개발 된 반면, 중간 대뇌 동맥 내 (일시적 또는 영구적) 혈액의 흐름을 방해하여 광범위한 경색을 유도하는 것을 목표로하고 있습니다. 그러나 여러 가지 요인 교류를 생성하기 위해 기여할 수사용하는 마우스 변형 등의 실험 뇌졸중 연구의 변화의 ertain 정도, 위의 모든 연령과 성별 연구에 포함 된 동물과, 기술은 허혈성 손상을 유도하기 위해 채택했다. 후자 점, 수술 기간 및 침입 (즉, 개두술에 대한 필요성)뿐만 아니라 안정적으로 허혈성 병변을 유발하는 운영자에게 필요한 수술 기술과 관련하여 매우 중요 결정 요소 성공과 생체 뇌졸중 연구에서 공정한 .

photothrombosis의 개념은 처음 1977 ³ 로젠 엘 - Sabban에 의해 제안 왓슨 등으로 쥐의 뇌에서의 응용 프로그램에 의해 유명하게되었습니다 1985 ⁴ 기술은 크게 향상 현재 모델 ^3의 기준을 설정되었던되었다. ^{- 6.} photothrombotic 방법은 이전에 혈액 계, 어에 전달 빛에 민감한 염료의 사진 활성화를 통해 대뇌 피질의 경색을 유도하는 것을 목표로무형 문화 유산은 빛에 노출 된 지역에있는 지방 혈관 혈전증의 결과. 순환 염료는 형광 근원하여 적절한 파장 조명되면 결과적으로 반응성이 매우 높은 중항 산소 제품의 많은 양의를 생성하는 산소 분자에 에너지를 해제합니다. 이러한 산소 중간체, 내피 세포막의 과산화를 유도 혈소판 부착 및 응집을 선도하고, 결국 지역의 대뇌 흐름은 중단 ^7을 결정하는 혈전의 형성.

Photothrombosis는 일반적으로 인간의 뇌졸중 발생하지만 빛에 노출 영역에 혈액 흐름을 선택적으로 차단 결과적으로 더 많은 표면 혈관에 병변을 유도로 하나 동맥 폐색이나 휴식하지 않는 비정규 허혈성 모델입니다. 이러한 이유로,이 방법은 대뇌 피질의 가소성의 세포 및 분자 연구에 적합 할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 실행의 단순성에 있습니다.를 제거하기 위하여 2 분, 두피를 면도하는 1 분; 정위 장치에 동물을 배치하는 3 ~ 5 분 또한, photothrombosis 쉽게 이십 분 대기 (마취 3 분을 포함한 동물 당 약 사십분에서 수행 할 수 소독액과 두피는 절개하고 두개골을 청소; 2 ~ 4 분 형광 섬유 배치, 장미 벵골 솔루션을 주입하는 1 분, 복강 내 확산 5 분 - 대기, 조명의 15 분, 5 분에 상처를 청소하고) 동물을 봉합. 또한, 어떤 수술 전문 지식 병변이 그대로 두개골의 간단한 조명을 통해 유도되는이 기술을 수행 할 필요가 없습니다. 고전적인 동맥 폐색과는 달리,이 메소드는 조사 영역 내 pial과 intraparenchymal 미세 혈관을 선택적으로 폐색을 결정하고 어떤 담보 용기가 대상 영역에 산소를 공급하는 남아 있지되는 병변 중 변동성을 줄일 수 있습니다.

그 특정 자연에도 불구하고photothrombotic 손상의 주가는 필수 메커니즘은 뇌의 뇌졸중 발생. 마찬가지로 인간의 뇌졸중 동맥 폐색, 혈소판 응집 및 혈전 형성 조사 면적 ⁷ 혈액 흐름의 중단을 결정합니다. 마찬가지로,이 모델은 중간 대뇌 동맥 폐색 ^8에서와 같이 중요한 염증 반응을 공유합니다. 그러나, 잘 delimitated 경계 부분적으로 보존 신진 대사의 영역에 해당하는 penumbral 영역, photothrombotic 병변 후 매우 감소 또는 inexistent입니다. 이 명확한 경계선은 허혈성 또는 그대로 대뇌 피질의 영역 내에서 세포 반응의 연구를 촉진 할 수있다. Photothrombosis 마우스 모델은 형질 전환 동물의 다양한 행정 연구에 특히 적합합니다. 실제로 고전적인 모델은 마우스 변형 바이어스 ⁹ 일으킬 수있는 높은 사망률 비율을보고 C57BL / 6의 모든 긴장과 오랜 기간 연구에 맞지 않을 수 있습니다.

