마우스 췌장 섬의 분리 및 세포 내 cAMP를 결정하는 방법

요약

랑게르한스의 고립 된 마우스 독도를 이용하여 체외 β-세포 기능을 시금 당뇨병의 병태 생리 및 치료의 연구에 중요한 구성 요소입니다. 많은 다운 스트림 응용 프로그램을 사용할 수 있지만,이 프로토콜은 특히 β-세포의 기능을 결정하는 중요한 매개 변수로 세포 내 순환 아데노신 monophosphate (캠프)의 측정에 대해 설명합니다.

초록

조절되지 않는 혈당은 당뇨병의 특징이며, 신경 병증, 신장 병증, 망막 병증과 같은 합병증을 촉진합니다. 당뇨병, 면역 매개 형 1과 비만 연결된 제 2 형 모두, 당뇨병의 병태 생리 및 치료 메커니즘을 서술하기위한 연구의 증가 유행으로 매우 중요하다. 췌장의 랑게르한스 섬의 β-세포가 적절하게 혈중 포도당 농도에 반응하여 인슐린을 분비하는 책임이 있습니다. 포도당 및 다른 영양소는, β-세포가 특정 호르몬에 의해 자극 또한, 세포 내 환상 아데노신 모노 포스페이트의 생산을 증가 β-세포 수용체의 식사 행동에 대한 응답으로 창자에서 분비되는 인크 레틴을, (라고 캠프). 감소 β-세포 기능, 대용량 및 인크 레틴 응답은 2 형 당뇨병의 병태 생리에 기여하는 잘 이해하고, 또한 점점 위스콘신 연결되고있다일 1 형 당뇨병. 본 마우스 섬 격리 및 캠프 결정 프로토콜은 질병의 진행 및 치료 적 개입, 세포 내 cAMP의 생산의 조절을 통해 행동 수용체를 인크 레틴 수용체에 의해 매개 또는 관련되는 특히 증진 메커니즘을 묘사하는 데 도움이 도구가 될 수 있습니다. 전용의 cAMP 측정이 설명 될 것이지만, 기술 된 아일렛 분리 프로토콜은 포도당, 인슐린 분비, [3 ^H] - 티미 딘 혼입 단백질 풍부하고, mRNA 발현을 자극 포함한 다른 많은 다운 스트림 애플리케이션을 허용 깨끗한 제제를 생성한다.

서문

euglycemia의 엄격한 관리는 조절되지 않는 제 1 형과 제 2 형 당뇨병 ^1의 병리의 모든 특징입니다과 같은 신경 병증, 신장 병증, 망막 병증과 같은 합병증을 방지하기 위해 필수적입니다. 제 1 형 및 2 형 당뇨병을 모두 감소 β-세포 기능 및 질량은 혈당 ^{농도를 2} 교란. 인슐린을 생산하는 β-세포, 손상된 β-세포의 인슐린 분비 및 형식 주변 인슐린 신호 2 형 당뇨병의 엄청난 손실 면역 매개 성 제 1 형 당뇨병의 결과를 함께 고혈당, 이상 지질 혈증, 결국 결과 증가 간 포도당 생산을 촉진하는 반면 각각의 β-세포 ³ β-세포 질량과 인슐린 분비 능력의 상실. 모두 제 1 형 및 2 형 당뇨병의 진행에 기본 β-세포의 메커니즘을 이해하는 것은 희망이 질병을 예방하고 치료하는 새로운 치료로 상승을 줄 것이다.

체외 TI의그러한 INS-1과 같은 MIN6 ssue 배양 모델은, β-세포 라인을 불멸화 특정 β-세포의 기능을 이해하는데 유용한 도구가 될 수있다. 그러나, 베이 내의 상이한 세포 유형 간의 상호 작용 자체는 β-세포의 기능을 조절할 수있다. 예를 들어, 글루카곤의 주변 분비 영향 (α-세포에서 방출)과 인슐린 분비를 증가 및 감소에 소마토스타틴은 (δ-세포에서 방출), 각각 내분비 응답 ⁴ 셀 전지 근접의 중요성을 보여줍니다. 또한, β-세포 사이의 간극 결합 인슐린 ^5의 출시를 주다. 진보는 더 나은 포도당 고립 된 섬의 생리적 반응을 복제 인슐린 라인을 생성하는되었습니다 있지만 또한, (예를 들어, INS-1 유래 13분의 832 및 3분의 832 세포주), 자신의 포도당 응답은 여전히 정상 쥐와 다르다 ^6,7 섬. 또한, 이들 클론 인슐린 종 세포주 응답글루카곤 유사 펩타이드 -1 (GLP-1)의 효능을 서로 극적 다를뿐만 아니라, 통상의 아일렛 ^{6 개있다.} 따라서, 불후의 세포 라인 에이전트에게 캠프의 생산에 영향을 미치는 시금에 가장 적합한 모델을 대표하지 않을 수 있습니다.

