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요약

OVO에서 융모 막 (CAM)는 신선한 육종 파생 된 종양 조직들은 단일 세포 현탁액, 영구 및 임시 찬란 설립 육종 세포주에 이식합니다. 모델은 이식편 (생존, Ki67 확산 지수, 괴사, 침투) 및 호스트 (섬유 아세포의 침윤, 혈관 안쪽으로의 성장) 행동을 연구하는 데 사용됩니다.

초록

육종은 모든 새로운 치료법의 개발을 방해, 자연 이기종 매우 드문 질환이다. 육종 환자는이 질병에 대한 재현성과 낮은 비용 xenotransplant 모델을 개발하여 현재 관심을 설명하는 층화 한 후 맞춤 의학을위한 이상적인 후보입니다. 병아리 융모 막은 종 별 제한없이 이식 조직과 세포를 유지 할 수있는 자연 면역 결핍 호스트입니다. 또한, 그것은 쉽게 액세스, 조작 및 광학 및 형광 실체 현미경을 사용하여 몇 군데 있습니다. 조직학 더 이형 세포 상호 작용에 대한 자세한 분석을 할 수 있습니다.

이 프로토콜은 자세히 설명 신선한 육종 파생 된 종양 조직들은 단일 세포 현탁액, 영구 및 임시 찬란 설립 육종 세포주 (SAOS-2 SW1353)와 융모 막으로 접목 OVO에서. 병아리 생존 쥐ES는 75 %입니다. 모델은 이식편 (생존, Ki67 확산 지수, 괴사, 침투) 및 호스트 (섬유 아세포의 침윤, 혈관 안쪽으로의 성장) 행동을 연구하는 데 사용됩니다. 단일 세포 현탁액의 접목 지역화를 들어, ECM 젤 불활성 억제 물질에 비해 상당한 이점을 제공합니다. Ki67 확산 지수는 CAM의 표면에서 세포의 거리와 CAM, 치료 제품의 추가에 대한 시간 프레임을 결정하는 후자의 응용 프로그램의 지속 기간에 관련되어 있습니다.

서문

육종 치료 저항 1,2로 인해 높은 사망률을 가진 결합 조직의 드문 종양이다. 환자의 생존에 진행 그들의 낮은 연간 발생률, 자신의 폭 넓은 다양성 및 육종 세포가 체외 3,4의 문화를 열심히보고 있다는 사실에 의해 방해된다.

임상 치료 평가를위한 배양 세포의 사용은 체외에서 새로운, 분명히 활성 분자가 항상 임상 결과를 반영하지 않는 것으로 나타났습니다. 또한, 유전자 발현 배열에 의해 밝혀 게놈 변이는 항상 5-7 개별 환자에서 종양의 행동 특성에 상관하지 않습니다. 이러한 문제를 시도하고 해결하기 위해, 맞춤 의학은 이종 이식 모델에 8-12에 대한 증가 된 검색에 반영됩니다 중요성에 얻고있다.

생체 분석의는 C 사이의 복잡한 상호 작용을 반영하는 장점이 있습니다암 증식과 침윤 13에 필요한 ancer 세포와 고체 종양의 호스트 조직 환경. 현재 우리는 육종 14,15을위한 재현 이종 이식 모델로 리오 - Allantoic 막 분석 (CAM-분석)의 사용을 공부합니다. 이 분석은 널리 종양의 혈관 신생 16,17의 연구에 사용됩니다. 다른 연구는 서로 다른 프로토콜 18,19에 따라 성장 또는 혈관에 표시된 차이를 관찰하면서 문학에서는, 그러나, 우리는이 분석을 위해 다른 프로토콜을 발견했습니다.

이 문서에서 우리는 종양 이식, 종양 파생 된 단일 세포 현탁액과 전통 육종 세포 배양을 사용하여 세포 행동에 CAM-분석의 조건을 변화의 효과를 조사합니다.

프로토콜

개요 그림 1을 참조하십시오

종양 물질

1. 종양 샘플을 얻기 및 준비

환자 물질의 사용을위한 윤리위원회의 승인이 필요하며, 동의는 환자에서 얻을 수합니다.

  1. 개입의 시점에서 수확 대표적인 물질 (최소 1cm 3), 생검 또는 육종의 절제 하나. 생검의 적절한 위치는 동적 대비 MRI를 사용하여 정의됩니다.
  2. DMEM 1,000 U 페니실린 1 MG / ML 스트렙토 마이신과 보충 포함하는 멸균 병에 즉시 자료를 놓습니다.
  3. 실험실 - 즉시 병 (90 분 30) 수송한다.

