둔화 가속과 반전 꿀 꿀벌 모델에서 노화와 표본을 얻기

요약

꿀벌 노동자, 노화는 사회적 행동보다는 연대기 나이에 따라 달라집니다. 여기에서 우리는 매우 다른 노화 패턴과 노동자 유형을 얻을과 세포 노화를 분석 할 수있는 방법을 보여줍니다.

초록

높은 사회적 동물의 사회는 밀접한 관련이 개인 사이의 광대 한 수명의 차이가 있습니다. 사회적 곤충 가운데, 꿀벌은 수명과 노화의 가소성이 사회적 요인에 의해 설명되는 방법을 연구하는 최선의 설립 모델입니다.

꿀벌의 노동자 계급은 꿀과 꽃가루를 수집하는 무리 경향 간호사 꿀벌, 및 초지 기계 꿀벌이 포함되어 있습니다. 이전 작업은 뇌 기능과 비행 성능이 간호사보다 초지에 더 빠르게 senesce 것으로 나타났습니다. 초지 다시 간호 업무에 복귀 할 때 그러나, 뇌 기능, 복구 할 수 있습니다. 가속 반전 기능 노화의 이러한 패턴은 단백질 풍부의 변화와 면역 기능, 변경된 대사 자원 수준에 연결되어 있습니다. 비텔로 제닌, 호르몬 조절 및 세포 방어에 적응 기능을 가진 난황 단백질은 노동자의 다른 노화의 역 동성을 제어하는​​ 네트워크의 중요한 조절 요소로 역할을 할 수있다.

여기에서 우리는 간호사와 초지의 출현을 모니터링하고, 이상 수명이 간호사로 일반적으로 수명이 짧은 초지의 역전을 포함, 조작 할 수있는 방법에 대해 설명합니다. 우리의 대표적인 결과는 유사한 연대기 연령 개인이 실험 조건에서 초지와 간호사 꿀벌로 분화 방법을 보여줍니다. 우리는 다시 간호사로 초지에서 행동 반전의 유효성을 검사 할 수있는 방법을 예시. 마지막으로, 우리는 세포 노화가 리포 푸신의 축적, 노화의 보편적 인 바이오 마커를 측정하여 평가 할 수있는 방법을 다른 보여준다.

사회적 영향을 링크 할 수 있습니다 메커니즘을 연구하고 소성 노화를 들어,이 프로토콜은 관련 샘플 자료를 확보하고, 미래 연구간에 데이터의 비교 가능성을 개선하기 위해 설정하는 표준화 된 도구를 제공합니다.

서문

높은 사회적 동물의 복잡한 식민지 구조는 생식 계급의 상호 작용을 통해 유지되고, 다른 사회 작업 행동과 일반적으로 비 재생 노동자의 도우미 계급. 다른 노동자에 특정 생리 학적 적응은 별개의 SIB 관리 동작을 가능하게하고, 또한 극단적 인 수명의 차이로 연결되어 있습니다. 꿀벌과 두더지 쥐 사회성이 가속 무시할 또는 ^{1-3 노화} 반전의 패턴에 연결하는 방법을 연구하는 가장 좋은 개발 동물 모델을 나타냅니다.