인슐린 유래 세포 라인과는 대조적으로, 전체 동물 모델에서 유일하게 β-세포의 기능을 연구하는 것은 합병증의 자신의 세트를 제공합니다. 내분비 조직 작업에서 가장 큰 과제 중 하나는 방출 호르몬의 정확한 농도를 측정한다. 구체적으로, 간은 인슐린 대사에 중요한 역할을하고, 췌장의 혈류가 간으로 직접 진행한다. 따라서, 혈장 인슐린 둘레 정확하게 췌장 자체 또는 인슐린 분비 ^(8)의 속도에 다른 처리의 영향에서 분비되는 인슐린의 양을 묘사 할 수 없습니다. 또한, 글루카곤의 신 대사는 섬의 α-세포에서 글루카곤 ⁹ 출력의 신뢰성을 제한 할 수 있습니다. 따라서, 생체 외 실험에 대한 기본 마우스 섬을 분리하는 것은 섬이 생체 내에서 만들어 측정을 보완하기 위해 특정 자극에 응답하는 방식에 대한 정확한 이해를 제공합니다.

마우스 섬의 분리를위한 의정서는 (성공을 증가하는 데 도움이 될 수 있습니다 약간의 수정) 그룹의 수 ^{(10, 11)에} 의해 사용되는 잘 확립 된 프로토콜입니다. 또한, cAMP의 생산의 결정은 β-세포의 인크 레틴 반응성 직접 판독을 허용한다. 캠프 측정, 단백질 함량 및 인슐린 분비와 함께 또한 β-세포 기능에 결함이 캠프 ¹⁰ 근위부 또는 원위부 놓여 있는지 여부를 확인하는 데 도움이 같은 캠프 샘플 준비에서 정량화 할 수있다. 이 프로토콜의 마지막 캠프의 내용과 인슐린 분비 응용 프로그램이 다른 가운데, 제약 및식이 성분의 영향을 이해하기위한 매우 강력한 도구가 될 수 있습니다의, 캠프 및 인슐린 분비에. 단독 포도당의 자극 이외에, 다른 화합물이 캠프 및 인슐린 분비 ^10,11 변화를 측정하는데 사용될 수있다.

인슐린은 우리가 절연 아일렛 같은 글루카곤 및 소마토스타틴 같은 다른 호르몬,뿐만 아니라 사이토 카인, 에이코 사 노이드, 및 사이 클릭 아데노신 모노 포스페이트 것으로 분석 차 호르몬이지만 마지막으로, 또한 과도 자극 분석 또는 정량함으로써 역시 측정 할 수있다 문화 매체 ^(12)에서 자신의 수준. 마지막으로, 다른 많은 다운 스트림 애플리케이션 등 섬 이식, PCR이나 마이크로 어레이 분석 정량 실시간에 대한 RNA 분리, 단백질로, 추구 할 수 있도록 외부에서이 원고의 범위, 기술 콜라게나 분리 방법 섬 격리 섬 보존 할 수 있지만, 웨스턴 블로 팅, 섬 매립 및 면역 형광 이미징 및 섬 세포 repli의 척도로서 [3H] - 티미 딘 설립을위한 격리이전 조브 기사 ^13-16에서 설명 된 일부 양이온. 전반적으로, 프로토콜에 설명 된 섬 격리 절차에 따라 치료법을 개발 및 β-세포의 기능을 강화하기위한 신약 개발을 촉진하기위한 중요하고 유용한 정보를 연구자를 제공 할 수 있습니다.

프로토콜

모든 동물 실험은 모든 관련 지침, 규정 및 규제 기관 준수에 실행되었다. 설명하는 프로토콜은 위스콘신 - 매디슨 대학의 기관 동물 케어 및 사용위원회 (IACUC)의지도와 승인에 따라 실시 하였다.

