미세 규모 Thermophoresis에 의한 결합력 결정 단백질 정제 - 무료 방법

요약

마이크로 thermophoresis (MST)은 널리 세포 용 해물에서 대상 단백질의 정제없이 결합력 결정에 사용할 수 있습니다. 프로토콜은 GFP 융합 단백질, 비 변성 조건에서 세포 용해 및 리간드의 농도를 변화의 존재 MST 신호의 검출 발현을 포함한다.

초록

단백질 상호 작용의 양적 특성은 특히 생명 과학, 신약 개발의 거의 모든 분야에서 필수적이다. K _{D 결정의} 현재 사용 가능한 대부분의 방법은 시간과 비용이 많이 소모 될 수 있습니다 발생하는이자의 단백질을 정제에 대한 액세스를 필요로합니다. 우리는 세포 용 해물에서 대상 단백질의 정제없이 마이크로 thermophoresis (MST)에 의한 결합력 결정을 허용하는 프로토콜을 개발했습니다. 이 방법은 비 변성 조건에서 GFP 융합 단백질 및 세포 용해의 발현을 포함한다. STAT3-GFP의 방법의 응용 프로그램이 일시적 처음으로 다른 시퀀스 올리고 뉴클레오티드를 잘 공부 전사 인자의 유사성을 판별 할 수 HEK293 세포에서 발현. 프로토콜은 간단하고 작은 분자, 펩티드, DNA, RNA와 단백질의 상호 작용을 공부 응용 프로그램의 다양한있을 수 있습니다, 및 Proteins.

서문

분자간 상호 작용의 유사성의 양적 특성은 생물 의학 연구의 많은 분야에서 중요합니다. 결합 상수 (K _D) 해리뿐만 아니라 신약 개발에 필수적인뿐만 아니라 모든 생물 시스템의 모든 바이너리 상호 작용의 특성에 중요한 매개 변수입니다. 이러한 면역 침전 효모 두 하이브리드 화면 등의 단백질 - 단백질 상호 작용의 검출에 사용되는 생화학 적 방법은 궁합이 특정 복잡한 생체 내에서 주어진 조건에 따라 존재 여부를 정의하는 동안 얼마나 긴밀한 이러한 상호 작용이있다 우리에 대한 정보를 제공하지 않습니다. 약물 발견 과정에서 바인딩 분석 개발이 필요하고 자주 가장 시간이 많이 걸리는 단계 중 하나입니다. K _{D 결정의} 가장 일반적으로 사용되는 방법은 형광 편광, ¹ 표면 플라즈몬 공명 (SPR) ^기술이 방사성 바인딩, ³ 등온 적정 열량계, ⁴ equilibri을 포함음 투석 (ED), ⁵ 한외 여과 (UF), ⁵ 원심 (UC). ⁶ 그들 모두는 표적 단백질을 정제 상당한 양을 필요로합니다. 마이크로 thermophoresis (MST)은 미세한 온도 변화에서 분자의 방향 움직임을 감지 급속히 발전 방법입니다. 온도 변화에 따라 운동의 상대적인 변화에 생체 분자 결과의 수화 쉘의 변경 ^7. MST는 바인딩 친화력을 결정하는 데 사용되며 타겟 단백질에 형광 표지 단백질이나 형광등 리간드에 결합 리간드를 공부 적용되었습니다. ^{8 9} MST는 표면에 고정화의 필요 (고정 - 자유 기술)하지 않고 직접 솔루션의 상호 작용을 측정 할 수 있습니다. 변화의 크기가 크게 시스템에 따라 차이가 있지만 거의 모든 바인딩은, MST 신호의 변화에​​ 의해 동반됩니다. MST에 의한 분자 운동의 탐지를 위해, 그들은 형광해야NT. 방법이 주요 제한은 장점으로 전환 할 수 있습니다. 단백질은 모든 시스템에서 GFP 융합으로 표현되는 경우에만 형광 분자되며 따라서 세포 파쇄 또는 세포 표현의 자유 시스템에서 분리하지 않고 공부하실 수 있습니다. 최소한의 아티팩트 바인딩 상태를 허용 세포 용 해물의 생성은 중요한 과제입니다. 여기에서 우리는 많은 수용성 및 막 단백질에 사용할 수있는 세포 lysate를 준비하고 MST 실험의 프로토콜을 설명합니다.