꿀벌 식민지에서, 하나의 알을 낳는 여왕은 음식의 무리, 사료 경향이 노동자의 수천에 의해 지원되고, 체온 조절이나 위생 행동 ^4를 지키고에 종사. 이 노동자 중 극히 단명 기계, 중간 간호사 꿀벌, 및 긴 수명과 겨울 (diutinus) 꿀벌입니다. 개인은, 그러나, 영구적이에요 특정에 바인딩되지 않습니다rker 형,하지만 유연한 행동 개체 발생을 표시 : 그들은 ( "시간 카스트") 또 다른 하나의 사회 작업 동작에서 변경합니다. 풋내기 꿀벌은 결국 외부 꼴로 변경할 수있는, 무리 경향 간호사 꿀벌을 변경할 수 있습니다. 그러나 풋내기 둥지 꿀벌은 긴 수명 겨울 꿀벌로 변환 할 수 있으며, 수명이 짧은 초지도 일반적으로 더 이상 수명이 간호사로 되돌릴 수 있습니다. 극단적 인 (겨울 꿀벌) 및 중간 (간호사 꿀벌) 수명을 가진 근로자는 풍부한 자원과 식량 생산 및 저장 기관을 잘 개발 - ^(1,5 검토) 수명이 짧은 초지에 반대. 그러나, 개별 수명의 규정이 개인의 자원 균형 간단한 변경을 넘어 것이이 같은 젤리 생산 ^6, 호르몬 제어 ^7, 면역과 비 재생 노동자 계급의 다양한 적응 기능이 난황 단백질에 대한 연구에 의해 제안 ⁸ 항산화 방어 ^9.

F의 패턴후각 설립하고, 다른 뇌 모터 기능 ^10-13 등 unctional 감소 (노화) 노동자 중 거울 수명 격차. 수명이 긴 겨울 꿀벌 ^(15)의 검출 감소 (무시할 노화)의 부족과 반대로 특히, 꼴의 두 주 후 학습 기능의 상당한 감소, 초지 ^14에서 비슷한 사망률의 진행을 일치합니다.

우리는 모니터링 및 노화 형 전환에게 ^{8,16,17 조작을} 허용 설립 실험 패러다임에 적응 유연성 노화의 분자 지문을 식별합니다. 연대기 나이와 노화에 근로자 형 특정 사회적 행동의 효과를 분리 할 수​​있는 샘플을 구하는 방법 1 세부 사항을 실험. 실험 2는 둔화 노화 역학 간호사 꿀벌에 가속과 초지의 역전을 설명합니다. 실험 3 anatomica에 의해 세포 노화의 영향을 프로빙에 대한 접근 방식을 제공합니다세포 노화 (리포 푸신) ^{18 일} 설립 된 바이오 마커의 L 정량화.

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프로토콜

1. 연대기 나이에서 노화 디커플링

이 절에서는 같은 연대 세 ( "단일 연령대")와 둥지 꿀벌의 코호트를 공유 식별 개인의 코호트로 구성 더블 일대 식민지의 설정에 대해 설명합니다. 단일 연령대의 같은 세 사람은 결국 서로 다른 노화 역학과 다른 노동자 유형으로 구분됩니다 - 이러한 가속 기능 저하로 둔화와 초지 기계 꿀벌 간호사 꿀벌입니다. 모든 절차는 하나의 실험 집단에 대해 설명합니다. 우리는 그래서 콜로니 효과 (두 복제 설계)에 대해 제어 될 수있는 적어도 두 개의 콜로니에 대해 실험을 수행하지만 복제합니다 조언한다.