솔루션 1. 준비

1. 이 프로토콜에있는 안락사의 방법은 (토론 참조 대안의 검토를 위해) 에버 틴 마취에서 일어난 과다 출혈입니다. 에버 틴을하려면 20 ~ 30 분 동안 37 ° C에서 15 ML 원뿔 관과 열에서 2 - 메틸 -2 - 부탄올 1.25 ml로 2-2-2의 tribromoethanol의 0.625 g (1.25 % 또는 44.2 mm)를 추가합니다. 완전히 2-2-2 tribromoethanol을 용해 한 번에 10 ~ 15 초 동안 높은에 솔루션을 소용돌이. 일단 완전히 용해, 원뿔 곡선 (이차 곡선) 50 ㎖ 포장, 새로운 50 ML 원뿔 튜브에 0.45 μm의 필터를 통해 필터를 두 번 증류 된 H ₂ O의 48.75 ml로 솔루션을 추가최대 1 개월 4 ° C에서 알루미늄 호일 및 저장에 알 관. 마우스를 주입하기 전에 RT에 튜브를 가져와.
2. , 행크스 '밸런스드 소금 솔루션 (HBSS)을 만들어 두 번 증류 된 H ₂ O의 10 배 주식 (기브, 생활 기술, 칼스 배드, CA)에서 1 L 1X HBSS를 구성, 0.35 g (4.2 ㎜) 나쵸 _3, 저장소를 추가하려면 최대 1 달 동안 4 ° C에서. 각 마우스의 경우,이 솔루션 (플러스 오류를 피펫 팅을위한 추가 5 ~ 10 ㎖)을 105 ㎖의 작은 섬 격리를 위해 필요합니다.
3. 독도는 저산소 손상에 매우 취약하다; 따라서 HBSS는 혈액에 O _2의 농도를 모방하기 위해 95 _%, O2 / 5 % CO _2로 버블 링된다. 특수 가스 혼합물은 구입하실 수 있습니다 및 버블 링 스테이션은 유연한 튜브에 부착 된 파스퇴르 피펫으로 설정합니다. 15 분 동안 95 _%, O2 / 5 % CO _2로 HBSS의 필요량을 버블 링 후 부피 0.02 % RIA 등급 BSA (소 혈청 알부민)를 추가하고, R 얼음에서 유지섬 격리의 emainder.
4. 피콜 준비를 들어, 400 ㎖의 비이커에 피콜의 32.5 g을 달아 HBSS 80 mL를 넣고 30 분간 500 ~ 700 rpm에서 교반. 일단 용해, 실린더를 졸업 한 250 ㎖의 피콜 용액을 넣어 25 % 피콜 솔루션을 만들 수있는 눈금 실린더에 130 ㎖의 표시로 HBSS를 추가합니다. 파라 필름 ® M (Pechiney 플라스틱 포장 회사, 시카고, IL)의 두 부분과 눈금 실린더의 상단을 커버하고 적극적으로 여러 번 흔들어.
5. 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 각각 23 %, 20.5 %, 그리고 11 % 피콜 용액 들어 24.6 27.6을 추가하고, 25 % 피콜 13.2 밀리리터. 그런 다음, HBSS 30 ML의 총에 각 솔루션을 가져다 섞어 잘 흔들어. 네 피콜 솔루션은 4 ° C에 저장하고 최대 2 주 동안 좋은되어야한다.
6. 활성 독도를 분리에 적합 콜라게나 솔루션은 클로스 트리 디움에서 고립 콜라에서 준비가되어 있습니다 histolytic음 (재료 표). 각 많은 효소의 효율에 대한 검사를해야합니다. 일반적으로 콜라게나 제는 HBSS의 ML 당 0.3 ~ 0.5 밀리그램에 사용됩니다. 그 범위 (일반적으로 3 가지 농도)에있는 효소의 농도를 활용, 연령 일치 마우스 또는 작업 효소의 농도를 설정하는 한배 새끼에서 고립 된 섬의 질과 양을 결정합니다.
7. 정확한 농도가 결정되면, 각 마우스는 전체 절연 프로토콜 HBSS에서 35 ㎖의 콜라게나 제를 필요로한다. 용해 HBSS에 콜라를 소용돌이 친다. 직전에 수술, 콜라게나 제 용액을 5 ㎖ 주사기를 사전로드에 캐 뉼러를 배치하고 공기 방울을 제거하고, 필요할 때까지 얼음에 둡니다.
8. O / N 배양의​​ 섬 문화 매체는 보충 RPMI 1640 미디어입니다. 원액의 경우, 두 번 증류 된 H ₂ O의 1 L에 한 RPMI 1640 패킷 (기브, 뉴욕)를 녹여 1.19 g HEPES (5 ㎜)과 2g 나쵸 ₃ (24 mm)를 추가합니다. 7.4으로 산도를 조정,어둠 속에서 4 ° C에서 필터 소독 및 저장.
9. 보충 미디어의 주식 RPMI 1640 미디어에 각각 10 % FBS 100 IU/100 ㎍ / ㎖의 페니실린 / 스트렙토 마이신을 추가합니다. 다른 글루코스 농도가 요구되는 경우, 글루코스없는 RPMI 1640 매체가 사용될 수 있으며, 포도당의 특정 농도가 첨가 될 수있다.
10. 염화나트륨 (118.41 MM),의 KCl (4.69 ㎜), _망초 (1.18 ㎜), KH ₂ PO ₄ (1.18 MM : 주식 크렙스 링거 중탄산염 버퍼 (크렙스 회로)의 경우, 다음과 같은 농도로 증류수를 두 배로하는 다음 재료를 추가 ), 나초 ₃ (25 ㎜), HEPES (5 ㎜)이고, pH 7.4에서 _염화칼슘 (2.52 ㎜). _{염화칼슘은} 마지막으로 추가되어야하며,이 솔루션은 최대 2 주 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다.
11. 크렙스, 0.5 % RIA 등급 BSA의 첨가하여 37 ° C에서 파스퇴르 피펫 10 ~ 15 분 동안 95 % O _{백팔십이분의이} 5 % CO _2와 제 1 가스의 작업 주식을 만들려면양에 의하여. 다음에, 글루코스는 시험 관내 분석을위한 원하는 농도로 첨가된다.

도구 2. 준비

1. 약간 30의 끝을 무디게 - 27-G 바늘 날카로운 지적을 반올림 선명 돌을 사용. 펜치를 사용하여 끝에서 인치의 ¼에 대한 바늘에서 45도 굴곡을 넣어. 바늘의 내부 직경을 닫을 것이다, 너무 열심히 짜내하지 않도록주의하십시오.
2. 약 4 인치 길이, 각 마우스 하나에 3 / 0 실크 봉합 실을 잘라.
3. 아래 플라스틱 포장 테이프로 해부 현미경의 기초를 커버.
4. 마우스 당 최소 2 흡수 벤치 용지의 크기는 약 3 × 5 인치의 여러 조각을 잘라.

