중증 척수 손상 후 섬유소 및 성장 인자 칵테일 신경 줄기 세포의 생존 및 분화 촉진

요약

성장 인자를 함유하는 피브린 매트릭스는 완전한 척수 절개 부위로 그라프 신경 줄기 세포를 유지하기 위해 사용되었다. 이식 세포가 완전히 병변 캐비티를 채우고 장거리 호스트 척수로 축삭을 확장 신경 세포를 포함한 여러 신경 세포 유형으로 분화.

초록

신경 줄기 세포 (NSCs의)는 자기 갱신과 뉴런과 교세포로 분화 할 수있다. NSCs의 이식은 척수 손상 (SCI) 후 손실 뉴런 및 아교를 대체 할 수 있고, 병변 위와 아래 척수 세그먼트를 재 연결하는 중계 기능을 형성 할 수있다. 신경 줄기 세포를 이식 이전 연구는 척수 병변 공동 내에 불완전 이식편 생존에 의해 제한되었다. 또한, 이식 세포의 생존, 분화, 및 프로세스 확장의 추적이 최적화되지 않았다. 마지막으로, 이전의 연구에서, 배양 된 쥐의 NSCs의는 일반적으로 운명이 특정 세포 형태로 구동되지 않는 한, 오히려 신경보다 부상 척수에 이식 할 때 교세포로 분화하는 것으로보고되었다. 이러한 문제를 해결하기 위해, 우리는 심한 SCI의 사이트에 NSCs의 생존, 통합 및 차별화를 개선하기 위해 새로운 방법을 개발했다. NSCs의 갓 녹색 플로리다를 표현하는 안정적인 형질 전환 피셔 344 쥐 라인에서 배아 일 14 척수 (E14)에서 분리되었다uorescent 단백질 (GFP)과는 성장 인자를 함유 피브린 매트릭스에 삽입 하였다; 병변 캐비티 그라프 세포를 유지하고 세포 생존을 지원하는 것을 목표로 제형. 섬유소 / 성장 인자 칵테일 NSCs을함으로써 염증의 피크 기간을 피하고 2 주 흉부 레벨 3 (T3) 완전 척수 transections 후 이식되었다. 결과 이식은 완전히 병변 구멍을 채워 호스트 척추 현저하게 장거리 코드 및 아교로 축삭을 확장 모두 신경 세포로 분화. GFP를 표현하는 교양 인간 NSCs의의 이식은 유사한 연구 결과의 결과. 따라서, 방법은 신경 줄기 세포 이식, 생존과 생체 내 연구 결과의 분석을 향상시키기 위해 정의된다.

서문

척수 손상 (SCI)는 종종 손상뿐만 아니라의 interneurons 및 운동 신경의 분절 손실을 일으키는 원인이되는 뇌로부터 신호를 전달 백색질, 또한 중앙 회색 문제. SCI의 결과는 모터와 병변 아래 감각 기능 양자의 손실이다. 불행하게도, 성인 중추 신경계 (CNS)는 자발적으로 영구적 인 기능 적자 ^1의 결과로, 다시 생성되지 않습니다. 따라서, 부상 성인 척수 및 개선 모터, 감각 및 자율 신경 기능의 재건은 SCI 연구의 중요한 목표이다. 신경줄 기세포 (NSCs의)은 직접적으로 배아 또는 성인 CNS로부터 격리 여부 분실 뉴런 및 아교를 대체하는 강력한 후보 셀이다. 또한, 이러한 세포 병변 사이트 ^2,3 걸쳐 축삭 전도를 복원하는 신규 기능 릴레이를 형성 할 가능성이있다.