1. 이중 코호트 식민지에 대한 하이브 상자를 준비 : 꿀이 두 음식 빗을받는 하나의 일반 하이브 상자, 꽃가루와 다른 음식 빗, 그리고 두 개의 빈 빗을 준비합니다. 3,000 개 이상의와 성관계 여왕뿐만 아니라 기증자의 식민지를 찾을 수 있는지 확인둥지 꿀벌. 두 나중에 소개합니다 (1.3).
2. 획득 및 유사 연대기 연령과 개인을 표시 : 등장 직전에 밀봉 무리와 빗를 수집합니다. 하나의 복제의 경우 3,000 ~ 5,000 덮인 무리 세포의 총 빗를 수집 할 전망이다. 각 모성 유전자형 (하이브 원)의 왜곡 분포를 방지하기 위해 적어도 세 가지 다른 하이브 소스에서 무리의 균형 금액을 사용 복제에 대 한.
   1. 60 % ~ 70 % 상대 습도 34 ° C로 설정 인큐베이터에 무리 빗 놓습니다. 새로운 종족 탈출 할 수없는 방식으로 빗을 저장해야합니다.
   2. 꿀벌 이틀 동안 등장하자 흉부 (예 : 유니 POSCA, 미츠비시 연필 (주))에 작은 페인트 태그로 이러한 꿀벌을 표시합니다. 페인트 표시가 하나의 연령대 (출현 일)의 꿀벌을 확인하실 수 있습니다 및 기타 복제 식민지와 구별 할 수 있습니다.
3. 나는의 일대를 포함하는 더블 일대 식민지를 설정dentified, 단일 연령 꿀벌 : 하루에 젊은 꿀벌이 표시되어있다가, 볼 ((. 토론의 제 1 절 비교), 그리고 이전에 제조 된 하이브 상자에이 표시되지 않은 꿀벌을 추가 기증자 식민지에서 약 2,500-3,000 둥지 꿀벌 수집 ) 1.1 단계. 후자의 사람들은 알 수없는 둥지 꿀벌 코호트를 구성합니다.
   1. 처음에는 여왕 케이지 (시판)에 국한됩니다 여왕을 추가합니다. 식용 사탕 (예 : Apifonda, Südzucker AG, 만하임 / Ochsenfurt의, 독일) 일벌 천천히 여왕을 해제 할 수와 케이지를 밀봉.
   2. 하나의 연령대를 구성합니다 새로 등장하고 표시 꿀벌을 추가합니다. 이러한 꿀벌은 개인 전용으로 표시되고, 모든 다음 단계를위한 포커스 그룹이다.
4. 발병을 채집하고 초지 표시 모니터링 : 발병과 단일 연령대의 간호사 - 투 - 초지 기계 전환의 역 동성을 평가하기 위해, 먹이를 찾아 다니는 활동 전자의 인구 통계 학적 발전을 모니터링각 식민지에 대한 매우 다른 일. 식민지 (그림 1)을 설정 한 후 5 일 카운트 시작합니다.
   1. 고정 된 시간에서 3 × 20 ​​분의 관찰 기간 내 항공편 (입구 카운트) 꼴에서 돌아 꿀벌의 총 수를 계산합니다. (토론 참조) 방향 항공편의 기간 동안 꿀벌 계산하지 않도록해야합니다.
   2. 입구 카운트 (> 100 입구 카운트 / 일) 개시 상당한 꼴 활동을 표시하는 경우, 초지 마킹 시작합니다. 이렇게하려면, 하나의 연령대 (단일 표시 개인)의 초지는 처음 꼴 항공 돌아온 두 번째 페인트 표시가 나타납니다. 이 페인트 표시가 발병을 채집의 날을 지정하고, 이후 각 초지 기계의 꼴 나이를 식별 할 수 있습니다.
   3. 꿀벌의 충분한 숫자가 표시 될 때까지 매일 표시를 반복합니다. 이러한 꿀벌은 일반적으로 23 일 후에, 숙성 된 후 표시 초지의 충분한 수를 추정하는, 더 이상 50-10 % 이상의 회수율을 기대할꼴.
5. 샘플링 : 모든 초기 표시 꿀벌이 비슷한 연대 기적 나이를 가지고 있기 때문에 초지가 ≥ 14 일 동안 채웠을 때, 간호사 및 이전 초지의 나이와 일치하는 그룹이 동시에 수집 할 수 있습니다.
   1. 단일 마크 간호사 꿀벌은 벌통에서 수집, 간호 행동 (오픈 브루 셀에 내려 놓고 머리와 먹이와 애벌레의 청소)에 의해 식별됩니다.
   2. 매일 먹이를 찾아 다니는 활동을 시작하기 전에 두 번 표시 일벌은 벌통에서 수집됩니다.
   3. 충분한 환기를 제공 케이지 (튜브, 박스)에 꿀벌을 수집하고, 추가 처리 될 때까지 어두운 유지. 또한, transcriptomic, 성적인 또는 프로테오믹스 연구에 직접 액체 질소에 동결 꿀벌 웁니다. 모든 테스트 그룹에서 개인의 균형 번호를 수집하고 식민지를 복제합니다.

