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요약

라임 병은 북미에서 가장 일반적으로보고 된 벡터 매개 질병입니다. 원인 물질은 보렐리 아 burgdorferi는 Ixodid 진드기에 의해 전송 spirochete 박테리아입니다. 동물 모델에서 감염의 전송 및 검출은 우리가 여기에서 설명하는 진드기의 먹이의 사용에 최적화되어 있습니다.

초록

라임 병, 보렐리 아 burgdorferi의 병인의 전송은, 포유류의 호스트에 틱 Ixodes 종의 부착 및 혈액 공급에 의해 발생합니다. 자연 속에서,이 동물 매개 세균성 병원체는 저수지의 다양한 호스트를 사용할 수 있지만 흰색 발이 마우스 (Peromyscus의 leucopus)는 북아메리카에있는 애벌레와 nymphal 틱의 기본 저장소입니다. 인간은 가장 자주 B. 감염 부수적 호스트입니다 nymphal 단계. B.에있는 진드기에 물린 상처에 의해 burgdorferi burgdorferi는 enzootic주기를 통해 그 호스트에 적응하므로 포유류의 호스트에서이 나선상 세균과 그 효과의 기능을 탐색 할 수있는 기능은 진드기 먹이를 사용해야합니다. 또한, (탐지 및 감염원의 복구를위한 자연 벡터를 사용하여) xenodiagnosis의 기술은 암호화 된 감염의 연구에 유용하고있다. 얻기 위해서는 nymphal 해당 항구 B. 틱 burgdorferi,틱은 모세관 튜브를 통해 문화에 살고있는 나선상 세균을 공급하고 있습니다. 두 동물 모델 쥐와 인간이 아닌 영장류가 가장 일반적으로 진드기의 먹이를 포함하는 라임 병 연구에 사용됩니다. 우리는이 진드기에 공급, 감염 또는 xenodiagnosis 하나에 대한 동물에서 복구 할 수있는 방법을 보여줍니다.

서문

2011 년, 라임 병은 북미 (에서 6 번째로 가장 흔한 전국적으로 신고 대상 질병이었다 http://www.cdc.gov/lyme/stats/index.html ). B. burgdorferi는 모두 유전자 및 항원 (1 검토), 다양한 미생물이다. 그것의 유전 적 구성에 큰 (> 900 KB) 염색체를 포함하는 플라스미드의 내용이 분리 사이에서 변화하는 21 플라스미드 (12 선형, 9 원)까지. 대부분은 플라스미드 오픈 리딩 프레임의 90 % 이상이 알려진 세균 서열 2,3와 관련이없는,이 spirochete에 대해 알게 될 것입니다. B. burgdorferi 호스트 면역의 잠재적 인 공격 대상으로 항원의 다양한 제공합니다. 그러나, 치료 감염은 종종 지속. 틱 환경과 척추 호스트 환경과 나선상 세균의 상호 작용은 B.에 의해 적응을 필요로 감염 과정을 통해 burgdorferi. 여러 플라스미드 인코딩유전자는 차등 온도, pH, 세포 밀도 및 진드기의 라이프 사이클 4-8에서도 스테이지의 변화에 응답하여 표현되는 것으로 알려져있다.

B. 연구 자연 경로로 감염 다음의 enzootic주기 전반에 걸쳐 burgdorferi 적응 및 호스트 응답은 적절한 동물 모델에서 틱을 공급하는 능력에 의존한다. 이러한 연구 결과는 B. 항구 진드기를 생성하는 기술 과제를 충족 burgdorferi하고 모델 호스트 틱의 효율적인 전송 및 / 또는 공급을 보장한다. 또한, 감염된 진드기의 억제 및 복구가 필수적이다. 사용되는 모델에 따라 마우스와 라임 병 연구에 중요한 도구 역할을 각각의 인간이 아닌 영장류이다. B.에 대한 자연 저수지 호스트 흰 발이 마우스와 마찬가지로 burgdorferi는 실험실 마우스 B.에 의해 지속적인 감염을 지원하는 매우 취약 호스트입니다 9 burgdorferi. FOL이러한 C3H 변형 등의 질병 감염 마우스의 감염을 lowing, 나선상 세균은 피부, 방광, 근육, 관절, 심장 등의 여러 조직에 배포. 감염에 대한 염증 반응은 질병 심장과 관절 조직을 초래할. 나선상 세균이 호스트에서 지속 전염성 남아 있지만, 염증성 병변이없는 인간의 과정과는 달리, 간헐적 될 수 있습니다. 마우스 모델 따라서 B에 많은 정보를 제공하고 있습니다 관절염과 심장 염과 면역 반응 10-12 호스트를 포함 burgdorferi에 의한 병리. 틱 벡터 13-21에서 전송에 대한 몇 가지 필요한이 같은 병원체의 관점에서, 차별적 포유류 감염시 표현 특정 유전자가 특징으로하고 있습니다.

