합성, 세포 전달 및<em&gt; 생체 내</em&gt; 덴드리머 기반 pH 센서의 응용 프로그램

요약

형광 센서는 생명 과학에있는 강력한 도구입니다. 여기에서 우리는 합성하고 살아있는 세포 및 생체 내에서의 pH를 측정하는 덴드리머 계 형광 센서를 사용하는 방법을 설명한다. 수지상 발판이 개선 감지 특성에 이르는 복합 형광 염료의 특성을 향상시킨다.

초록

형광 지표의 개발은 생명 과학 분야의 혁명을 표현. 유전자 인코딩 감지 능력을 가진 합성 형광체는 높은 공간과 시간적 해상도를 가진 생물학적으로 중요한 종의 시각화를 허용했다. 합성 염료는 높은 조정 기능과 측정 가능한 분석의 다양한 분야에 특별한 관심 덕분이다. 그러나 이러한 분자 (용해도가 타겟팅에 어려움이 종종 더 비율 계량 영상은 허용되지 않습니다) 작은 분자 행동과 관련된 몇 가지 제한 사항을 겪고 있습니다. 본 연구에서 우리는 덴드리머 기반 센서의 개발을 소개하고 살아있는 세포 및 생체 내에서, 시험관 내에서 pH를 측정하는 절차를 제시한다. 우리는 그 몇 가지 생물 의학 장치에 널리 사용되는 발판 만든 그들의 많은 바람직한 특성 (단 분산, 조정 가능한 속성, multivalency)에 대한 우리의 센서를위한 이상적인 플랫폼으로 덴드리머를 선택합니다. 형광의 pH의 활용덴드리머의 발판을 지표들이 감지 성능의 향상되었다. 특히 덴드리머 전시 세포 누출, 개선 된 세포 타겟팅 및 비율 계량 측정을 할 수 감소. 이 새로운 센서는 성공적으로 HeLa 세포 생활에 마우스 뇌의 생체 내에서의 pH를 측정하기 위해 사용되었다.

서문

특정 생물학적으로 중요한 분자를 라벨에 형광 분자의 사용은 완전히 우리가 생물 학적 시스템을 연구하는 방법을 변경했습니다. 위드 요즘 실시간 고해상도 생물학적 과정의 시각화를 허용 공 초점 현미경 세포와 생체 내에서 체외에서 생체 이벤트를 공부하는 가장 인기있는 방법 중 하나입니다. ¹ 관련 개선이 형광 지표의 개발에 의해 표현 된 누구의 형광 특정 분자 기업의 농도에 따라 달라집니다 즉, 염료. 특히 pH와 칼슘 지표로 인해 H ⁺ 및 CA 생물학 ^{2 +} 이온의 거대한 관련성에 세포 생리학의 연구에 큰 영향을 미쳤다. ^2,3

세포 내 targeti에있는 I)의 어려움 그러나, 현재 감지 염료의 대부분의 몇 가지 고유 제한과 같은 자신의 작은 분자 동작과 관련된NG, 물, 결과적으로 가난한 생체 적합성 II) 용해도;. 및 III) 세포의 누출과 긴 시간 경과 이미징 능력 ^4, 따라서 부족 또한, 다양한 프로브의 신호는 염료 농도에 의존 보정 할 수없는 (비 비율 계량 영상) 때문에, 세포 또는 생체 내에서 절대 측정이 불가능합니다.

우리는 최근 덴드리머 골격에 감지 염료의 공액에 기초하여 이러한 한계를 극복하기위한 간단하고 효과적인 방법을 설명했다. ⁵ 덴드리머 생물학적 응용을위한 매우 매력적인 특성을 갖는 단 분산 하이퍼 브랜치 폴리머이다. 특히 ^6가 몇개 수지상 구조가 개발되고 사용되어왔다 약 ⁷ 및 유전자 전달을 위해. ^{8 만} 아주 최근에 여러 그룹이 감지 장치를위한 발판으로 이러한 분자의 잠재력을 탐구하기 시작했다. ^9,10,11

이전에 우리는NHS-활성화 된 에스테르에 따라 다른 폴리아의 기능화 향해 락 합성 경로 (PAMAM) 발판을 설명했다. ¹² 접합체만을 정제로서 투석에 의해 단일 단계로 얻어 질 수있다. 흥미롭게도이 방법은 쉽게 수지상 또는 중합체 지지체의 다양한 적용 할 수있다. ^13,14