3. 마우스를 준비

1. 1 ㎖ 에버 틴과 1 ML의 주사기를 채우십시오.
2. 체중의 약 40 μL / g 복강 AVERTIN 용액을 주입한다.
3. 마우스없이 난 후onger주의 깊게 해부 현미경의 워크 스테이션에 전송, 꼬리 또는 뒷발의 핀치에 응답합니다.
4. 앙와위에서 마우스 및 마우스 머리 원심 향하게, 70 % 수성 에탄올로 마우스를 스프레이. 노출 흉강에 모피의 양을 제한하기 위해 70 % 에탄올의 적절한 양을 사용하십시오.

4. 흉강 열기

1. 두 뒷다리 사이의 마우스의 털과 피부를 조이고 표피, 진피 및 기본 세포막을 통해 초기 컷을합니다.
2. 여전히 피부와 기본 막 곤란하지만, 마우스가 내부 장기를 절단하지 않도록주의하면서 양쪽 날개의 방향으로 잘라.
3. 흉곽에 피부 막 플랩을 접어 인플레이션 췌장에 쉽게 액세스 할 수 있도록 칼 모양의 프로세스를 제거합니다.
4. 헤드 근위 향하게 마우스의 방향과 워크의 우측 세인트 향해 내장 이동하행 대동맥을 공개 ATION.
5. 혈액 조직을 수집하는 경우를 제외하고, 하행 대동맥은 euthanization을 완료하기 위해 절단 할 수 있습니다. 담관에 쉽게 액세스 벤치 종이 또는 킴 와이프와 함께 여분의 혈액을 흡수.

5. 췌장을 팽창

1. 담관이 마우스의 머리와 수직 라인을 형성 있도록 해부 현미경으로, 소장의 위치를​​ 변경.
2. 집게를 가지고 소장을 잡고 분홍색 장에 흰색 삼각형을 형성, 담관에서 소장에 밖으로 splays 담관의 끝에서 Oddi의 괄약근 (팽대부의 괄약근)을 찾을 수 있습니다. Oddi의 괄약근가 위치한되면, # 5 뒤몽의 집게를 가지고 가능한 한 소장에 가깝게 담관 아래의 팁을 밀어 덕트를 관통하지 않도록주의.
3. 소장 및 결합 조직을 관통 한 후, 사용하는뒤몽의 끝은 봉합을 잡고 담관에서 당겨 집게. 매듭 누설을 방지하기 위해 엄격한 있는지 확인하고, 가능한 한 Oddi의 괄약근에 가깝게 담관을 묶어.
4. 봉합사의 양쪽 끝을 잡고 담관에 약간의 긴장을 넣어 꼬리쪽으로 잡아 당깁니다. 무료 손을 사용하여, 단지 간으로 지난 분기 위의 담관에있는 마이크로 가위로 작은 절개를합니다. 참고 :이 췌장의 부분적인 인플레이션을 초래할 수로 Oddi의 괄약근에 너무 가까이를 잘라도별로 인플레이션이 발생할 것으로 담관을 통해 절단 방지하지하는 것이 중요합니다.
5. 긴장 담관으로 문자열의 양쪽 끝을 잡고, 주사기를 설정 얼음 통에서 5 ㎖의 콜라게나 솔루션을 사전로드 된 주사기 / 정맥을 제거하고 절단에 무디게 30 G 바늘을 삽입 담관, 조심하면 워싱턴 통해 피어스하지덕트의 L​​L. 30 G 바늘 주위에 시일을 형성하는 담관에 충분하지 않은 경우,이를 제거하고 무디게 27 G 바늘로 교체한다.
6. 자리에 바늘을 들고 있지만, 봉합사를 해제하고 5 ML의 주사기를 선택합니다. 천천히 주사기의 플런저를 우울. 참고 : 바늘 성공적 담관에 삽입 된 경우에, 확장 한 것이다.
7. 췌장의 첫 번째 부분은 부드러운 일정한 압력 다음으로 팽창 될 때까지 천천히 박동 방식이시키는 플런저를 우울하게 계속 췌장이 더 이상 팽창 할 때까지. 참고 : 대부분의 췌장 누설을 시작하기 전에 3 ~ 5 ㎖의를 개최합니다. 또한, 성공적인 인플레이션은 외분비 조직의 균일 한 분포를하고 위의 상단에있는 췌장의 일부가 비정상적으로 될 것입니다.
8. 담관에서 바늘을 제거하고 옆으로 출발했다.