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프로토콜

1. 미리 수술

1. 1.5 ML 튜브에 로즈 벵골 무게 15 MG / ML의 최종 농도에 도달 할 때까지 멸균 생리 식염수에 용해. 0.2 μm의 필터를 통해 소독을 필터링하고 최대 2 개월 상온에서 어둠에 저장합니다.
2. 고압 증기 멸균하여 모든 수술기구를 소독. 외과 영역 수술을 시작하기 전에 한 시간 미만을 소독해야한다.
3. 주입되는 로즈 벵골의 복용량을 조정하려면 마우스 체중을 기록합니다. 우리는 현재 프로토콜 12 주 오래 된 여성 CD1 생쥐의 10 μL / g의 동물 무게를 주입했다. 로즈 벵골의 양을 원하는 대뇌 피질의 병변의 크기는 쉽게 다른 복용량 (일반적으로 2 μL / g, 5 μL / g 또는 10 G / μL 체중) 테스트하여 예비 실험을 별도의 세트에서 확인할 수 생산하는 데 필요한. 주입되는 로즈 벵골의 양, 광원의 특히 유형 실험 조건에 따라 크게 달라집니다사용 및 빛의 노출의 기간. 본 연구에서는 10 g / μL (150 ㎍ / g) 용량이 다른 그룹이보고 된 반면, 15 분 동안 빛에 노출에 photothrombosis을 유도 할 필요가 발견되었다 50 ㎍ / g ^6,8 및 100 ㎍ / g 이하도 ¹⁰ 복강 내 주입 photothrombotic 병변을 유도하기에 충분했다.

2. 마취 절차

1. 50 % 투명 유도 챔버 (유도 3.5-4 %, 유지 1.5 %) (v / v)의 oxygen/50 % (v / v)의 일산화이 질소 가스 혼합물에서 isoflurane을 가진 생쥐를 마취. 가스 마취 동물의 빠른 웨이크을 허용하고 마취 가스의 레벨을 쉽게 조절할 수 있습니다. 또는, 마우스는 케타민을 - xylazine 혼합하여 마취를 할 수 있습니다.
2. 깊은 마취에 도달하면, 얼굴에 마스크를 사용하여 마취를 유도 챔버에서 마취 동물을 제거 정위 프레임에 배치하고 유지합니다. isoflura를 조정네브래스카 선량 적절한 마취 수준을 달성 할 수 있습니다. 절차 전반에 걸쳐 호흡 속도를 모니터링하고 (40 - 분당 60 호흡) 상수 있는지 확인합니다.
3. 동물이 깊은 마취인지 확인하기 위해 발가락 핀치를 사용합니다.
4. 건조에서 눈을 방지하기 위해 눈 연고를 적용합니다.
5. 조심스럽게 수술을 통해 온도를 모니터링하기 위해 직장 프로브를 삽입합니다. ± 0.5 ° C. 37에서 마우스의 체온을 유지하기 위해 관련 피드백 제어 가열 패드를 설정

3. 대상 영역의 조명 수술

1. 전기 면도기와 마우스 두피를 면도.
2. 단단히 머리를 보호하고 외부 도관에 귀 막대를 삽입합니다. 손상 고막을하지 않도록주의해야합니다.
3. 면봉을 사용하여 70 % 에탄올과 베타 딘의 와이프를 번갈아 표면에 피부를 소독.
4. 아이 르에서 정중선을 따라 절개를 만들기 위해 메스를 사용하여목 아래 VEL. 두개골 노출 유지하기 위해 피부 견인기를 적용합니다.
5. 부드럽게 메스와 두개골의 가장자리에 periostium을 철회하고 두개골 표면이 멸균 면봉을 사용하여 건조 할 수 있습니다. 브레 그마 및 람다를 식별합니다. 기준점으로 브레 그마에 유리 마이크로 피펫을 꽂은 후, 관심 영역의 좌표로 이동합니다. 이 문서에 대해 선택한 관심 영역은 대략 둥글게 모양입니다 브레 그마에 가로 약 2mm를 중심으로, 그리고 프랭클린 마우스 뇌 아틀라스에 따라 감각 피질의 많은 부분을 포함하고 약 30 mm ^2의 지역을 커버 팍시 노스 ^11.
6. 참조 점으로 그 위치를 표시하고 빛의 산란을 방지하지만 압력을 발휘하지 관심을 지불 두개골 표면과 밀착 광섬유를 넣어. 조명 영역은 광섬유 GUI의 끝에 작은 구멍이나 모자와 두개골에 마스크를 적용하여 제한 할 수 있습니다드.