다음의 모든 절차는 층류에서 수행됩니다.

  1. 멸균 페트리 접시에 유리 병의 내용물을 붓는다.
  2. 최대한 1m의 작은 부분에 종양 샘플을 넣어m 3 멸균 메스를 사용하여. 그들은 조직의 추가 처리를 손상하는 경향 모두 석회화 된 부분을 제거합니다.
  3. 무작위 CAM의 응용 프로그램을위한 10 종양 이식을.

2. 종양 파생 된 단일 세포 현탁액의 준비

대략 시간 : 3 시간

  1. 샘플의 잔여 조직을 무게.
  2. 2 - dissociator 관 조직의 4g 하나 이상의 관은 나머지 모든 종양 조직을 소화해야 할 수 있습니다.
  3. 2 소화 - 조직의 4g, 2.5 ML 콜라게나 제 2 용액 (500 U / ML RPMI 1640) 2.5 ML DNase의 용액 (22 KU / ML RPMI 1640)을 추가합니다.
  4. dissociator의 h_tumor 프로토콜에 따라 조직을 처리합니다. 관은 30 분 동안 가볍게 흔들어 중일 때 37 배양의 2 ​​사이클 ° CO 2 배양기에서 C를 포함한다.
  5. 150 μm의 셀 스트레이너를 통해 남아있는 현탁액을 필터링합니다.
  6. 5 마일 1,000 rpm에서 해물을 원심 분리기N.
  7. 상층 액을 제거합니다.
  8. 일반 서스펜션 배양의 10 분을 허용, 적혈구 용해 버퍼 (ELB)의 10 ML에 펠렛을 resuspend을.

참고 : 적혈구 용해 버퍼는 다음과 같이 제조 : 0.037 g EDTA, 0.99 g K 2 HPO 4, 1,000 ml로 물에 8.29 g NH 4 망할 CIA를 추가, 0.22 μm의를 통해 압력 필터 7.3 산도를 조정하기 10 N 수산화 나트륨을 사용 필터링합니다. 4 ° C.에 저장

  1. 반응을 정지 배양 배지 (DMEM이 10 % 태아 소 혈청, 100 U / ML 페니실린, 100 ㎍ / ㎖ 스트렙토 마이신과 보충)의 25 ML을 추가합니다.
  2. 5 분 1,000 rpm으로 현탁액을 원심 분리기. 펠렛의 색은 이제 흰색이어야한다.
  3. 상층 액을 제거합니다.
  4. 펠렛 매체의 5 ML을 추가합니다. 70 μm의 셀 스트레이너를 통해 현탁액을 필터링합니다.
  5. 자동 셀 카운터를 통해 살아있는 세포 / ㎖의 수를 계산합니다.

3. Cancer 세포주

SAOS2 골육종 세포 (ATCC 번호 : HTB-85) 강화 된 녹색 형광 단백질을 발현는 제조 업체의 프로토콜에 따라 세포 라인 Nucleofector 키트 V를 사용하여 peGFP-C1 벡터에 electroporation하여 하였다. 안정적인 세포 라인을 확립하기 위해, 형질 세포는 이전에 설정된 프로토콜 20 라인에 4 주 동안 G418 (1 ㎎ / ml)에 선정되었다. 또한 정렬은 제조업체의 지침에 따라 형광 활성화 된 셀 정렬 (FACS)에 의해 수행되었다.

SW1353 연골 세포주 (ATCC 번호 : HTB-94)에서 세포 또는 갓 준비한 종양의 단일 세포 현탁액은 빨간색 형광 친 유성 막 얼룩을 사용하여 레이블이 표시됩니다.

  1. 솔루션, 트립신 (0.5 % 중량 / 부피) 에틸렌 산 (0.2 % 중량 / 부피 EDTA)를 사용하여 고전적인 방법으로 배양 플라스크에서 세포를 제거합니다.
  2. 1,000 rpm에서 5 분 세포 현탁액을 원심 분리기.
  3. supern을 제거atant.
  4. 혈청이없는 배지 5 μL DII (Vybrant 레드) / 10 6 세포의 1 ML을 추가합니다.
  5. 알루미늄 호일 유리 병을 포장하고 37 10 분 ° C.에 대한 CO 2 배양기에 넣어
  6. 1,000 rpm에서 5 분간 다시 원심 분리하여 그 상등액을 제거합니다.