I)의 pH 표시 (예 : 플루오 레세 인) 및 II)의 pH에 의존 형광 부분 (즉, 로다 민) : 비율 적 영상 덴드리머를 달성하기 위해 두 번 표시 염료의 두 세트와 함께했다. 이것은 우리가 형광 및 로다 민 사이의 비율은 pH를에만 의존하고 더 이상의 프로브의 농도에서 정확한 산도 촬상을 수행 할 수 있었다. 수명이 측정이 비율 적 교정이 필요하지 않습니다 프로브 농도에 의존하지 않기 때문에이 문제에 대한 또 다른 흥미로운 접근 방식은 수명 기반 프로브의 사용. ^(15)에 의해 표현된다. 그러나, 난생etime 측정은 더 복잡 수단 설정이 필요하고 자신의 시간 해상도는 이렇게 자신의 잠재적 인 응용 프로그램을 제한, 빠른 생리 학적 프로세스 차선입니다.

세포 이미징을 수행하기 위해, 프로브는 세포질로 세포막을 가로 질러 전달 될 필요가있다. 덴드리머 때문에 크기와 친수성을 투과 막되어 있지 않으므로, 세포 내 전달은 전기 충격을 통해 달성 될 수있다. 널리 형질에 대한 생물학에서 사용되는이 기술에 의해, 표시 고분자 효율적으로 고품질의 영상을 수행하는 세포로 전달 될 수있다. 고분자 직접 세포질로 전달 될 때 더욱이, 전기 천공으로 덴드리머 내 이입에 관련된 합병증을 피할 수있다. 일렉트로 다른 덴드리머도 특정 표적 서열의 부재에서 세포 내부에 서로 다른 언어 버전을 보여줍니다 흥미롭게 후. ^5이 passiv에게전자 만 인해 덴드리머의 물리 화학적 특성에 따라, 대상, 세포 기관 고유의 pH 영상을 달성하기 위해 이용 될 수있다.

비례 이미징은 공 촛점 현미경을 사용하여 수행 될 수있다. 공유 돌기 발판에 접합 플루 오레와 로다 민은 개별적으로 몇 군데 있었다 및 픽셀 단위 비율의지도를 만들었습니다. ionophores에 의해 살아있는 세포에서 세포 내 산도를 제어하는​​ 몇 가지 절차가보고되었다. Ionophores는 세포막을 통해 이온을 수송 할 수 작은 소수성 분자, H ⁺ 이온에 대한 ionophores 같은 nigericin로 사용할 수 있습니다 및 덴드리머 기반 센서를 보정하는 데 사용할 수있는 ^16로 이러한 측정치가 관찰 된 것과 유사 산도에 선형 응답을 공개했다. 체외. 교정 세포 내 pH를 기초로 정확하게 측정 될 수있다. 이러한 측정은 덴드리머 기반 센서는 연구 H ⁺ homeost에 귀중한 도구가 될 수 있다는 것을 보여 주었다아시시는 살아있는 세포 병리학 과정에서 pH를 조절 오작동을 포함하는.

우리는 최근 덴드리머 pH 센서는 또한 마취 된 쥐의 뇌에서의 pH 촬상을 행하는, 생체 내에서 적용 할 수 있음을 보여 주었다. ¹⁷ 인해 생체 센싱 고품질 기술적 도전 생체 조직의 복잡한 환경. 여기에서 우리는 뇌의 정확한 pH를 이미징을 수행하기 위해 해결해야 할 중요한 문제에 중점을두고 생체 내 pH를 영상에 대한 실험 절차에 대한 자세한 설명을 보여줍니다. 이광자 현미경은 두 가지 이유 때문에 사용되어왔다 : ⅰ) 외광의 사용은 표준 공 초점 현미경의 조직 침투의 부족을 극복 할 수 있도록, II) 형광 및 로다 민의 광범위한 이광자 흡수은 동시 자극은 회피 허용 여기 두 파장의 사용과 관련된 합병증. 마우스 뇌의 pH를 측정했다성공적으로 수행, 센서는 쉽게 뇌 세포 외 공간에서의 pH의 변화를 유도 저산소증에 반응한다. 이러한 측정은 덴드리머 계 지표 성공적 동물 모델에서 생체 내에서의 pH의 생리 학적 및 병리학 적 변화를 강조하는 데 사용될 수 있다는 것을 보여준다.