STAT 단백질은 세포 외 신호에 대한 응답으로 티로신 인산화에 의해 활성화 세포질 전사 요인을 잠재하고 면역, 조혈, 염증, 개발. 포유류의 ^10을 (를) 포함하여 많은 생물 학적 과정에 관여하는, STAT 가족은 STAT 1, 2, 3, 4로 구성 , 5A, 5B, 6. 활성화 된 모든 통계가 같은 DNA 서열에 결합하는 것으로 알려져 있습니다, 그래서 가스 모티브라고, IFN-γ 시퀀스를 활성화. 그러나 transcri다른 통계의 ptional 영향이 매우 다릅니다. ¹¹ 많은 병적 인 과정 및 17,000 출판물에 항복 광범위한 연구에 참여에도 불구하고, 서로 다른 DNA 시퀀스와 STAT 상호 작용의 K _D가 결정되지 않았습니다. 가스 모티프의 변형에 대한 다양한 통계 만 상대적으로 선호도가 특징되었습니다. 단백질 발현 및 정제 ¹¹ 어려움이 통계 'DNA 결합 선택도 특성의 주요 방해물이다. 연구의 대부분은 티르 인산화 전사 인자에 대명사 "활성화"통계, 전사 조절에 비 인산화 통계 (U-통계)의 역할의 역할에 초점을 맞추고 있지만 급속히 부상하고있다. ¹² 그러나 이러한 메커니즘을 제대로 이해, 그리고 U-통계가 실제로 DNA에 결합 또는 다른 전사 인자와의 상호 작용을 통해 작동하는지 불분명합니다. 우리는 최근 U-STAT3는 DNA 순차적에 바인딩 할 수있는 것으로 나타났습니다더 높은 친화력을 가진 가스 모티브 다른 CES. ¹³ 발견이 중요한 단백질의 생물학적 기능에 대한 우리의 이해에 상당한 영향을 미칠 수있다. 우리는 가스에 STAT3의 상대적 유사성을 결정하는 마이크로 thermophoresis을 적용 AT 풍부한 올리고 뉴클레오티드 S +100 (그림 4)가있다. 거의 동일한 프로토콜은 다른 STAT3 리간드 lipopeptide 억제제의 바인딩 K _{D 결정에} 사용되지 않았습니다. ¹⁴ 음성 대조군으로 사용 된 관련 전사 인자, GFP-STAT1에 바인딩 없음은 따라서 상호 작용의 선택성을 확인 감지 할 수 있습니다. ¹⁴

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프로토콜

1. 셀 해물의 준비

이 프로토콜은 모든 GFP 융합 단백질을 발현하는 세포 부착을위한 것입니다. 필요한 세포 수, 단백질 발현 수준에 따라 최저 많은 20의 x 10 ⁶ 세포 ⁶ 10에서 다를 수 있습니다. 예를 들어, HEK 세포에 과발현 GFP-STAT3의 해물는 1 ML의 용해 버퍼와 70 %에 가까운 자랄 때 10 ~ T75 플라스크에서 자란 세포를 처리하여 제조 하였다. 그러나이 해물는 MST의 실험 형광 최적의 수준을 제공하기 위해 150 배 희석했습니다. 세포 용해 프로토콜은 조사 대상의 속성과 단백질의 세포 내 국산화에 크게 의존한다. 세제를 사용하여 있기 때문에 단백질의 불안정성의 바람직하지 않은 경우, 초음파는 아래에 설명 된 최선의 선택이 될 수 있습니다. 다른 첨가물이 단백질 수정 반응을 방지하기 위해 용해 버퍼에 추가 할 수 있습니다 : EDTA는 인산화를 방지, 나트륨 바나 다트, 그래서 티로신 단백질 인산 가수 분해 효소를 억제DIUM 불화 빼앗아 / THR 인산의 억제제이다.