융모 막 분석

1. 달걀 보육

  1. 계란의 95 %의 수정을 보장하는 지역의 상업 부화장에서 수정란이 필요합니다.
  2. 유정란 10 일 RT에서 최대 저장할 수 있습니다.

참고 : 부화를 시작하기 전에, 먼지, 깃털과 배설물주의 깊게 오히려 부드러​​운 표면 구조보다 거친이 종이 수건, 마른 걸레질에 의해 기계적으로 달걀 껍질에서 제거됩니다. 70 % 변성 에탄올 또는 다른 청소 시약 계란을 닦아 상당히 병아리 배아의 생존율을 감소시킨다.

  1. incub에 계란을 넣어한쪽 ATOR, 상부면을 표시. 계란 인큐베이터에 넣을 수있는 날이 배아 발달의 0 일 지정됩니다.
  2. 37.8 ° C에서 배양 온도 및 47 %의 습도를 설정합니다. 자동 회전 옵션이 꺼져 있는지 확인합니다.

2. 계란 열기

기간 : 25 계란 ± 60 분

개발 3 일에, 계란은 층류에서 열립니다. 막 껍질에 집중하는 경향으로, CAM에 손상이 더 발달 단계의 결과에서 알을 열기. 적외선 램프 절차를 수행하는 동안 알을 따뜻하게 유지하는 데 사용됩니다. 불임을 개선하기 위해, 우리는 손 장갑의 사용을 권장합니다.

  1. 위쪽을 향하도록 표시된면, 껍데기에 계란을 넣습니다.
  2. 계란의 끝에 삽입 18 G 바늘을 통해 알부민의 두 ML을 제거하여 CAM 수준을 낮 춥니 다. 바늘이 여러 천공 후 무딘 경우달걀 껍질은 바늘을 교체합니다. 그렇지 않은 경우, 너무 많은 힘은 계란 노른자 나 쉘의 골절에 손상이 가해 져야한다. 때때로 바늘 chalazae, 알부민의 노른자를 중단 2 나선형 밴드 중 하나에 의해 차단됩니다. 이 블록이 해결 될 때까지 조심스럽게 아래로 플런저를 밀어 해결할 수 있습니다. 달걀 노른자는 주사기로 흡입하는 경우, 바늘뿐만 아니라 주사기를 교체하십시오. 때때로 배아는이 이벤트 후에 죽는다. 알부민의 부족 금액이 제거되면 쉘이 제거 될 때, CAM이 손상 될 수 있습니다.
  3. 창을 절단하면서 CAM에 쉘 입자의 유출을 방지하기 위해 쉘 표시된 상단에 반투과성 접착 필름을 적용합니다.
  4. 계란의 표면에 작은 송곳 소개 구멍을 만든다.
  5. 멸균 뾰족한 외과 가위를 사용하여, 쉘에서 1cm 2의 창을 잘라.
  6. 태아의 박동 심장과 인접한 혈관이 일에 관찰 할 수있다계란 노른자의 전자 표면. 비 수정란이나 죽은 태아를 제거합니다. 혈관의 중단 점은 죽은 배아를 특징.
  7. 반투과성 접착 필름 창을 밀봉하십시오. 쉘이 바늘의 삽입시 금 않는 한 그것은 빵꾸 사이트를 포함 할 필요가 없습니다.

3. 접종 절차

기간 : 셀 라인 당 ± 1 시간

병아리 배아 발달의 날 9, 계란 층류에서 접종한다.

CAM에 걸쳐 확산 암 세포의 평가는 접종 기간 동안 제한된 표면 세포의 억제가 필요합니다. 마트 리젤 자주 실험 세포 배양 조건에서 사용되는 Engelbreth-홀름 - 떼 마우스 육종에서 세포 외 기질 (ECM) 젤입니다. 그것은 냉각하면 액체이지만, 20 왔을 때 열적 활성화 중합을 받게 될 것이다 - 40 ° C, 따라서 안정된 겔을 형성합니다. 시실험은 마트 리젤은 얼음이 녹는를 포함하는 상자에 보관됩니다.

참고 : 천공의 coverslips를 사용하지 않는 주장한다. 따라서 우리는 막 자체에 세포의 성장 잠재력을 바이어스 플라스틱 디스크에 부착 및 이식 암 세포의 성장을 관찰했다.