현재까지 해부학의 상세한 해설, electrophys은 없었다iological 심각한 SCI 후 이식 NSCs의로의 연결을 중계 형성의 행동 효과. 첫째, 이식 NSCs의 태아의 중추 신경계 조직을 큰 병변 구멍에 이식 할 때 제대로 생존이에 대한 몇 가지 이유가 있습니다. 이전 연구는 큰 빈 낭성 병변 충치에게 ^4,5를 떠나, 상당한 초기 세포 손실을 보여줍니다. 일부 연구에서는 이식 된 세포가 연속적으로 나누어 병변 캐비티에게 ^4,5를 작성하지만이 주 일의 지연 상황이 발생할 수 있습니다, 이후 병변 사이트의 충전이 완료 또는 일치하지 않을 것입니다. 둘째, 세포의 생존, 분화 / 성숙하고, 이식 NSCs의의 파생물에 사운드 데이터를 제공하는 효율적인 추적 시스템이 부족했다. 대부분의 초기 연구는 antegrade 및 이식 ^2,3에서 축삭 돌기를 추적하는 역행 라벨을 이용했다. 그러나 이러한 기술은 부분적으로 만 자주 unclearly 표시 축삭 이식 세포에서 발생하는 예측 및 추적 방법은 subjec 있습니다이식 된 세포 이상 염료 누출로 인한 유물에 t. 다른 그룹은 부상 쥐 척수 ^5,6에 인간 태아 NSCs의 이식 후 축삭 돌기에 라벨을 인간의 특정 신경 세포 마커를 사용했습니다. 그러나 이러한 연구에서, 이종 이식은 지속적으로 잘 생존하지 않았다. 최근 GFP 리포터 유전자의 바이러스 배달은 배양 NSCs의 ^{7,8 레이블을} 사용 하였다. 그러나, GFP의 표현은 종종 일치했고 ^7을 규제 할 수있다. 최근, 안정 리포터 유전자, GFP 또는 인간 태반 알칼리 포스 파타 아제를 발현하는 형질 전환 마우스 또는 공여 쥐의 사용이 극적 생체 ^9,11에서 이식 신경 줄기 세포 / 전구 세포의 추적을 개선했다. 셋째, 여러 연구는 손상이나 부상 성인 척추 오호의 환경에 이식 할 때 배아 또는 성인 하나 CNS에서 파생 된 체외에서 배양 한 쥐의 NSCs의 독점적 폐해 계통으로 분화을 나타냅니다이러한 신경줄 기세포는 로컬 환경은 줄기 세포의 운명을 지시 할 수 있다는 것을 나타내는, 뉴런 및 체외에서 신경교 모두로 분화 할 수 있다는 사실에도 불구하고 D ^7,12,13. 또한, 배양 NSCs의, 성인 CNS에서 파생 특히이 생체 내 ¹³ 신경교 계통으로 분화하는 고유 defaulty에 속성을 가질 수있다.

때문에 위에서 언급 된 한계, 우리 그룹은 최근에 중상을 입은 성인 척수 배아 NSC 추적, 생존, 분화 / 성숙을 개선하기 위해 새로운 프로토콜을 개발했습니다. 간단히 말해서, 우리는 생체 이식 ¹⁴ 후 GFP 발현을 지속 GFP 리포터 유전자를 발현하는 형질 전환 안정 피셔 344 쥐 inbreed 라인 시작했다. 다음에, 우리는 배아 일부터 14 피셔 344 척수 뉴런 및 아교 모두를 생성 할 수있는 잠재력을 유지 개발 단계를 갓 절연 NSCs의 사용. 마지막으로, 우리는 임베디드성장을 함유 피브린 매트릭스에 갓 NSCs의 분해는 세포를 유지하고 균등 그래프트 세포 생존, 분화 및 통합을 지원하는 것을 목표로, 큰 병변 공동 내에이를 분산 ^{15-17 요인.} 이식은 T3 완전 절개, 척수 손상 후 2 주간의 사이트에 배치했다. 이러한 이식 세포는 지속적으로 완전한 절개 사이트를 가득 긴 거리 ^{18 세} 이상 호스트 척수로 축삭 많은 수의 확장 풍부한 신경 세포로 분화. 유사한 결과 면역 결핍 쥐 ^18에 배양 된 신경 줄기 세포의 이식을 사용하여 수득 하였다.

프로토콜

모든 동물 프로토콜은 VA-샌디에고 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인됩니다. 실험실 동물 관리 및 안전에 대한 NIH의 지침을 엄격히 준수. 동물 연구를 통해 음식과 물에 자유롭게 접근이 적절하게 고통과 불편을 최소화하기 위해 처리됩니다.