2. 하이브의 인구 <변경 속도가 느려 노화와 노동자에 대한 신속한와 노동자의 반전/ P>

이 섹션 둔화 노화 (간호사 꿀벌) 근로자에​​ 대한 가속 노화 (초지) 근로자의 반전이 수행되는 방법에 대해 자세히 설명. 초지는 일반적으로 무리 케어에 종사 간호사 꿀벌의 부족을 경험 할 때 이러한 행동 반전은 유도된다. 간호사 꿀벌 분획 한 하이브 ( "간호사 유래") 및 초지 기계의 일부와 또 다른 하나는 ( "초지 기계 유래") : 복귀 절차는 하나의 식민지가 두 두드러기로 복제 분리됩니다. 성공적으로 반전, 플라스틱 가능한 증상과 반대로 노화 복귀 노동자, 지속적인 기계, 지속적인 간호사 꿀벌과 신입 초지와 하나의 연령대에서 공부 할 수 있습니다 후. 이전과 같이, 하나의 연령대가 아닌 정체 불명의 둥지 꿀벌의 일대의 확인 꿀벌, 실험 포커스 그룹을 구성한다.

1. 준비 : 이전 섹션에 설명 된대로 간호사 (싱글 표시) 및 초지 (더블 표시)와 두드러기 복제는 사용할 수 있습니다. 복귀가 완료된 후 충분한 검색을 보장하기 위해 복제 식민지 미만 500 표를 초지로의 복귀를 시작하지해야합니다.
   1. 회복 후 검사 그룹의 안전 확인을 위해 원래 하이브 전체 초지 기계의 인구가 복귀하기 전에 전원 표시되어 있습니다하는 것이 중요합니다. 다음 절차는 하나의 복제에 대해 설명합니다.
   2. 복귀 전날, 초지 기계 파생 하이브에 대한 하나의 추가 하이브 상자 (단계 1.1 참조) 준비합니다. 기증자 하이브에서 두 왕비와 두 종족의 빗을 찾습니다. 실험 식민지로 전송하기 전에이 빗에서 모든 성인 꿀벌을 닦아내. 하나 갇힌 여왕 (단계 1.3 참조) 한 무리 빗 원래 하이브 상자에 여왕과 무리 빗을 대체합니다. 여왕과 무리 빗의 다른 세트는 새로운 하이브 상자 다음날 사용됩니다. 모두 원본과 새로운 하이브가 있는지 확인하는 것이 좋습니다 새로운 종족 빗과 외계인 여왕의 유사 할당 분리 초지와 간호사의 동일하게 경험 하이브 큐 ( "하이브 냄새")을 변경합니다.
2. 복귀 : 아침에 바로 복귀하기 전에, 초지 기계에서 파생 된 부분을 수신 할 새 상자에 갇힌 여왕과 무리 빗을 추가합니다. 피크 먹이를 찾아 다니는 시간이 시작될 때까지 기다립니다. 그런 다음 적어도 100m 거리에 원래 위치에서 표시 초지와 간호사 꿀벌 원래 식민지를 이동합니다.
   1. 원래 위치에서 무리 만 여왕 초지 기계 파생 하이브의 새로운 상자를 설정합니다.
   2. 일벌은 탈구 원래 하이브 상자를두고, 원래의 위치로 다시 머리 것입니다. 초지가 둥지 꿀벌의 초지 기계 인구의 분리를 완료하기 위해 다음을 달성하기 위해 2 시간 동안 원래 위치로 복귀 할 수 있습니다.
   3. 그런 다음, 분리를 종료 원본을 닫고, 지금 하이브를 "간호사 유래", 최소 3 km 거리 양봉장에 전송합니다.
3. 성공적인 사회 작업에 대한 하이브 유지 보수 및 모니터링반전 : 건강, 오픈 무리 정기적으로 실험 두드러기를 확인합니다.
   1. 식민지 조작 후 첫 일 동안 잠재적 인 병원체의 부하를 줄이기 위해 무인 죽은 무리를 교체합니다.
   2. 복귀 실험 (그림 2) 완료 될 때 빗이 교체 될 때 또는 다시이 도입되기 전에 무리 빗의 사진을 촬영하고, 초지 기계 파생 하이브에서 성공적으로 반전의 유효성을 검사합니다. 이전에 상한선이 무리와 함께 오픈, 라이브 무리와 지역 초지 기계 파생 식민지에서 간호 활동의 믿을 수있는 마커입니다.
4. 샘플링 : 사회 반전을 동반 생리 효과 3~8일 초지와 간호사 후 검출 할 수있다을 분리 하였다.
   1. 우리는 반전이 시작된 후 팔일 모든 테스트 그룹, 즉 복귀 노동자와 계속 초지 (초지 기계 파생 하이브),뿐만 아니라 계속 간호사와 새로 영입 초지 (간호사 파생 하이브를) 샘플링 조언한다.
   2. 안부단계 1.5에 설명 된대로 lect 샘플.