여러 동물 종 라임 병 (22)를 연구하는 데 사용되었습니다 만, 붉은 털 원숭이는 가장 밀접하게 인간의 질병 (23)의 멀티 기관 문자를 모방. 다른과는 달리동물 모델은, 홍반 이행 증, 심장 염, 관절염, 및 말초, 중추 신경 시스템의 신경 장애 등의 질병 발현의 폭은 짧은 꼬리 원숭이에서 관찰된다. 생쥐, B의 저수지 호스트 초기와 후기 - 전파 양상이 드문 9 동안 burgdorferi는, 질병, 마우스 긴장과 24 세에 따라 다릅니다. 또한, 다른 설치류, 토끼 목, 그리고 개 부대는 모든 B.에서 신경 질환을 전시하는 실패 burgdorferi 감염 25. 중요한 것은, 짧은 꼬리 원숭이는 라임 borreliosis, 즉, 초기 지역화, 조기 파종 및 말기 라임 병 26-28 3 단계의 특징적인 증상을 나타낸다. 홍반 이행 증 (EM)는 인간의 경우 29 70 ~ 80 %가 발생하는 것으로 생각되고, 또한 붉은 털 원숭이 (28, 30)에서 볼 수있다. 감염 후, 나선상 세균은 여러 기관에 접종의 사이트에서 배포. Spirochetal DNA 골격 무에서 검출 된scles, 심장, 방광, 말초 신경 및 신경 얼기뿐만 아니라 중추 신경계 (뇌, 뇌간 및 소뇌, 척수 및 경막) 31.

저장 능력은 32 ~ 36를 연구와 B의 연구에서 틱 쥐에 먹이가, 진드기 식민지의 전파를 위해 우리와 다른 연구 팀에 의해 활용되고 있습니다 burgdorferi는 37-40을 발병. 이 기술은 또한 xenodiagnosis 생쥐 41-44 백신 효능의 시험에 사용되었다. 우리는 Ixodes 모델 개발 28 인간이 아닌 영장류에 틱 공급 한 백신의 효능 (45)의 연구 및 지속성 후 항생제 치료 (46)의 평가에 xenodiagnosis하십시오. 그 항구 B. 틱 burgdorferi는 나선상 세균이 생활 단계를 통해 전송 될 때, 감염된 마우스에 애벌레를 공급하고 연구에 약충을 사용하여 천연 enzootic 사이클에서 유지 될 수있다. 이 보고서에우리는 야생형 또는 돌연변이 B.에 감염된 진드기를 생성하는 방법에 대한 지시 burgdorferi, 모세관 튜브 수유를 사용하여. 이것은 또한 마이크로 인젝션 (47)에 의해 침지 (48)에 의해 달성 될 수있다. B. 인공 도입 목적 진드기, 누구의 투과율을 알 수없는 돌연변이 균주를 연구 할 수있는 높은 감염률과 진드기의 그룹을 생성하고, 깨끗하고, 그렇지 않으면 감염되지 않은 진드기 식민지를 유지하여 오류 가능성을 줄이기 위해에 burgdorferi. 봉쇄 및 구비 틱 복구를 보장 할 수 있도록 또한, 우리는 마우스와 인간이 아닌 영장류에 진드기 먹이를 보여줍니다. 진드기의 먹이의 사용은 B. 면역 반응의 미래 연구에 필수적이다 burgdorferi 감염, 잠재적 인 라임 백신의 효능과 신비로운 감염의 검출을위한 xenodiagnosis.

프로토콜

라임 병 연구를위한 동물에 따라 눈금 접종 및 먹이의 실험 개요는 그림 1에 묘사되어있다.

1. 접종 Nymphal Ixodes는 B. 눈금을 모세관 튜브 수유를 사용 burgdorferi

틱 조작을 수행 할 때, 탄성 소매, 장갑, 일회용 불룩한 모자​​와 흰색 실험실 코트를 착용하고 있습니다.