1. 섬유소 구성 요소의 준비 성장 인자 칵테일을 함유

1. (자료 표 참조) 50 ㎎ / ㎖ 2 배 원액을 얻기 위해 0.5 ml의 PBS에 25 mg을 쥐 피브리노겐을 분해. 섬유소 용해하기 어렵고, 37 ° C의 보육 또는 수조에 넣고 1 ~ 2 시간마다 5 ~ 10 분을 흔들어해야합니다.
2. 50 U / ㎖의 2 배 원액을 얻기 위해 10 mM의 멸균 _염화칼슘 2 ㎖에 100 UN 쥐 트롬빈을 녹인다.
3. 100 ㎕의 원액을 구하는 다음의 농도로 PBS에 성장 인자를 녹이고, 1 ㎎ / ㎖ : BDNF; 생체 내에서 척수강 내 주입으로 NT-3 (높은 주식 농도 ^{19); 200 ㎍ / ㎖의 : GDNF; IGF; bFGF에; EGF; PDGF; aFGF; HGF (세포 배양에 사용되는 것보다 약 1,000 X 이상).}
4. 50 mM의 DMSO 주식 솔루션을 얻기 위해 1.3 ㎖의 DMSO에 25 밀리그램의 MDL28170 (칼 페인 억제제)를 용해하고 1 ㎜ 주식 솔루션을 얻기 위해 PBS에 50 배 희석.
5. 1000 μL 성장 인자 칵테일 솔루션 (그림 1)를 생산하는 각각의 성장 인자 성분의 100 μL와 MDL28170 (1 ㎜의 원액) 100 μl를 섞는다.
6. -70 ℃에서 저장을위한 10 또는 20 μL에 성장 인자와 나누어지는를 포함하는 25 ㎎ / ㎖ 피브리노겐 작업 솔루션을 얻기 위해 500 μL 성장 인자 칵테일 500 μL 피브리노겐 배 원액을 혼합 이 솔루션은 -70 ° C에서 최대 12 개월 동안 안정
7. 마찬가지로, 스토리지 유사 10 또는 20 ㎕의 부피로 성장 인자를 함유하는 분취 액과 25 U / ㎖ 트롬빈 작업 용액을 얻기 위해 500 ㎕의 성장 인자의 칵테일을 500 μL 트롬빈 2X 원액 혼합T -70 ° C에 대한 최대 12 개월까지.
8. 세포와 혼합 될 때까지 이식의 날, 얼음에 피브리노겐과 트롬빈 함유 성장 인자 칵테일을 배치합니다.

2. T3 척수 절개

1. 수용 가능한 방법을 사용하여 성인 여성의 피셔 344 쥐 또는 무 흉선 누드 쥐를 마취. 꼬리와 발 핀치에 응답이 완전히없는 경우 주제 깊이, 마취 있습니다. 참고 : 우리는 일반적으로 150-200g 피셔 쥐 또는 1백80~2백20그램 무 흉선 쥐와 마취제의 마취 칵테일 (2 ㎖ / ㎏) (25 ㎎ / ㎖), 자일 라진 (1.3 ㎎ / ㎖) 및 아세 프로 마진 (0.25 MG를 사용 / ㎖).
2. 동물이 마취 동안 건조 또는 눈의 손상을 방지하기 위해 눈 연고를 적용합니다.
3. 상단 흉부 영역을 면도하고 베타 딘으로 피부를 청소합니다.
4. , # 15 블레이드를 사용하여 피부와 근육을 잘라 외과 견인기를 사용하여 T3 척추를 노출하고 rongeur을 사용하여 T3 / 4 척수를 노출 T3 척추에서 후궁 절제술을 수행합니다.
5. 경도를 확인# 11 블레이드를 사용하여 약 2mm 길이의 경질의 종 방향 중간 선 절개.
6. 오른쪽 측면 전체 척수를 절단하는 경막 아래에 홍채 절개 가위를 놓습니다. 1.5 mm 더 cadually 같은면에 또 다른 상처를 확인합니다.
7. 중간 강도의 진공에 연결 무딘 23 G 바늘 두 컷 세그먼트 사이 기음 척수 조직. 배쪽으로 횡 방향 완전 절개를 보장하기 위해 시각적 인 확인을 사용합니다. 이 측면 hemisection을 완료합니다.
8. , 전체 폭 척수 절개로 병변을 확장 왼쪽 hemicord에 거울 절개를 배치합니다. 2 주 후 이식 할 때 병변 사이트의 회사 이식 / 섬유소 매트릭스를 유지하기 위해, 첫 번째 컷이 아닌, 그대로 두라를 떠나 시도합니다.
9. 근육을 봉합 항생제 분말과 주식 스킨을 적용.
10. 락 테이트 링거액 (3 ㎖)을 주입, Bannamine (2.5-5 ㎎ / ㎏)과 암피실린 (80 ~ 100 ㎎ / ㎏) 즉시 수술 및 마이 후 (재료 표 참조)따뜻한 인큐베이터에서 ntain 쥐 체온이 다시 설정 될 때까지.
11. 방광을 비우고 (그림 1B)를 비우는 반사 방광의 설립 때까지 약 2 주 동안 하루에 두 번 링거 암피실린 솔루션을 주입.