  1. 10 6 cells/100 μL ECM 젤의 농도로 냉각 ECM 젤의 세포 펠렛을 resuspend을. 얼음이 녹는에이 솔루션을 유지한다.
  2. 층류에 따라 불임 수술의 한 쌍의 반 투과 막 소비세 부분입니다. 접착 필름이 완전히 제거되면,이 오염에 의한 배아 사망의 더 큰 비율로 발생합니다.
  3. 상피 세포 층을 제거하기 위해, 멸균 유리 봉으로 가볍게 쉘 창 아래 CAM 오른쪽을 터치합니다. 멸균 유리 막대와 CAM을 터치하면 메스 N ° 11, 더 솜씨 좋음과 경험을 필요로 사용하는 것보다 적은 충격으로 증명한다. 작은 출혈이 발생할 수 있습니다.
  4. 종양의 자료를 dding.
  5. 종양 이식의 경우 : 그것을 짜지 않고 멸균 포셉 한 쌍의 CAM 상 조직의 부드럽게 낮은 원피스.
  6. ECM 젤 절차 : ECM 젤 응용 프로그램 사이에서 중합 할 수 있도록 서로의 상단에 CAM에 세포 ECM 겔 현탁액의 배 25 μl를 추가합니다. 이 방법으로 암 세포를 포함하는 접착 플라크가 생성됩니다.
  7. 반투과성 접착 필름으로 다시 쉘 창을 밀봉하십시오.

4. 이미징 및 CAM의 수확

기간 : 25 계란 2 시간

병아리 배아 발달의 날 16 일 캠 수확된다. 층류에서 작업 할 필요가 없습니다.

  1. 외과 가위로 창을 확대합니다. 손상된 혈관의 출혈의 결과로, 그렇지 않으면 CAM이 손상 될 수 있습니다, 너무 낮은 잘라하지해야합니다.
  2. 300를 추가 - PBS D 500 μl를 CAM 분파 위에 피펫접종 물질을 포함하는 이온. 아무 형광 프로브를 사용하지 않는 경우이 막 엄격한 만들면서, 버퍼 포름 알데히드는 멤브레인의 절단을 용이하게 사용할 수 있습니다.
  3. GFP 또는 DSR 필터 및 필터 없음 모두를 사용하여 디지털 컬러 카메라가 장착 된 스테레오 형광 현미경을 통해 계란 CAM의 사진을 확인합니다. 종양 이식의 경우, 모든 사진은 필터없이 만들어집니다. LED 조명으로 위의 조명은 강하게 (그림 2) 촬영 중에 권장합니다.
  4. 레이블 세포에 대한 기록 종양 세포의 이동. 종양의 경계가 불규칙 마모 될 수 있습니다. 흩어져 세포는 종양의 국경 근처에있을 수 있습니다. 일부 표본에서 종양 세포의 행 (그림 3) 관찰 할 수 있습니다.
  5. 쉘에 누워 국경에서 멸균 가위로 막 잘라.
  6. PBS D로 가득 차 또는 버퍼 멸균 페트리 접시에 수확 CAM를 배치maldehyde.
  7. 상부와와와 필터가없는 두 CAM의 아래쪽, 모두의 사진을 확인합니다.
  8. 최소 72 시간 동안 버퍼 포름 알데히드라는 컨테이너에 막 넣어.
  9. 파라핀 캠을 포함하고 조직 학적 검사를 위해 그들을 준비합니다. 절단 표면 카세트의 바닥에 평행하게 확인하고, 결절의 중심에 종양 이식을 절단하는데주의를 기울여야. 그렇지 않은 경우, CAM 및 종양 이식 사이의 상호 작용은 표시되지 않습니다. 같은 전략은 ECM 젤 패에 적용 칼날에 직면 표면은 플라크에 수직이어야한다.

5. 조직 학적 평가

필요한 경우 헤 마톡 실린 - 에오신 염색 및 기-67 면역은 자세한 설명을 위해 수행되었다. 면역은 따라 자동 슬라이드 염색기를 사용하여 두께 3.5 ㎛의 포르말린 고정 파라핀 조직 절편에서 수행되었다제조업체의 지침에. 기-67 (클론 MIB-1, 희석 1 / 100)에 마우스를 기본 단클론 항체를 사용 하였다. 열을 유발 에피토프 검색은 세포 컨디셔닝 1을 사용하여 수행되었으며, 시각화 범용 DAB 검출 키트에 달성되었다, 제조 업체의 지침에 따라. 조직 섹션의 Dehydratation은 자동 coverslipper를 사용하여 수행 하였다.