프로토콜

1. 센서의 합성

1. 다음 섹션에서 우리는 PAMAM 덴드리머에 산도 지표의 활용에 대한 절차를 제공합니다. 동일한 프로토콜이 다른 아민 - 함유 덴드리머에 최소한의 변형으로 적용 할 수있다. ^5,17,13,14 시판 덴드리머 및 염료 더욱 않는 정화없이 사용할 수있다.
2. 무수 DMSO (50 μM 최종 농도)의 덴드리머를 녹인다. 무수 DMSO에 플루오 레세 인 NHS와 테트라 메틸 로다 민 - NHS (TMR)의 10mM을 재고 솔루션을 준비합니다.
3. 덴드리머의 용액에 형광 및 TMR의 원하는 금액을 추가합니다. 혼합물 중 몰비는 덴드리머에 로딩 염료의 양을 반영 할 것이다. 일반적으로 microcentrifuge 관에있는 G4의 PAMAM 덴드리머 용액 1 ㎖는 형광의 8 EQ (40 μL) 및 TMR의 8 EQ (40 μL)와 반응한다. 12 시간 동안 실온에서 용액을 교반 하였다.
4. 탈 이온수로 1:10 희석하고 반응을로드투석 백 (MWCO = 10 kDa의)의 혼합물. 저수지에서 자주 물을 대체하는 탈 이온수에 24 시간 동안 Dialyze.
5. 유리 병에 솔루션을 전송하고 동결 건조 24 시간 동안을. 보라색 ​​분말을 얻을 수 있어야합니다. 무게 고체 수득하고 10 μM의 최종 농도를 MilliQ 물에 녹여. -20 ° C에서 솔루션 및 저장을 나누어지는

2. 체외 pH 측정

1. 체외 교정 석영 큐벳에 PBS에서 덴드리머의 용액 500 ㎚ (2 MM의 인산)를 준비하고 있습니다. 적정 기간 동안의 pH의 급격한 변화를 방지하기 위해 매우 희석 PBS 버퍼 (2 ㎜)을 사용하는 것이 좋습니다.
2. 형광의 발광 스펙트럼 (EXC 488 NM) 및 TMR (EXC 550 NM)를 측정하고 양호한 신호 대 잡음 비율을 달성하기 위해 형광 계의 광학 설정을 최적화.
3. 모든 첨가가 큐벳을 흔들어 후 NaOH를 0.1 N 염산과 0.1 N.의 소량을 첨가하여 pH를 적정을 수행믹싱, 평형 1 분을 기다린 산도 미세 전극에 의해 pH를 측정한다. 형광 및 TMR의 발광 스펙트럼은 광 설정의 변경없이 모든 단계에 기록되어야한다.
4. 적정 산도를위한 대 형광 강도를 플롯. 로다 민 신호의 pH (<10 %)에 의해 영향을받지 않습니다. 형광 신호는 S 자형 곡선이어야하며 PK = 6.4의 단일 결합 모델을 설치해야한다.

3. 세포 배양 및 Electroporation에

1. 10 % 소 태아 혈청, 100 U / ㎖ 페니실린 및 100 ㎎ / ㎖ 스트렙토 마이신 (Invitrogen 사)로 보충 된 둘 베코 변성 이글 배지 (DMEM)에서 HeLa 세포를 연마한다. 가습 5 % CO ₂ 분위기에서 37 ° C에서 세포 배양을 유지합니다.
2. 덴드리머 일렉트로의 경우, 세포가 컨 플루 언트 될 때, 미디어를 제거하고 DPBS (둘 베코 인산염 완충 식염수)를 사용하여 세포를 씻어. DPBS를 제거하고 트립신-EDTA를 추가합니다. 트립 중화매체에 포함 된 혈청하지만 항생제를 추가하여 죄. 실온에서 2 분 동안 900-1,200 rpm에서 원심 분리기. 용지를 제거하고 DPBS를 사용하여 알약을 씻어.
3. 세포를 세어 4 × 10 ⁶ 세포를 취할. 실온에서 2 분 동안 1,200-1,500 rpm에서 원심 분리기.
4. (microporator 제조업체에서 제공) microporation 완충액 200 μL에서 세포 펠렛을 재현 탁하고, 1.5 ml의 마이크로 원심 분리 튜브에 세포를 옮긴다.
5. 재현 탁 세포로 덴드리머 수용액을 추가합니다. 샘플 당 필요한 덴드리머의 양은 PAMAM 타입 (양이온과 중성 덴드리머 2 μM에 대한 일반적으로 250 nm의)에 따라 달라집니다.
6. microporation 튜브 (microporator 제조업체에서 제공) 일렉트로 버퍼를 추가합니다. 100 μL 볼륨 크기의 일렉트로 끝을 가진 세포와 덴드리머 혼합물을 피펫. 피펫 스테이션에 microporator 피펫을 삽입합니다. microporation의 펄스 조건을 설정 : 펄스 전압 = 1,005 V, 펄스 떨어 졌일 35 밀리 초 =; 펄스 수 = 2.
7. 1,200 rpm에서 5 분 동안 1.5 밀리리터 microcentrifuge 관 원심 분리 세포 펄스 전송 세포 배지에서 덴드리머의 과잉을 제거 후. 새로운 배지와 함께 접시 35mm 유리 바닥 요리 상에 electroporation하여 세포의 10 μL (WillCo - 요리 GWSt-3522) w / 항생제 오.