3. 리포 푸신의 정량화하여 작업자 형 특정 세포 노화 패턴 분석

리포 푸신은 세포 노화의 보편적 인 바이오 마커입니다. 고유 축적 제품으로, 리포 푸신의 특정 형광도는 (방출 _최대 = 530-650 nm의) 검출 ¹⁸ 사용할 수 있습니다.

1. 해부 및 고정 : 움직임까지 얼음에 칠 꿀벌, 제거하고 원하는 조직 샘플을 해부하다.
   1. 4 ℃에서 하룻밤 배양을 위해, 정착에 (산도 7.2 인산염 완충 식염수, PBS에 4 % 파라 포름 알데히드)을 전송
   2. PBS에서 샘플을 3 번 씻으십시오.
2. 조직 처리 및 설치 : 진동 블레이드 마이크로톰, 예를 들면 라이카 VT 1000S (라이카 생물계, Nussloch, 독일)를 사용하여 예를 들어, 더 이상 40 ㎛ 이상의 두께 섹션으로 조직 샘플을 잘라.
   1. 청소를 들어, 30 % 글리세롤 (PBS)에서 하룻밤 조직 섹션을 품어, 50 % 글리세롤 (PBS)의 또 다른 2 시간.
   2. 50 % 글리세롤 (PBS)에서 현미경 슬라이드에 섹션을 탑재합니다. 장기 저장 씰 커버 매니큐어 전표.
3. 이미지 수집 : 리포 푸신를 감지하기 위해, 우리는 λ = 514, 561nm 또는 여기 비슷한을 가진 레이저 라인을 제공하는 레이저 스캐닝 공 초점 현미경을 사용하여 제안하고, 검출기의 대역폭이 570-650 nm의 설정으로.
   1. 리포 푸신의 더 나은 식별을 위해, 두 번째 채널을 포함하고, 짧은 파장의 스펙트럼에서 동시 검사를 수행 (여기 = 405 nm의; 방출 = 410-450 nm의). 긴 파장 채널 인해 autofluorescent 기관 및 기타 비 과립 구조로 세분화 리포 푸신를 모두 공개뿐만 아니라, 불특정 "배경"합니다. 둘째로, 더 짧은 파장 채널은 불특정 형광도를 공개 아니지만 리포 푸신 것이다. 따라서, 리포 푸신 식별 facili이 될 수 있습니다 둘 중 하나만 리포 푸신 특정 형광으로 과립을 공개, 두 채널의 신호를 비교하여 tated.
   2. 고해상도 이미지의 획득은 40X 배율 이상, 1.25 이상, 바람직하게 개구 수 대물를 사용. 스캔 이미지는 약 100 × 100 × 10 μm의 ³ 차원으로 스택. 모든 개인과 조직 샘플은 여러 이미지 스택으로 표시해야합니다.
   3. 기술적 편차로 인한 인트라 개인과 개인간 편차를 줄이기 위해 항상 레이저 출력 및 검출 감도를 일정하게 유지.
   4. 하루 하루의 기술 변화에 의해 편견을 줄이기 위해 몇 가지 검사 각 세션에서 모든 테스트 그룹의 동일한 샘플 번호를 검색합니다.
4. 이미지 처리 : 현미경 이미지 스택의 고급 처리 할 수​​있는 모듈과 소프트웨어 패키지를 사용하여, 예를 들어 ImageJ에 (건강, 베데스다, 메릴랜드, 미국의 미국 국립 연구소,gej.nih.gov / IJ / "대상 ="_blank "> http://imagej.nih.gov/ij/).
   1. 3D 이미지 스택의 각 차원의 최대 투사를 생성합니다.
   2. 고주파 노이즈를 감쇠하고, 리포 푸신 과립의 크기와 구조를 보존하기 위해 적당한 커널 크기가 가우스 필터를 적용한다.