4. 로즈 벵골 주입 및 활성화

1. 1 ML의 주사기에 로즈 벵골 솔루션을로드하고 체중의 10 μL / g의 용량에 따라 주입되는 양을 계산합니다.
2. 느린 복강 주사로 이동합니다.
3. 염료 확산시켜 혈류를 입력합니다. 5 분 후 형광 조명을 켭니다. 빛의 다른 소스에 의해 동물의 조명을 피하십시오. 우리는 150 W 강도 광섬유 조명을 사용했다.
4. 조명의 15 분 후, 빛의 노출을 중지하고 상처를 봉합. 조명의 5 분은 이미 경색을 생산하고 10 분 최대 효과 ^12를 얻을 가능성이 충분하다. 가변성을 최소화하기 위해, 우리는 15 분 동안 조명을 선택합니다.

5. 봉합

1. 피부 견인기를 제거하고 탈수를 방지하기 위해 멸균 생리 식염수를 적용합니다.
2. 반대로 절단 needl를 사용하여 상처를 닫습니다전자 및 실크 또는 나일론 봉합 실.
3. 완전히 깨어 때까지 마취 전달을 방해,주의 깊게 정위 장치에서 마우스를 제거하고 미리 예열 가열 패드에 넣어, 다음의 케이지로 돌아갑니다. 체온 경색 확장에 다양성을 제한하는 절차를 통해주의 깊게 모니터링해야합니다. 농도와 투여 경로에 따라, 벵골은 여전히 주사 ¹³ 후 몇 시간 동안 혈류에서 발견 할 수있는 로즈. 잠재적 인 이차 손상 (로즈 벵골 흡수 파장 녹색 스펙트럼에있는)을 방지하기 위해 온난화 램프로 가열 담요를 선호합니다.

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결과

이 프로토콜은 이미 육안 (그림 1A-1C)의 피질의 절개시 볼 수있는 대뇌 피질의 병변을 생성합니다. photothrombotic 병변 조직 로즈 벵골의 사진 정품 인증을 허용하도록 충분히 반투명하는 표면과 깊은 대뇌 피질의 레이어를 개발하고 있습니다. 뇌경색의 정도의 측정은 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)에 고정 후 새로운 조직 또는 크레 실 바이올렛으로 페닐-tetrazolium 염화물 (TTC)와 조직 학적 ?...

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토론

수정 및 대체

때문에 562 nm에서의 흡수 피크, 필터링 된 크세논 아크 램프에서 녹색 빛 레이저는 원래 감광성 로즈 벵골 조사하기 위해 선택되었다. 레이저 매개 여기가 여전히 recently5를 사용했지만, 그것은 또한 염료 여기 ^10,15을 보장하는 형광 램프로 교체 할 수 있습니다. 형광 광섬유 레이저 소스보다 조작하기 쉽고 저렴합니다. 그러나 레이저는 일반적으로 선박 별 ...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Solutions and chemicals
Rose Bengal	Sigma, Italy	330000
Isoflurane Vet	Merial	103120022
Betadine	Asta Medica
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
Surgical material and equipment
Fluosorber Filter	Havard apparatus	340415
150W fiber optic illuminator	Photonic	PL3000
Temperature Controller for Plate TCAT-2DF	Havard apparatus	727561
Stereotaxic Instrument	Stoelting	51950
Operating microscope	Takagi	OM8
Heating pad
Oxygen and nitrogen gas
Surgery Tools	World precision instrument		Optic fiber taps and mask are custom-made