3. 갓 해리 배아 일의 준비 (14) 척수 신경은 줄기 세포

1. inbreed 유전자 변형 GFP의 F344 쥐 쥐 자원​​에서 (F344-Tg는 (UBC-EGFP) F455Rrrc) 및 연구 센터, 미주리 대학교를 얻습니다.
2. 40 μg DES-의 Gly ^(10)를 주입, [D-알라 ^6] Leuteinizing 호르몬이 후 200의 농도 ㎍ / 성숙한 여성의 쥐 (8 주 이상) 당 (IP)을 복강 ml로 PBS에 희석 호르몬 에틸 아미드 (LHRH)을 해제 배아 컬렉션의 동기화를위한 -3의 시간 빛 유도.
3. 사일 주입 후 성숙한 GFP 동형 접합 또는 이형 남성 쥐의 하룻밤과 결합.
4. 일 13.5-14.5 postcoitus에서 배아를 수집또는 형광 현미경 - 차가운 HBSS 버퍼 (PC), "NightSea"손전등 및 필터 안경 (BlueStar는 손전등 모델 VG1 차단 필터 BLS1)에서 GFP 발현을 확인합니다.
5. 각 GFP 양성 태아에서 무균 중 척수를 해부 위에있는 수막 및 홍채 절제술 가위 및 미세 보석상의 집게와 연결된 척수 신경절을 제거합니다.
6. 15 ㎖의 cornical 관에 2 ㎖ 차가운 HBSS 버퍼로 해부 척수를 수집하고 얼음에 보관.
7. 해부 척수 해리 참조 번호 (20)를 따라
   1. 간단히, (여러 코드 1 코드가 하나의 주제의 이식을위한 충분한 세포를 생성 할 수 있습니다, 함께 소화 할 수있다) 해부 척수를 포함하는 튜브에 0.25 % 트립신-EDTA 2 ㎖를 추가하고 10 ~ 12 분 동안 37 ° C에서 소화.
   2. 튜브를 원심 분리 2 분 동안 2,500 rpm에서 조직을 10 % FBS 함유 DMEM 10 ㎖를 첨가함으로써 트립신의 반응을 정지.
   3. 2 ㎖ NeuroBasal 매체 콜로라도에있는 조직을 재현 탁2 % B27를 ntaining하고, 점차적으로 작은 화재 광택 파스퇴르 피펫을 사용하여 척수 조직을 씹다.
   4. 원심 분리기 40 μm의 셀 필터 여과기와 2 분, B27를 함유 NeuroBasal 배지 2 ㎖에 재현 탁하고, 필터 셀에 대한 2,​​500 rpm에서 세포.
8. 혈구와 세포를 세어 똑같이 두 에펜 도르프 튜브에 세포를 나눕니다.
9. 세포를 원심 분리기와 완전히 뜨는을 제거 (1 ~ 2 분은 저 진공 끝으로 모든 상층 액을 철회해야한다) 그래서 성장 인자 칵테일 세포 재 정지 후 남은 상층 액을 희석되지 않습니다.
10. (약 ⅓ 최종 볼륨의 세포 펠렛 카운트) 250,000 세포 / μL의 농도로 각각 성장 인자를 포함하는 피브리노겐 또는 트롬빈 작업 솔루션의 각 셀 절반을 재현 탁하고 (그림 1A) 얼음 전에 이식에 배치. 세포와 혼합 때 피브리노겐이 자발적으로 젤 수도 있습니다발 병변 / 그래프트 사이트 트롬빈과 결합하기 전에; 조기 겔화를 방지하기 위해, 바로 생체 내에서 세포 이식하기 전에 피브리노겐의 세포를 혼합한다.

4. 이식

1. 이주 척수 절개 한 후 병변을 T3 / 4 척수 Reexpose.
2. 5 μL 피브리노겐 세포 5 μL 트롬빈 세포는 직접 병변 사이트를 다시 열지 않고 밀봉 된 흉터 조직 그대로 두라를 통해 병변 사이트의 9 점에 주입 될 수있다.
3. 센터에서 3 (중간 지점에있는 하나 이음 두, 따로 따로 0.5 mm 간격)와 주동이 모두 3 : 반흔 조직 그대로 두라 1~2주 포스트 병변의 표면에 9 홀을 만들기 위해 27 G 바늘을 사용하여 와 꼬리 인터페이스 (병변의 중심에 약 0.5 mm 주동이 또는 꼬리) 3.
4. 그런 다음 주동이의 인터페이스와 수성의 3 점으로 병변 사이트와 분기 볼륨의 세 가지 핵심 포인트로 피브리노겐 세포 솔루션의 절반 볼륨을 주입꼬리 인터페이스의 3 점에 uarter 볼륨.
5. 그 후, 즉시 동일한 스팟에 throbmbin 세포를 주입. 피브리노겐 및 세포 병변 사이트 내부 트롬빈 세포의 혼합물을 병변 부위에 세포를 억제하는 피브린 겔을 형성하고 성장 인자의 칵테일은 세포의 생존을 지원할 것이다. 세포 PicoSpritzer (일반 밸브, 주식 회사)에 접속 뽑아 유리 피펫을 사용하여 주입된다.
6. 이식 교양 인간 NSCs의 상술 한 바와 같은 절차에 ^{21 일} 인간 시약 만든 섬유소 및 성장 인자 칵테일을 사용합니다.