  1. 우리의 기술은 브로드 등. (49)에 의해보고 된의 수정 된 버전입니다. 피펫 풀러를 사용하여 파괴 두께에 파스퇴르 피펫을 가열 당겨 모세관 튜브를 준비합니다. 집게를 사용하여 범위를 해부하면, 최적의 직경 (약 0.2 mm)에 대한 팁을 휴식. 틱 mouthpart 크기로 표준화 튜브는 크기 조정 가이드로 사용됩니다. 피펫을 준비 할 때 얼굴 가리개를 착용해야한다.
  2. B. 성장한다 BSK-H 배지 (시그마) 죄수의 10 × 2-8 사이의 7 / ㎖ (중간 로그 상)에 burgdorferi6 % 토끼 혈청 이닝.
  3. 4-6주 후 유충의 탈피를위한 23 ° C에 저장되어있는 nymphal 틱을 사용합니다. 장소는 요리의 외부 바닥면에 양면 테이프로 작은 60 X 15mm 페트리 접시에 틱. 위로 향하게 틱 복부 쪽을 놓습니다.
  4. B.에 모세관 팁 담그고 혼합 후 burgdorferi 문화 관. 해부 범위를 사용하여 진드기의 입 부분의 hypostome에 모세관 튜브를 놓습니다. 도 2a에 도시 된 바와 같이, 대신에 튜브를 고정하는 몰딩 점토를 사용한다.
  5. 봉쇄의 추가 수준의 대형 투명한 플라스틱 욕조 안쪽에 부착 진드기와 배양 접시를 놓습니다. 젖은 종이 타월은 수분을 제공하기 위해 추가됩니다. 배변이 명백한 때까지 30 분 - 2의 시간 동안 37 ° C의 열 배양기에서 진드기를 놓습니다. 이 나선상 세균을 포함하는 매체가 진드기를 통과 한 것을 나타냅니다.
  6. 수유하기 전에 틱 환경에 적응 할 수 있도록 23 ° C에서 2 ~ 4 주간 틱 휴식동물 그들.

2. B.와 마우스를 감염 진드기 burgdorferi

  1. 멸균 물에 케타민 주식 1:10 희석. 투베르쿨린 주사기와 복강 내 주사 케타민 100 ㎎ / ㎏으로 각각 마우스를 마취
  2. 마우스가 완전히 마취되면, 다시 (레밍턴 매끄럽고 & 매끄러운) 전기 트리머 벌금을 사용하여 중간 귀에서 마우스를 면도.
  3. 다른 개체에 흰색 냄비에 가까운, 마우스의 털이 영역에 적신 붓 nymphal 틱 (즉, 항구 B.의 burgdorferi)를 전송합니다. 또한, 감염되지 않은 진드기가 의심되는 감염 마우스의 xenodiagnosis 생쥐에 배치 할 수 있습니다. 틱 배치를위한 깨끗한 흰색 표면의 사용은 무소속 진드기가 쉽게 볼 수있는 것을 보장하는 데 도움이됩니다.
  4. 전문 caging (앨런 타운 Caging, 앨런 타운, PA)에 마우스를 놓습니다. caging 케이지의 바닥에서 상승 스테인레스 스틸 그릴로 구성되어 있습니다. 티그는 케이지의 상단을 아래에 마우스의 자유로운 이동을 허용 할 정도로 물병 홀더를 상승시키는 우리의 사내 기계 공장에 의해 수정되었습니다. 팬은 트랩에 물을 약 ½ 인치 마우스 (그림 3A)를 떨어져 어떤 틱으로 가득합니다. 쥐가 마취로부터 완전히 깨어까지 저체온의 위험을 최소화하기 위해, 재사용 레인지 가열 패드를 사용하기 전에, 오리스 밑에 배치된다. 그들은 마취와 음식과 물을 트레이에 문질러 복구로 동물은 종종 ataxic, 그래서 이러한 제거해야합니다. 수위 침수에서 마우스의 사지를 방지하기에 충분히 낮다.
  5. 절지 동물의 포획을 위해 엉킴 트랩 붙여 넣기 (본사로, 빅토리아, BC, 캐나다)와 테이프로 늘어선 된 트레이 내부에 케이지를 놓습니다. 마우스는 단독으로 갇힌 마취의 기간 동안 지속적으로 관찰된다.
  6. 쥐가 마취에서 완전히 깨어있을 때 2 시간 내, 음식 쟁반과 물 병 케이지로 대체됩니다. 이 후4 시간은, 플라스틱 오두막 및 nylabone로 구성된 주택 농축가 대체됩니다.
  7. 3, 4, 5 일 후, 공급 진드기 마우스, 케이지와 케이지 물을 확인합니다. 케이지 물 (즉, "금을 패닝") 흰색 금속 냄비를 통해 체질한다. 공급 깨끗한 물 틱 씻어 플라스틱 단지 (그림 3B)에 저장합니다. 일 3, 4, 깨끗한 물 새장에 물을 교체합니다. 5 일에, 케이지, 그러나 진드기에 대한 철저 마우스뿐만 아니라 확인합니다. 보통이 시점에서 모든 진드기 공급하고 마우스는 일반 caging에 반환 할 수 있습니다.
  8. 고압 증기 멸균 및 폐기에 대한 생물 학적 용기에 액체를 포함하여 마우스 케이지에서 모든 폐기물을 놓습니다. 생쥐와 항상 회수 이러한 배치 틱 수의 로그를 유지한다.