1. 용해 버퍼를 준비합니다. 쉬운 추출 세포질 단백질에 대해 다음과 같은 구성은 잘 작동 : 25 MM 트리스 염산, 산도 8.0, 및 프로테아제 억제제 칵테일 2 개 mm AEBSF, 0.3 μM 아프로 티닌, 130 μM의 bestatin으로 구성된 100 배 (시그마 - 알드리치 P2714를 희석 1 ㎜ EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 14 μM E-64, 1 μM의 펩틴). 또한, 적은 수용성 단백질, 하나는 프로 테아 제 억제제 칵테일과 비 변성 세제 상업 RIPA 버퍼를 사용할 수 있습니다. 얼음에 버퍼를 유지합니다.
2. 얼음처럼 차가운 PBS는 T75 플라스크 당 버퍼의 10 ML을 사용하여 간단히 세포를 씻으십시오. 5 분 얼음에 세포를 유지하거나 때까지 세포가 플라스크에서 분리 시작합니다. 필요한 경우 분리하는 세포 스크레이퍼와 세포를 긁어.
3. 10 ML 얼음 차가운 PBS와 prechilled 14 ML 둥근 바닥 원심 분리기 튜브로 전송에 세포를 resuspend.
4. 4에 400 ~ 600 XG에서 원심 분리하여 펠렛 세포 ° 5 분 C. 나는이 시점에서 몇 가지 플라스크에서 세포를 결합F가 필요합니다.
5. 얼음처럼 차가운 용해 버퍼 200 μL의 PBS 뜨는을 Resuspend 펠렛을 제거하고, 사전에 현탁액을 전송하면 1.5 ML 에펜 도르프 튜브를 냉각.
6. 지역의 과열을 최소화하기 위해 얼음에 세포를 유지합니다. 미리 냉장 팁 2-3 밀리미터를 사용하여 30 % 진폭에서 초음파의 배 10 초 펄스로 세포를 용해. 표면 아래 끝이 거품을 최소화 할 것. 대신에 30 분 동안 얼음에 세제가 들어 버퍼와 부화를 사용하는 경우이 단계를 생략합니다.
7. 생리 식염 농도 (100 mM의 NaCl을) 5 M NaCl을 사용하여 필요한 경우를 포함 할 해물 솔루션을 수정합니다.
8. 10 분 동안 4 ° C에서 약 26,000 XG에서 원심 분리하여 해물를 수집합니다.
9. 최적의 해물 희석 (아래 3 항에 설명) 한 적정 (사전 희석 해물 일반적으로 약 300 μL)에 필요한 해물의 양을 결정합니다.
10. 조사 대상 단백질 (-80 ° C, 대부분의 경우)에 적절한 온도에서 나누어지는 해물 및 저장.

2. MST 버퍼 선택 및 준비

1. 단백질 - 리간드 상호 작용이 버퍼 상태에 따라 달라집니다 때문에, MST 버퍼 구성은 특정 시스템의 특성에 따라 선택됩니다. 적어도 두 개의 서로 다른 버퍼를 테스트하기 위해 일반적으로 유리하다.
2. 2 배 MST 버퍼를 준비합니다. 그리고 트리스 염산 (250 MM 트리스 염산, 산도 7.4, 750 MM의 염화나트륨, 50 HEPES (; 25 mM의 MgCl _2; 500 mM의 NaCl을 0.25 % NP-40 250 MM의 HEPES, 산도 7.4) : 우리는이 두 가지 성분과 좋은 경험을했다 mM의 MgCl _2, 0.05 % 트윈 - 20). BSA의 추가 (최종 바인딩 혼합물을 5 %)은 플라스틱 튜브와 유리 모세 혈관에 단백질의 부착을 방지 할 수 있습니다. NaN의 ₃ (0.5 mM의)도 미생물의 성장을 방지하기 위해 포함 할 수 있습니다.

3. 최적의 해물 희석의 결정

1. 파장 LED 구동 소스를 선택 λ MST 기기에 = 470 nm의.
2. 세륨을 가진 모세 혈관을로드2 희석 MST 버퍼와 배 추출 것이다.
3. MST 기기의 제어 소프트웨어의 "모세 혈관을 찾아"작업을 수행합니다. 희석 해물에 최적의 형광 범위는 400 ~ 1,500 형광 단위에서이다.