결과

GFP 면역 조직 라벨이 접목 쥐 NSCs의는 병변 / 호스트 마진에 부착하고없는 빈 병변 사이트의 대부분을 떠나, T3의 절개 사이트에서 가난하게 살아 인산염 완충 생리 식염수 (PBS) (섬유소 매트릭스와 성장 인자가 결여)에 재현 탁 것을 보여줍니다 이식 세포 (그림 2A). 단독 피브린 매트릭스와 공동 그래프트 NSCs의 경우의 생존을 향상하지만 그라프 완전히 큰 병변 캐비티 (데이터는 도시?...

토론

손상된 척수에있는 NSC 이식을위한 주요 장애물 중 하나는 병변 센터에서 생존율이다. 병변 사이트의 틈새 나 구멍은 잠재적으로 감소 시키거나 supraspinal 축삭 손상 아래 분리 된 척수 세그먼트 사이의 기능적 연결을 릴레이의 형성을 약화시킬 수 있습니다. 또한, 이식 NSCs의 가난한 생존 호스트 조직과의 통합에 영향을 미치고, 따라서 호스트 신경 세포와 이식 뉴런의 연결을 줄일 수 있습니다. 세...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fibrinogen (rat)	Sigma	F6755-25MG	2 hr at 37 °C to dissovle Stock Concentration: 50 mg/ml Final Concentration: 25 mg/ml
Thrombin (rat)	Sigma	T5772-100UN	Dissovle in 10 mM CaCl2 Stock Concentration: 50 U/ml Final Concentration: 25 mg/ml
bFGF (human)	Sigma	F0291 (25 μg)	Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl
EGF (murine)	Sigma	E1257 (0.1 mg)	Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl
BDNF (human)	Peprotech	452-02 (1 mg)	Stock Concentration: 1,000 ng/μl Final Concentration: 50 ng/μl
NT-3 (human)	Peprotech	452-03 (1 mg)	Stock Concentration: 1,000 ng/μl Final Concentration: 50 ng/μl
GDNF (rat)	Sigma	G1401 (10 μg)	Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl
IGF-1 (mouse)	Sigma	I8779 (50 μg)	Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl
aFGF (human)	Sigma	F5542 (25 μg)	Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl
PDGF-AA (human)	Sigma	P3076 (10 μg)	Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl
HGF (human)	Sigma	H9661 (5 μg)	Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl
MDL28170	Sigma	M6690 (25 mg)	Stock in DMSO Stock Concentration: 1 mM Final Concentration: 50 μM
PBS	Millipore	BSS-1005-B	Stock Concentration: 1x Final Concentration: 1x
DMSO	Sigma	D2650
Ketamine	Putney	26637-411-01	40-80 mg/kg Stock Concentration: 100 mg/ml Final Concentration: 25 mg/ml
Xylazine	Lloyd	0410,	2.5-8 mg/ml Stock Concentration: 100 mg/ml Final Concentration: 5.8 mg/ml
Acepromazine	Butler	003845	0.5-4 mg/ml Stock Concentration: 10 mg/ml Final Concentration: 0.25 mg/ml
Betadine	Healthpets	BET16OZ
Ringers	Abbott	04860-04-10	2-3 ml/inj
Banamine	Schering-Plough	0061-0851-03	2.5-5 mg/kg Stock Concentration: 50 mg/ml Final Concentration: 0.5 mg/ml
Ampicillin	Sandoz	0781-3404-85	80-100 mg/kg Final Concentration: 50 mg/ml
LH-RH	Sigma	L4513	200 μg/kg Final Concentration: 200 μg/ml
HBSS	Gibco	14175-096
Trypsin	Gibco	25200056	Stock Concentration: 0.25 % Final Concentration: 0.125 %
DMEM	Gibco	11995073
FBS	Gibco	16000044	Stock Concentration: 100 % Final Concentration: 10 %
Neurobasal Medium	Gibco	21103049
B27	Gibco	17504044	Stock Concentration: 100x Final Concentration: 1x
Note, use human reagents for grafts of human NSCs