3. B.와 감염에 대한 비인간 영장류에 틱을 먹이 burgdorferi 또는 xenodiagnosis

  1. 진드기 억제 장치를 준비한다 : 3 인치 X에서 1 ¾ 인치 직경의 원을 잘라3 인치 LeFlap (플랩) 깨끗한 메스와 측정 가이드를 사용. Biatane 거품과 Duoderm에 동일한 크기의 원을 잘라 템플릿으로 컷 아웃을 사용합니다. 발포체는 피부의 표면 상에 플랩을 상승 및 진드기의 가능한 분쇄를 방지하기 위해 사용된다. Duoderm는 쿠션의 또 다른 레이어를 추가하고 진드기 탈출에서 추가 보안을 위해 격납 장치의 가장자리를 오버레이. 격납 장치의 다이어그램은 그림 4에 묘사되어있다.
  2. 수의 직원은 근육 주사로 5-8 ㎎ / ㎏ Telazol과 동물을 마취합니다.
  3. 사이즈 40 블레이드 탑재 전동 트리머 (오스타)를 사용하여 동물의 머리를 클립. 재킷이 적용되는 모든 분야가 잘립니다 : 다시, 정면, 상단에 팔을. 면도 크림과 듀얼 블레이드 처분 할 수있는 면도칼을 사용하여 밀접하게 X 20cm 가로 세로 약 25 ㎝의 면적을 면도. 축축한 종이 타월로 닦아 피부를 건조 낮은 열로 건조한다.
  4. t에 플랩을 배치그는 동물의 배부, 다만 견갑골 아래, 척추의 양쪽에. 그 자리에 원을 추적 마커를 사용합니다. SkinPrep로 닦아 원 주위 피부의 영역을 준비합니다. 이 접착제 및 견제 장치의 부착에 영향을 미칠 수있는 피부에있는 기름을 제거합니다. 원의 주위에 공간을 1cm 둘레에 대해두면, 1 ~ 4 cm의 폭 피부 접착제 (SkinBond)의 층을 적용한다.
  5. Biatane 거품의 뒷면에 접착제를 제거하고 적절한 자리에 피부에 부착. 동물은 다시 5 ㎎ / ㎏ Telazol와 수의학 직원 마취 있습니다. 피부 접착제 및 Hypafix 테이프로 가장자리를 밀봉. 플랩의 뒷면에 접착제를 제거하고 Biatane의 상단에 부착. LeFlap의 가장자리 주위에 Hypafix 테이프를 놓고, 다음 플랩의 메쉬 플랩을 테이프와 동물의 재킷을 배치합니다. 테이프 엉 키게 트랩 페이스트는 추가 보안을 위해 인간이 아닌 영장류 caging을 둘러싼 주변의 바닥에 적용됩니다.
  6. Chemic의 효과를 최소화하기 위해,격납 장치가 제자리에 후 진드기 수유의 단계 3.4에서 사용되는 루게릭 병은 진드기는 24 시간을 추가됩니다. 이 시점에서, 장치의 보안도 검사하고 필요한 경우 강화된다. 일반적으로 20 unfed 님프 (4~8주 후 유충의 탈피)은 붓을 사용하여 장치 내 피부에 추가됩니다.
  7. 플랩의 메쉬의 뒷면에 접착제를 제거하고 장소에 밀봉. 마지막으로, 접착제를 노출하는 Duoderm 받침을 제거하고 격납 장치의 상단에 배치합니다. 오픈 메쉬 원에서 Hypafix 테이프의 조각을 추가하고, 재킷을 교체합니다. 완성 격납 장치는도 5a에 도시된다.
  8. 후에 5 일, 위와 같이 동물을 마취와 재킷이 제거됩니다. 메쉬 (그림 5B)을 통해 틱 먹이를 검사하기 위해 먼저 테이프를 제거합니다. 조심스럽게 플랩에서 Duoderm 껍질.
  9. 진드기에 대한 액세스를 제공하는 모서리에서 메쉬 부를 후퇴. 연준 틱 자주 또는 근처에서 발견거품 원 (그림 5C)과는 붓으로 제거하고 깨끗한 물에 배치됩니다. 장치 모두 한 번에 볼 수 공급 진드기가 수집됩니다 (그림 5D)를 제거합니다.