4. 최적의 리간드 농도 범위의 결정

1. 리간드의 높은 농도는 예상 해리 상수보다 적어도 20 배 이상이어야한다.
2. 낮은 리간드 농도는 형광 단백질의 몰 농도 이하이어야한다.

리간드 농도 범위 추정을위한 NanoTemper 기술 농도 측정기 도구를 참조하십시오.

5. 셀 해물과 리간드 희석의 준비

1. 얼음에 0.5 ML의 LOBIND 원심 분리기 튜브의 필요한 숫자 (보통 10-16)와 튜브 랙을 배치합니다. 각 튜브의 바닥에 MST 버퍼의 피펫 25 μL. 먼저 욕조에 리간드 원액의 25 μl를 추가E (# 1, 리간드 높은 농도)와 튜브의 나머지 부분을 사용하여 리간드의 시리얼 두 배 희석을 수행합니다. 얼음에 리간드 샘플 랙을 유지합니다.
2. 해동 세포가 얼음에 천천히 해물.
3. 결합 반응에서 형광 표적 단백질의 최적 수준을 제공하기 위해 MST 버퍼와 세포 해물을 희석. 최종 단백질 농도는 예상 K _D 이하에 가까워 야합니다. 그것은 최종 솔루션에 형광 카운트 필요한 번호를 얻기 위해 조정해야합니다. 해물에 GFP-STAT3 농도의 결정에 대해, 기기는 형광의 도움으로 보정 하였다. 해물에서 GFP의 몰 농도는 각각 형광 및 EGFP 양자 수율, 0.85 및 0.61의 비율을 사용하여 결정 하였다. ¹⁵

6. 마이크로 Thermophoresis 바인딩 연구

1. MST 기기에 λ = 470 nm의와 LED 구동 소스를 선택합니다.
2. t의 장소 0.5 ML의 LOBIND 관리간드 시리얼 희석 샘플 튜브 건너편 우베 랙. 조심스럽게 각 튜브의 바닥에 세포 파쇄물의 15 μl를 추가합니다. 샘플의 손실을 방지하기 위해 튜브 벽을 만지지 않도록하십시오.
3. 세포의 파쇄와 해당 관에 높은 농도 (# 1) # 1 리간드 샘플의 15 μl를 추가합니다. 잘 섞어 피펫 팁을 변경합니다. 더 리간드가 포함되어야 한 최근 이미지, 제외 튜브의 나머지 부분이 단계를 반복합니다.
4. 마지막으로 튜브에 MST 버퍼 15 μl를 추가하고 잘 섞는다.
5. 튜브 # 1에서 바인딩 혼합물로 약 2 / 3의 첫 번째 모세관 채우기, 그것은 중심으로 솔루션을 이동하려면 기울 (용지함 입구에 가까운 위치)에 위치 # 1 모세관 트레이에 모세관을 배치 . 나머지 모세 혈관이 단계를 반복합니다. 모세관 끝은 더 이상 실험 왁스로 연결 할 수 있습니다.
6. MST 기기 내부의 트레이를 배치하고 기기의 도어를 닫습니다.
7. "모세 찾기"를 수행명령은 장비가 모세 혈관의 정확한 위치를 찾아 샘플의 형광을 측정하도록한다.
8. 형광 신호 강도에 따라 400-1,500 단위 간격으로 그것을 가지고 LED 전력 (10-100%부터) 조정합니다.
9. thermophoresis 실험을 수행 할 수있는 "시작"버튼을 클릭합니다. 하나 이상의 IR 레이저 파워는 특정 시스템을위한 최적의 온도 구배를 찾기 위해 실험 선택할 수 있습니다. 측정의 재현성을 보장하기 위해 모세 혈관의 동일한 세트 2-3 실행에서 데이터를 수집합니다. 그것은 16 모세 혈관의 한 세트를 실행하는 데 10-12 분 정도 소요.