6. 췌장 제거

1. 한 손으로 곡선 가위에 집게를 가지고다른. 집게를 사용하여, Oddi의 괄약근에 소장을 파악. 가위는 닫힌 소장에서 췌장의 별도 부분에 팁을 사용합니다.
2. 소장과 췌장 사이의 간격을 넓혀 떨어져 가위를 확산.
3. 소장과 췌장 방금 만들어진 갭의 우측에서 서로 부착 가위 "V"를 배치. 집게를 사용하여 부드럽게 췌장을 제거하기 위해 가위를지나 소장을 당깁니다.
4. 핑크 결합 조직에 소장을 작업을 계속. 이 시점에서, 그것은 위장에 부착 곳 근처의 작은 창자를 들고 거리 소장의 나머지 췌장을 싹둑. 참고 :이 수축하기 시작 수 있으므로 췌장을 자르지 않도록주의하십시오.
5. 부드럽게 집게 (평 집게가 잘 작동)와 위장에 부착 된 췌장의 일부를 잡아. 췌장에 부드럽게 위로 당기면서, 곡선을 사용D 가위는 췌장과 위장 사이의 연결 멀리 싹둑합니다.
6. 비장을 찾아 췌장 위의 집게로 잡고. 곡선 가위를 가지고 비장과 췌장 사이의 연결을 버려야.
7. 췌장이 대장에 부착되는 위치 찾기. 집게와 대장을 들고을 통해 찌를 가위의 끝 부분을 사용합니다. 대장과 췌장 사이의 간극을 생성하기 이전을 제외한 가위 확산.
8. 집게와 대장을 잡고이 췌장이 대장에의 정확한 연결을 노출, 배교가 발생합니다. 나머지 연결을 멀리 싹둑.
9. 췌장 및 소장에 첨부 된 핑크 결합 조직을 찾아 가능한 췌장에 가깝게 잘라. 참고 : 췌장 관통하는 관심사 인 경우,이 결합 조직이 이후 단계에서 필터링 될 바와 같이 소장에 가깝게 절단 의뢰한다.
10. 지가능한 한 췌장의 대부분과 RAB는 조심스럽게 들어 올립니다. 곡선 가위로 완전히 췌장을 제거하는 췌장과 흉강 사이의 나머지 연결을 버려야. 참고 : 제대로 제거하면 췌장은 여전히​​ 팽창한다.
11. 다른 모든 췌장이 팽창 실험을 위해 제거 될 때까지 얼음에 50 ML 원뿔 관에있는 콜라게나 솔루션 ~ 2.5 ㎖를 분리 한 췌장을 저장합니다.

7. 세탁

1. 모든 격리 췌장을 가지고 각각의 신선한 콜라게나 제 용액 25 ㎖를 포함하는 50 ㎖에게 원뿔 튜브를 분리로 이동
2. 셰이커, 220 ~ 250 rpm으로 진동 할 수있는 물 목욕을 흔들어 37 ° C에서 똑바로 50 ML 원뿔 튜브를 놓고 전원이 꺼집니다.
3. 95 % O ₂ / 5 _더 파스퇴르 피펫 5 분 %의 CO ₂ 각 50 ML 원뿔 튜브를 기체.
4. 단단히 각 튜브를 요점을 되풀이하고 떨고 물 옆으로 배치수면 아래에 목욕. 최대 16 분, 최소 6에서 시작하여, 20 초 동안 220 ~ 250 rpm으로, 다른 모든 순간에 흔들어. (,, 10 일, 6 14 12 8 흔들어, 16 분)
5. 즉시 빠른 스핀 실온에서 원심 분리기에 튜브를 전송합니다. 1,500 RPM (4백~5백그램)에 원심 분리기를 가지고 즉시 해제합니다.
6. 진공 트랩, 대기음 펠렛을 방해하지 않고 콜라게나 솔루션의 약 22.5 ㎖를 사용. 펠렛을 깨고 부드럽게 10 ML HBSS와 소용돌이로 세척.
7. 1,500 RPM (4백~5백그램)까지 실온에서 또 다른 빠른 스핀을 수행합니다.
8. 다시 펠렛을 방해하지 않고 솔루션의 대기음은 약 10 ㎖.
9. 부드럽게 다시 한 번 펠렛을 깨고 또 다른 10 얼음 차가운 HBSS ml의 소용돌이로 세척. 솔루션의 빠른 스핀과 대기음 10 ㎖를 반복합니다.
10. 부드럽게 HBSS 용액 2.5 ㎖에 남은 펠렛을 소용돌이. 를 통해 솔루션을 붓고1,000 μm의 새로운 50 ML 원뿔 튜브에 메쉬. 이 콜라게나 제에 의해 소화되지 큰 조직 파편을 제거합니다.
11. 얼음 차가운 HBSS 2.5 ㎖로 기존의 50 ML 원뿔 튜브를 씻어. 완전히 새로운 50 ML 원뿔 튜브에 메쉬를 통해 HBSS의 2.5 ML을 전송하기 전에 튜브의 측면을 씻어 파스퇴르 피펫을 사용합니다.
12. 조직 펠렛 1,500 RPM (4백-5백그램)에 실온에서 또 다른 빠른 스핀을 수행합니다.
13. 진공 트랩으로 튜브를 기울여 HBSS 모든 대기음. 참고 :이 섬의 손실이 발생할 것으로 펠렛을 방해하지하는 것이 매우 중요합니다. 펠릿이 느슨하거나 진공 트랩을 향하여 움직이기 시작하는 경우, 용액의 흡입을 중지하고 조직을 다시 펠렛 후 남은 용액을 흡인하는 것을 계속한다.
14. 일단 HBSS 모두 제거 된, 펠렛을 깨고 25 % 피콜 용액과 소용돌이의 4.8 ML를 추가합니다.
15. 조심스럽게 2의 2.4 ml의 레이어50 ㎖ 원뿔형 튜브의 측면에 23 % 피콜 용액을 첨가하여 25 % 피콜 용액의 상단에 3 % 피콜 용액. 피콜 솔루션을 추가하는 경우에도 레이어드 보장하기 위해, 50 ML 원뿔 관을 돌립니다.
16. 20.5 %의 축성 과정을 반복 한 후 11 % 피콜 솔루션을 제공합니다. 참고 : 4 개 층이 존재하지 않은 경우에, 50 ㎖ 마크까지 HBSS를 추가 피콜 구배가 더 이상 존재 4-6 배까지 튜브보기 반전. 조직을 다시 펠렛 및 단계 7.14-7.16을 다시 시도하십시오.
17. 15 분 동안 1,820 RPM (800g)에 실온에서 50 ML 원뿔 튜브를 스핀.
18. 뒤에 외분비 조직의 펠렛을 떠나 돌보는 신선한 50 ML 원뿔 관에 피콜 모든 붓는다. 50 ㎖ 표시까지 얼음 차가운 HBSS를 추가하고 함께 피콜 및 HBSS를 혼합 튜브에게 4-6 번 반전.
19. 5 분 1,820 RPM (800g)에 실온에서 50 ML 원뿔 튜브를 스핀.
20. 조심스럽게 진공 TRA를 사용하여 HBSS / 피콜 혼합물의 대부분을 대기음P. 이 느슨한 쉽게 흡입 될 수있는 펠렛을 방해하지 않습니다.
21. 파스퇴르 피펫을 가지고 일회용 문화 튜브에 펠렛을 전송합니다.