참고 : 때때로, 견제 장치는 단순히 떨어져 피부로부터 박리 할 수​​ 있습니다. 접착력이 강한 잠재적으로 피부에 손상을 줄 수 있다면, Unisolve 용매는 부드러운 제거를위한 영역에 적용된다. 피부는 이소프로판올로 닦아 진드기는 23 ℃에서 저장된다 감염에 사용되는 경우, 틱은 B를 포함 된 숫자를 확인하기 위해 분쇄 할 수있다 burgdorferi. xenodiagnosis 사용하면 진드기가 이전 중장 내용의 분석에 1-3 주 동안 유지된다.

결과

그들은 전송을 위해 동물에 공급되기 전에 모세 혈관 공급의 완료 후, 진드기는 일반적으로 2 ~ 3 주간 23 ° C에서 휴식 있습니다. 모세관 수유 기술을 사용하여, 우리는 공급의 90 % 이상이 항구 B. 틱 것을 발견했다 burgdorferi. 긍정적 인 진드기의 비율이 세탁에 의해 결정된다 다음의 미세 튜브 모양의 유 봉과 멸균 PBS에서 그들을 분쇄, 과산화수소, 에탄올 틱. 중장 내용은 PBS에 유출은 ?...

토론

그 항구 B. 틱 얻기 위해 하류 연구에 burgdorferi, 진드기가 될 수있다 : (1) 애벌레 단계에 감염된 생쥐에 공급 (2) B.에 몰입 하나 애벌레 또는 nymphal 단계 48에서 burgdorferi 문화 (3) B를 미세 주입 burgdorferi 47 또는 (4) 모세관 튜브 공급 B. burgdorferi 49. 각 방법은 진드기의 많은 부분이 감염 항구 B.에 사용되는 것을 보장하기위한...

공개

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

감사의 말

저자는 기술 지원 니콜 Hasenkampf 아만다 Tardo을 감사드립니다. 우리는 또한 Drs에 감사드립니다. 모세관 수유 방법에 대한 명령의 린든 후진타오와 아드리아나 마르케스 LeFlap 견제 장치의 추천, 그리고 박사 리자 게른. 이 작품은 NIH / NCRR 그랜트 8 P20 GM103458-09 (MEE)에 의해 연구 자원을위한 국립 센터와 보조금 P51OD011104/P51RR000164을 통해 건강의 국립 연구소의 연구 인프라 프로그램의 사무실 (ORIP)에 의해 지원되었다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Reagent
BSK-HSigmaB-8291
Ketamine HCl
Tangle Trap coating PasteLadd researchT-131
SkinPrepAllegro Medical Supplies177364
LeFlap, 3" x 3"Monarch Labs
Hypafix tapeAllegro Medical Supplies191523
SkinBondAllegro Medical Supplies554536
UniSolveAllegro Medical Supplies176640
Biatane Foam, adhesive 4"x4"Coloplast3420
DuoDerm CGF Dressing - 4" x 4", (3/4)" adhesive border Convatec187971
Nonhuman primate jackets with flexible 2" back panels; add drawstrings at top and bottomLomir Biomedical Inc.
EQUIPMENT
Pipet pullerDavid Kopf InstrumentsModel 700C
Dark field microscopeLeitz WetzlarDialux
Dissecting microscopeLeicaZoom 2000
Mouse cagingAllentown caging

참고문헌

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