   3. 리포 푸신의 식별 (단계 3.2 참조) 용이하게하기 위해 두 색상 채널을 병합합니다.
5. 이미지 분석 : 정량 단계를 수행하는 주체가 그룹 ID를 테스트 할 장님이 될 것이라고 확신합니다.
   1. 모든 이미지에 대해 먼저 관련 구조를 포함하고, 다른 이미지에서의 ROI와 유사한 크기를 가지고 관심 (ROI)의 영역을 선택합니다.
   2. 그런 다음 각 ROI를 나타내는 리포 푸신 과립의 원하는 번호를 선택합니다. ROI 내에 리포 푸신 과립을 선정 할 때, 다음과 같은 규칙의 애플리케이션은 주관적인 바이어스를 감소시킬 것이다.
      1. 첫 번째 granu을 선택하기위한 일관성있는 위치를 선택합니다르. 이것은 예를 들어, ROI의 가장 왼쪽 가장자리와 가장자리에 가까운 과립이 항상 우선 선택 될 것 일 수있다.
      2. 다른 후 하나는, 과립 이전 선택 (다음 이웃)에 가장 가까운 것을 선택된다.
      3. 다음 이웃을 선택할 경우에만 이전 선택에서 바로 검색하고, 예를 들어, 하나의 방향으로 이동한다. 이 규칙은 선택이 밀집 과립 가끔 클러스터에 의해 지배되는 것을 방지 할 수 있습니다.
      4. 선택이 완료되면, 각각의 과립 영역을 요약하고 측정함으로써 각 리포 푸신 입자의 크기를 평가. 다른 테스트 그룹의 사람들을 비교하는 적절한 통계 테스트를 사용합니다.

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결과

프로토콜 섹션 1과 테스트 그룹은 가속의 특성을 연구하기 위해 얻을 수있는 방법을 2 세부 둔화 단일 연령대와 식민지에서 노화 반전. 우리는 (그림 1, 제 1 절 비교) 6 식민지를위한 초지 기계 카운트 ( "입구 카운트")을 평가 정상적인 개체 발생을 함께 노동자 타입의 차별화를 모니터링 할 수 있습니다. 그래프는 개인이 10 일 이상 이전되기 전에 초지 기계의 상태로 간호사에 ?...

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토론

우리는 여기에서 이전에 설명 ^{8,16,17,19,20 접근} 채택하고, 꿀벌 유연한 노화 연구를 촉진하는 하나의 워크 플로우에 통합. 우리의 목표는 관련 샘플 자료를 얻기 위해 설정하는 표준화 된 도구를 사용하여이 분야에 초보자 과학자를 제공하고, 다른 연구 팀 간의 실험 재현성을 개선하는 것입니다. 우리의 절차를 단순화하고 (예 : ^8에 대한 비교) 이전 설명과 특수 장비를 필요로하지 ...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Apifonda	Südzucker AG, Mannheim/Ochsenfurt, Germany
paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
phosphate-buffered saline	Sigma-Aldrich	P4417
Glycerol	Merck	1.04094.1000