7. 마이크로 Thermophoresis 데이터 분석

1. 분석 소프트웨어를 엽니 다.
2. 프로젝트 폴더를로드합니다. 나타난 정보를 실행 뷰어에서 선택은 특정 IR 레이저 파워의 thermophoretic 곡선에서 수집. 이러한 IR 레이저 파워 등 다양한 조건에서 수집 된 모든의 thermophoretic 흔적을 여는 옵션이 있습니다, P LED가타워를, 온도, 농도, 등. 한 번에 한 다음 전원을 켜거나 전환하여 분석에 대한 곡선을 선택하면 (실험의 이름을 클릭).
3. 평가 점수 그래프 창에서 T-점프 thermophoresis 또는 thermophoresis을 선택합니다. 파란색과 빨간색 선이 올바르게 배치되었는지 확인합니다. 표준 편차와 평균 점수를 획득하려면 "평균 사용"또는 별도의 실행은 "구별이 실행됩니다."
4. 해리 상수 맞는 플롯, 레이블 분자 농도 값 (맞는 윈도우 메뉴에서 "농도"광장 확인)를 입력하고 수정, "평균 사용"을 선택하고 곡선에 맞게. 의 표준 편차 K _{D 값은} 별도의 정보를 팝업 창에 나타납니다. 힐 방법을 사용하여 착용감을 플롯하려면, 힐 방법을 "평균"을 선택한 후 곡선에 맞게. 의 표준 편차 EC ₅₀ 선호도 값은이 경우에 표시됩니다. 때 포화 K _D 또는 언덕 "국경"의 기능도 활용 될 수있다바인딩 상태에 도달하지 않습니다.
5. 텍스트 파일의 평균 맞는 데이터를 저장하고 Excel로 전송할 수 있습니다.
6. 음모 F _규범 (정규화 된 형광), ΔF _규범 (다른 실험을 비교하는 경우 정규화 된 형광의 차이) 또는 부분 레이블 (적정) 분자의 농도의 함수로 (아래 식 참조) 바인딩됩니다.

분수 (복잡 분자의 비율) = (칼로리 (C) 언 바운드) / (바운드 - 언 바운드), 칼로리 (C)는 농도 C을 측정 thermophoresis 곳 바운드, 언 바운드 (분자가있을 때 언 바운드 상태에 대한 thermophoresis입니다 아니 복잡), 그리고 바인딩은 완전 구속 상태에 대한 thermophoresis입니다.

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결과

올리고 뉴클레오티드에 바인딩 비 인산화 STAT3 단백질의 유사성을 측정합니다.

STAT3-GFP를 발현 HEK293 세포는 DNA 결합 분석을위한 찬란 STAT3의 소스로 사용 하였다. 세포 용 해물은 RIPA 버퍼를 (20 × 10 ⁶ 세포 / ㎖)를 사용하여 제조 하였다. 결합 연구를 위해, 해물는 결합 반응 (20 NM)에서 형광 단백질의 최적 수준을 제공하기 위해 MST DNA-결합 버퍼 150X 희석 하였?...

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토론

단백질 발현 및 정제는, 그러나, 대부분의 현재 사용되는 방법으로 상호 작용 'K _D의 결정에 필요한 노동력 및 비용 단계입니다. MST의 응용 프로그램은 크게 상호 작용의 정량적 특성을 단순화하고 가속화함으로써 단백질 정제를 방지 할 수 있습니다. 그런 막 단백질과 전사 인자로하기 어려운 표현하고 정화 단백질의 경우 특히 중요한 이점을 제공합니다.

MST의 주...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
RIPA buffer	Millipore	20-188	Other manufacturer's buffers work as well
Protease inhibitors cocktail	Sigma-Aldrich	P2714
Monolith NT.115	NanoTemper Technologies GmbH	G008
Monolith NT.115 Capillary Tray	NanoTemper Technologies GmbH	T001
Monolith NT.115 Standard Treated Capillaries	NanoTemper Technologies GmbH	K002
NT Control software	NanoTemper Technologies GmbH	2.0.2.29
NT Analysis software	NanoTemper Technologies GmbH	1.4.27
Table-top refrigerated centrifuge	Eppendorf	5417R	Other microtube refrigerated centrifuges providing
Protein LoBind Tube 0.5 ml	Eppendorf	22431064