4. 생활 헬라 세포의 pH를 감지

1. 일렉트로 후 공 초점 현미경 12 시간과 이미지 세포.
2. 플루오 레세 인 및 로다 민을위한 기본 필터 세트가 사용될 수있다. 550 ㎚, 580 ㎚ ​​내지 650 nm의 빨강 채널 - 파장 가변 필터는 500에서 녹색 채널을 사용할 수 설정되어있는 경우. 로다 민은 하나 543nm 또는 561 레이저 줄을 이미지화 할 수있는 동안 488nm에서 여기가 형광에 최적입니다.
3. 시험편에 초점 레이저 전력을 조정하고 검출기는 신호 대 잡음비를 최대화하도록 얻는다. 일렉트로 이었다면 성공적인 세포는 두 채널에서 밝은 형광해야한다.현지화는 사용 된 덴드리머의 크기와 비용에 따라 달라집니다. 종종 일부 리소좀 현지화 (작은 핵 주변 소포가)에 의한 엔도 시토 시스 또는 구획화에 존재한다. 리소좀 현지화가 지배적 인 경우, 즉 형광의 대부분은 소포 내부 지역화와 가난한 신호가 세포질에서 관찰되며,이 의미 독성 측정을 폐기해야합니다. 획득 여러 이미지를 필요로하는 경우, 순차적으로 두 개의 채널을 획득하고 이미지 품질을 개선하기 위해 이미지를 평균.
4. 교정 클램프 셀 pH가 상이한 pH에서 ionophores로 버퍼를 이용하여 전술 한 바와 같이 pH를 당 적어도 20 세포를 얻기위한. 절차에 대한 자세한 설명 및 버퍼의 구성을 위해 Bizzarri 및 동료를 참조하시기 바랍니다. ¹⁶ 우리는 pH가 5.5에서 pH가 7.5 이상 5 점을 측정하는 것이 좋습니다. 6 아래 pH가 세포에 독성하지만 시간이 짧은 금액에 대한 허용, 우리는 가능한 한 빨리 이미지를 수집하는 것이 좋습니다. 만약 세포세포 사멸의 조짐을 보여, 세포를 폐기하고 다시 시작합니다.
5. ImageJ에 또는 데이터 분석을위한 유사한 소프트웨어를 사용합니다. 녹색과 적색 채널의 이미지를 가져, 배경을 빼고 도구 "이미지 계산기"와 픽셀의 비율을 영상으로 픽셀을 만듭니다.
6. 원하는 셀을 선택이자 (ROI)의 영역을 그리고 세포 내 녹색에 붉은 비율을 측정합니다. 획득 한 모든 이미지를 분석 한 후 pH를 대 비율을 플롯. 5.5-7.5 범위에서 경향은 선형이어야한다. 얻어진 점의 선형 피팅은 pH로 녹색 대 적색의 비율을 변환하는 데 사용되는 검량선을 줄 것이다.
7. 또한 제어 등 여러 가지 치료 세포 (아무 ionophores)를 획득하고 획득 된 보정 곡선으로 pH를 계산하려고합니다. 7.2과 7.4 사이의 값을 얻을 수 있어야합니다.