SAOS2과 SW1353 세포주, Ki67 양성과 Ki67 부정적인 세포 nuclei/100 μm의 2의 수는 세 영역에서 계산 하였다 : 하나 가까이 CAM의 경계로, 하나는 중앙의 표면을 닫습니다 ECM 젤 패. 이 절차는 각 기-67 스테인드 슬라이드 배 반복되었다. 증식 지수는 계산 세포의 총 수에 의해 Ki67-양성 세포의 수를 나누어 각 슬라이드에 대해 결정되었다.

괴사 파디 함께 세포의 핵에서 염색질의 좋은 분산의 손실에 의해 정의된다별개의 셀 여백의 NG​​. 이종 이식의 경우, 괴사 완료 (보통 표면) 부분, 또는 결석으로 채점됩니다. CAM에 종양 세포의 침윤은 CAM의 중배엽에서 종양 세포의 관찰에 의해 정의되며, 현재 또는 결석으로 채점됩니다.

세 가지 항목은 호스트 동작을 채점됩니다. 섬유 아세포의 침윤은 길쭉한 세포가 CAM을 떠나 종양 이식 / 패를 침입으로 정의되며, 현재 또는 결석으로 채점됩니다. 혈관 안쪽으로의 성장은 핵 병아리 적혈구의 존재에 의해 특징 병아리 혈관을 증식의 안쪽으로의 성장으로 관찰 할 수있다.

결과

CAM의 평가

종양 이식은 CAM (그림 2A)에 부착된다. 환자의 자료에서 단일 세포 현탁액 자주 건조, 약간 올라와 플라크 (그림 2D)를 표시합니다. CAM의 절단 후, 막의 주름 (2E와 2F 그림) 발생 표시.

상업 세포주 플라크는 세포 증식을 나타내는 시간에 더 많은 불투명됩니다. ECM 젤 다른 세포 라인은 CAM에 별개의 성장 패턴이 ?...

토론

접종 수확 시간

예방 접종의 날이 ECM 젤 (36 캠의)에 SAOS2을 사용하여 수행 및 배아 발달의 날 5와 10 사이에서 변화시켰다 타이밍.

배양 9 일 전에, CAM는 지속적으로 우리가 적용 ECM 젤을 지원하기에 충분히 큰되지 않았습니다. 수확에서 종양 세포는 때때로 깊은 CAM에서 검색 할 수 있고, 일부 ECM 젤 샘플은 알부민 또는 CAM에 느슨한 거짓말을 하였다. 일 5, 6, ?...

공개

저자는 공개 아무것도 없어.

감사의 말

SW1353 연골 세포주의 세포는 친절 교수 PCW Hogendoorn와 라이덴 대학, 네덜란드의 교수 J. Bovée에 의해 제공되었다. 우리는 우리의 프로토콜의 개요의 전문적인 드로잉 J. Mestach 및 G. Wagemans 우수한 기술 지원 및 G. 드 Bruyne 감사합니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Cell Line Nucleofector Kit VAmaxaVCA-1003
collagenase 2 solution (500 U/ml RPMI 1640)Sigma AldrichC6885
DMEMInvitrogen41965-039
DMSOSigmaD8418
Dnase solutionSigma AldrichDN25
G418Invitrogen11811031
MatrigelSigma-AldrichE1270
mouse primary monoclonal antibody Ki67Dako DenmarkMIB-1
ParaformaldehydeFlukaD76240
PBSInvitrogen20012019
PBSDInvitrogen14040083
peGFP-C1 vectorClontech632470
Penicillin/streptomycinInvitrogen15140163
RPMIInvitrogen22409-015
Trypsin-EDTA solutionInvitrogen25300054
Vybrant cell-labeling DiILifetechnologies22885
Countess Automated Cell CounterInvitrogenC10227
digital color cameraLeicaDFC 340 FX
Digital Egg IncubatorAuto Elex CoR-COM 50
FACSBD BiosciencesFACSAriaIII
Gentlemacs C-TubeMiltenyi Biotech130-093-237
Gentlemacs DissociatorMiltenyi Biotech130-093-235
Gentlemacs Dissociator User Manual containing h_tumor protocolMiltenyi Biotech
[header]
semipermeable adhesive film (Suprasorb F)Lohmann&Rauscher20468
stereo fluorescence microscopeLeicaM205 FA
Tissue-Tek Film automated CoverslipperSakura6400
ultraView Universal DAB Detection KitVentana Medical Systems Inc760-500
Ventana Automated Slide StainerVentana Medical SystemsBenchmark XT

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