8. 독도 따기

1. 일회용 문화 튜브에 따기 미디어의 5 ML (예. 보충 RPMI 1640 또는 크렙스 링거 중탄산염 버퍼)를 추가합니다. 참고 : 따기 미디어가 다운 스트림 응용 프로그램에 따라 다릅니다.
2. 독도가 5 분 동안 배양 튜브의 바닥에 정착하자. 60mm 폴리스티렌 페트리 접시에 파스퇴르 피펫을 15 mm로 사용하여 전송합니다. 참고 :이 치료되지 않는 한 페트리 접시를 사용하고 접시에 부착 독도를 방지 할 수 있습니다 중요합니다.
3. (; 필터 멸균 100 ML RPMI 1640 주식 미디어, 10 ㎖ 열 불 활성화 FBS, 1 ㎖ 펜 / Strep의)는 60mm의 폴리스티렌 페트리 접시에 의해 별도의 15mm에서 5 마우스 섬 문화 매체의 ML을 추가합니다.
4. backlig과 해부 현미경의 도움을HT 기능은, 선포 조직 파편이 묻지 않도록주의하면서, 섬 문화 매체를 포함하는 페트리 접시에 독도를 선택하는 P-20 피펫을 사용합니다. 역광 선포 조직은 밝은 회색과 재미를 나타납니다 동안, 독도, 갈색 - 금과 자신의 외부 막 반짝임 수 있습니다 나타납니다. 섬 준비 파편 많은 양이 포함되어있는 경우, 그것은 새로운 배지로 두 번 독도를 손으로 선택하는 것이 좋습니다. 파편 오염을 줄이는 것은 하룻밤 배양 한 후 섬의 응집을 제한합니다. 소화 버퍼에 DNA 분해 효소 (3,000 U / ㎖)를 추가하면 섬 응집 (JWJ, 개인 관찰)을 제한하는 데 도움이 될 수 있습니다. 참고 : 하류 실험에 대한 계획을 격리 섬의 수를 계산하는 것이 중요합니다.
5. 5 % CO _2와 37 ° C로 설정 인큐베이터에서 독도 O / N을 품어.