5. 생체 시료 준비

1. 실험은 출생 후 D 사이에 C57BL/6J (남성과 여성)에 실시 하였다바깥 (28) 및 (70). 우레탄의 복강 내 주사 (즉, 에틸 카바 메이트) (20 % 생리 식염수에있는 W / V, 20 ㎎ / ㎏ 우레탄)와 마우스를 마취. 동물은 같은 마취의 심장 내 주사 다음에 우레탄의 과다 복용과 실험 후 희생되었다.
2. 수술하는 동안 대뇌 피질의 스트레스 반응과 대뇌 부종을 줄이기 위해 덱사메타손 인산 나트륨 (2 ㎎ / ㎏ 체중)의 근육 내 주사를 수행합니다.
3. 동물의 머리를 면도하고 두피에 2.5 % 리도카인 젤을 적용합니다.
4. 두 반구의 두개골을 덮고있는 피부의 플랩을 가위로 잘라 사용
5. 식염수에 노출 된 뼈를 세척하고 부드럽게 집게를 사용하여 골막을 제거합니다. 이 접착제와 함께 준수하는 치과 용 시멘트를위한 더 나은 기반을 제공 할 것입니다.
6. 중앙 이미징 챔버와 주문품 스틸 헤드 게시물을 적용하고 평면에서 시아 노 아크릴 레이트로 접착제를 약 I의 대뇌 피질의 영역에 대한 두개골과 평행nterest 화이트 치과 시멘트 (Paladur) 제자리에 고정합니다.
7. 관심 영역에 걸쳐 드릴 직경 2 ~ 3 ㎜의 개두술을 수행하기 위해 마우스의 머리를 고정한다.
8. 수술, 경막 눈물, 또는 출혈 중에 피질의 발열을 최소화하기 위해보십시오.
9. 멸균 ACSF (126 mM의 NaCl을, 3 밀리미터의 KCl, 1.2 mM의 KH ₂ PO _4, 1.3 mM의 _망초, 26 mM의 _탄산 수소 나트륨, 2.4 mM의 _{염화칼슘과} superfused 피질을 유지, 15 mM의 포도당, 1.2 mM의 HEPES 증류수 H ₂ O , 산도 = 7.4).

6. 마우스의 뇌에있는 산도 영상

1. O ₂ 풍부한 공기를 제공하는 실험 보조 동물의 호흡시. 산소는 80 %까지 충실. O ₂ 분압 및 흐름은 종종 적절한 호흡 원조를 구하는 조정된다. 피드백 제어 난방 담요로 37 ° C에서 몸의 온도를 일정하게 유지.
2. 두 사진의 목적하에 강주 통해 동물 고쳐N 영상 설치.
3. 뇌 피질 센서를 주입하기 위해 덴드리머의 용액 (1 μM)와 함께의 AgCl 전극 (팁 직경 4mm)를 함유하는 유리 피펫을로드. 전극은 세포 분야의 잠재력을 기록 할 수 있습니다.
4. 미세 주입 설정으로 약 150 μm의 깊이에서 피질에 피펫을 삽입합니다. 0.5 PSI의 압력에서 1-2 분 동안 주입한다.
5. 이미징을위한 광학 설정을 최적화합니다. 레이저 파워는 광표백 및 광 손상을 최소화하기 위해 조정해야합니다. 채용 전형적 레이저 파워는 이전의 교정은이 전압이 최상의 S / N 비율을주는 것으로 나타났다 이후 mW의 PMT 및 이득이 667 V로 일정하게 유지 하였다 약 20이다.
6. 영상의 경우 820 nm에서 센서를 자극하고 표준 FITC와 TRITC 필터를 통해 형광 및 로다 민 형광을 동시에 탐지.
7. 시간이 해결 된 측정은 2 Hz에서 시간 경과 시리즈를 획득.
8. 배경 보정 LASE과 어두운 프레임을 취득 들어R 셔터 통상 전자에 의해 추가 및 PMT의 대좌에 발생하는 평균 열 잡음을 측정하는 폐쇄.
9. 데이터 분석을 위해 4 장에서보고 된 절차를 따릅니다.

결과

도 1은 상이한 수지상 비계에 염료를 감지 공액의 개략도를 나타낸다. 얻어진 지표 시판품으로부터 한 락 합성 단계에서 얻을 수있다. 아민 함유 덴드리머는 DMSO의 NHS-활성화 염료와 반응 투석에 의해 정제된다. 이 일반적인 절차는 이미 성공적으로 여러 덴드리머의 라벨에 사용되었습니다 I) PAMAM 덴드리머의 세대 2, 4, 6, ¹² 페 길화 된 PAMAM 덴드리머 ^(17)와 PEG-돌기 하이...

토론

덴드리머 기반 센서와 성공의 pH 이미징을위한 중요한 단계는 다음과 같습니다 I) 올바른 돌기 발판의 선택과 그것을 복합 지표의 수와 세포 또는 생체 내에서 센서 배달 프로토콜의 II) 최적화.

합성 절차는 매우 쉽고, 모든 아민 - 함유 하이퍼 브랜치 폴리머에 거의 적용 할 수있다. 센서는 하나의 단계에서 시판 덴드리머 및 NHS-활성화 된 염료로부터 얻어 질 수?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
PAMAM G4	Sigma-Aldrich	412449
Carboxyfluorescein NHS ester	Life technologies	C-1311
TMR NHS ester	Life technologies	C-1171
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
Dyalsis bags	Spectrum Labs	132117
WillCo Dishes	WillCo Wells	GWSt-3512
Urethane	Sigma-Aldrich	U2500