9. 캠프 분석

1. 1.7 ML의 microfuge 튜브, 분석의 각 복제에 대 한 레이블. 참고 : 캠프의 분석은 적어도 뒤이 있어야합니다각 처리 조건에 대한 plicates하지만, 처리 당 더 많은 반복 실험이 바람직하다.
2. 파스퇴르 피펫 95 _%, O2 / 5 % CO _2와 15 분 동안 크렙스 링거 중탄산염 버퍼 가스 처리 한 후, 0.5 % RIA 등급 BSA와 1.7 밀리미터 (예비 배양 용액)의 최종 포도당 농도를 추가합니다. 그런 다음, 각각의 미세 튜브에 갓 가스실 크렙스 1 ㎖를 추가합니다. 크렙스 두 ㎖를 미리 배양 및 처리 시간 점 튜브 당이 필요합니다; 그러나 그것은 여분의 적어도 5 ~ 10 ㎖를 준비하는 것이 좋습니다.
3. 페트리 접시의 중앙에 섬을 소용돌이와 P-20 피펫을 사용하여 포도당 함유 배지를 씻어 예비 배양 용액 5 ㎖를 포함하는 60mm의 폴리스티렌 페트리 접시에 의해 새로운 15 mm로 독도를 직접 선택 독도에서.
4. 사용되는 캠프의 분석 키트는 GE 헬스 케어 캠프 직접 BioTrak EIA입니다. 사용 prococol "는 세포 내 cAMP의 이용 MEAS 대해 기재 한 것과의 변형이며, 신규 용해 시약으로 비 아세틸 EIA 절차를 사용하여 "및 관하여 urement는 처리 조건과 기술은 복제의 증가 수 있도록, 튜브 당 아일렛의 최소 수와 함께 사용하기 위해 최적화되었다. 1 ㎖ 사전 배양 버퍼 튜브 사이의 작은 섬 크기의 일관성을 유지하고, 단계 9.2에서 각각의 튜브에 P-20 피펫, 전송 적어도 13 섬을 사용. 참고 : 복제물의 개수를 늘리면 튜브 당 아일렛의 수보다 더 유익하다. 균등 튜브 당 아일렛의 수를 증가시키기에 충분한 아일렛이있는 경우, 그것은 튜브 당 25-50 아일렛까지, 그렇게하는 것이 바람직하다.
5. 의 미세 관 뚜껑을 연 상태에서 5 % CO _2에서 설정 37 ° C 배양기로 전송하고 45 분은 기본 수준으로 모든 섬의 인슐린 분비를 정상화하는 동안 품어.
6. 샘플을 인큐베이션하는 동안, 탈기 크렙스 FR에서 치료 (즉, 8 개 mm, 11.1 mm의 16.7 mM의 포도당 등)을 제조톰 9.2 단계. 15 ML 원뿔 튜브에, 어떤 피펫 오류를 설명하는 추가 1 ㎖와. 200 μM의 최종 농도 3 - 이소 부틸 -1 - 메틸 크 (IBMX)을​​ 추가한다. IBMX는 블록이 생성 될 때 캠프가 세포에 축적 할 수 있도록 캠프의 저하, 일반 포스 포 디에스 테라 제 억제제이다. (참고 :.. 이는 진정한 캠프의 생산 분석입니다 측정 캠프 생산이 바람직하지 않을 때 인스턴스에 대한 토론 섹션을 참조 IBMX는 분석에서 제외 된 경우, 더 많은 섬은 캠프 데이터를 얻기 위해 튜브 당이 필요합니다 표준 곡선의 선형 범위).
7. 45 분 전 배양 한 후, 보육, 모자, 펄스 소용돌이 각각의 샘플 (이하 0.5 초)에서의 미세 튜브를 제거합니다. 이 가능성으로 인해 튜브의 바닥에 집중되는 섬에 생성 된 인슐린 그라데이션을 혼합하는 것입니다. 출장이 부정적인 섬 안정성 (주의에 영향을 미칠 수 있으므로주의가 너무 가혹 와동하지 않도록해야합니다독도와 튜브를 가볍게 가볍게 쳤다하거나 부드럽게 와동 펄스 수없는 경우 반전 될 수있다. 이 옵션은 실험을 계획 할 때 고려해야하는 분석)에 시간을 추가합니다.
8. 독도는 10,000 RPM (7,000-7500 g)에 도달 한 후 즉시 끌 때까지 테이블 위에 원심 분리기 (RT)과 회전 각 튜브를 전송합니다.
9. 섬 펠릿에 레브의 약 10 ~ 15 μl를 떠나, 각각의 microfuge 튜브에 크렙스의 대부분을 제거하기 위해 P-1000 피펫을 사용합니다. 가장 가까운 섬 펠릿 부분을 제거하기 위해 P-20 피펫을 사용합니다. 펠렛을 방해하는 경우, 다시 관과 재 스핀에 크렙스을 피펫.
   (참고 : 실험이 너무 어려워을 방해하지 않고 섬 펠릿에서 크렙스를 모두 제거 발견하면, 지난 10 ~ 15 μL가에 남아 나중에 프로토콜의 전체 볼륨을 차지 할 수있다.
10. 배양 후 샘플을 동결 스냅 절연 용기에 액체 질소의 충분한 양을 얻을 수 있습니다.
11. 인큐베이터 밖으로 샘플을 채취, 모자, 소용돌이 빠르게 (이하 0.5 초) 10,000 RPM (7,000-7500 g), 최대 테이블 탑 원심 분리기 (RT)에서의 미세 튜브를 회전 후 즉시 차단. 인슐린이나 다른 대사 산물이 원하는 다운 스트림 응용 프로그램의 경우, 추가 분석 할 때까지 -20 ° C에서의 미세 튜브 및 저장 매체의 분취 량을 수집하는 P-1000 피펫을 사용합니다. 자극 미디어가 수집되지 않는 경우 폐기 될 수있다.
    (참고 : IBMX는 포도당 자극 인슐린 분비 (GSIS의 강한 강화제이다) 따라서, 캠프 자극 매체에서 얻은 국제 대학원 결과가 정확하게 국제 대학원에 대한 구체적인 치료의 진정한 효과를 나타낼 수 없습니다, 이러한 효과는 미묘하다, 특히.).
12. 섬 펠렛을 방해하지 않고 가능한 한 많은 자극 매체를 제거하는 단계 9.9를 반복합니다. 크렙스 미만 10 ~ 15 ㎕의이 작은 섬의 펠렛에 남아있는가하면 스냅 액체 질소의 섬 펠렛을 동결. 일단 모든샘플은 스냅 캠프 측정 할 때까지 -80 ° C에서 저장을 동결하고 있습니다.
13. 캠프의 결정의 날, 제조 업체의 프로토콜에 따라 새로운 용해 시약을 준비합니다. 30 초 최고 속도에서 각각의 미세 튜브와 소용돌이에 200 ml의 용해 시약 1B를 추가합니다. 튜브가 30 초 동안 매 2 분 텍싱, 10 분 동안 얼음에 앉아 보자. (참고 :이 프로토콜은 세포 용해를 보장하기 위해 트리 판 블루와 현미경 분석을 수행하는 것이 좋습니다,하지만이 섬에 대해 수행되지 않음).
14. 작업 표준을 준비하고 제조 업체의 프로토콜에 설명 된대로 정확히 EIA 마이크로 플레이트를 설정합니다. 효소 기질은 30 분 동안 마이크로 플레이트와 함께 배양 한 후, 선택적 1.0 M 황산 단계를 수행하고, 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 450 nm에서 마이크로 플레이트의 웰의 흡광도를 결정한다.
15. 사이 클릭 AMP 결과 fmol / 잘으로 기록 될 것입니다. 이 총 원래 샘플의 양 (200 μL + 어떤 정상화해야한다잔여 크렙스는) 단계 9.9에서 독도에 남아. 다음 결과 중 하나 fmol 캠프 / 섬을 생산, 또는 해물 샘플 (fmol / μg의 단백질을 제공) 총 세포 단백질에 결과를 정상화 bicinchoninic 산 (BCA) 단백질 분석을 실시 할 수 있습니다 제공, 섬의 총 수에 정상화 될 수있다 . 후자는 섬 크기는 샘플 사이에 일치하지 않는 경우에 권장되고, 섬의 크기 대리 할 수​​있다. 피어스 BCA 단백질 분석 키트는이 프로토콜의 성공과 함께 사용하고, 샘플의 25 ML을 필요로하고있다. BSA 표준은 캠프의 분석 키트에서 용해 시약 (b)에 준비되어야한다.

결과

격리 기간 동안 높은 섬 수익률을 보장하기 위해, 프로토콜에 설명 된 수술 기법을주의 깊게 추적 관찰을해야한다. 여기에 제시된 기술은 각 실험실에 맞게됩니다 만, 성공적인 분리로 이어질 것입니다 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 담관이 쉽게 접근 할 수 있도록하기 위해서는, 장기가 마우스의 오른쪽 (도 1)로 변위하는 것을 추천합니다. 더욱이, 이러한 제한은 적은 무게가 팽?...

토론

세계 인구의 19.5 %에 영향을 미칠 것으로 예상 당뇨병의 유병율로, 신규의 연구 기술의 요구 사항을 모두 이해하고 ^{18 당뇨병을} 치료하는 데 필수적이다. 본 섬 격리는 시험관 실험에 사용되는 잘 확립 된 프로토콜이며, 약간의 수정을 ^{11,14,16으로} 이전에 제시되어 있습니다. 인슐린 분비는 캠프와 같은 업스트림 구성 요소에 초점을 맞추고, 고립 된 섬에 대한 일반적인 다운 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagenase from Clostridium histolyticum suitable for isolating active islets	Sigma-Aldrich	C7657
Ficoll 400	Sigma-Aldrich	F9378
Hanks Balanced Salt Solution 10X	Invitrogen (Gibco)	14065-056
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
RPMI 1640 (powder)	Invitrogen (Gibco)	31800-022
Albumin from Bovine Serum (BSA)	Sigma-Aldrich	A7888
3/0 Silk Suture Thread	Fine Science Tools	18020-30
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-10
0.8 mm Forceps	Fine Science Tools	11050-10
Curved Scissors	Fine Science Tools	14061-10
Vannas-Tübingen Spring Scissors - Straight/Sharp/8.5 cm/5 mm Cutting Edge	Fine Science Tools	15003-08
Dissecting Scissors	Fine Science Tools	14002-14
5 ml BD Luer-Lok Syringe	BD	309646
1 ml BD syringe	BD	309628
30 G BD Needle 1/2" Length	BD	305106
27 G BD Needle 1/2" Length	BD	305109
Sharpening Stone	Fine Science Tools	29008-01
2-2-2-tribromoethanol	Sigma-Aldrich	T48402-25G
2-methyl-2-butanol	Sigma-Aldrich	240486-100mL
Sodium Chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S9888
Potassium Chloride	Sigma-Aldrich	P3911
Monopotassium Phosphate (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P0662
Sodium Bicarbonate (NaCHO3)	Sigma-Aldrich	S6014
CaCl2·2H2O	Sigma-Aldrich	C3881
MgSO4·7H2O	Sigma-Aldrich	M9397
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen (Gibco)	15140-122
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum (H.I. FBS)	Fisher Scientific	SH30088.03HI
3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)	Sigma-Aldrich	5879-100MG