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요약

우리는 배아 C. 대규모 문화 여기 수정 된 프로토콜을 설명 세포 엘레 간스. 배아 C. 엘레이 방법을 사용하여 시험 관내에서 배양 된 세포는, 셀 특정 방식으로 유전자 발현을 차별화하고 다시 요약 나타난다. 직접 셀에 접속하거나, 다른 조직으로부터 특정 세포 유형의 분리를 요구 C. 기법에 적용될 수있다 배양 된 세포 엘레 간스.

초록

C. elegans의 유전 및 분자 기술에 쉽게 적용되는 강력한 모델 시스템이다. 최근까지, 비록 세포와 특정 세포 유형의 분리에 대한 직접 액세스를 요구하는 기술은, C.에 적용 할 수 없었다 엘레. 이 제한은 조직이 쉽게 효소 및 / 또는 세제로 처리하여 분해되지 않은 가압 표피 내에 국한된다는 사실 때문이었다. 레어드 꽃, 크리스텐슨과 1 C.을 배양하기위한 강력한 방법을 개발 동료에 의해 ​​초기 개척자의 작업을 바탕으로 큰 규모의 배아 세포 엘레 간스. 계란은 표백제 / NaOH로 처리하여 임신하는 성인에서 분리하고 이후에 달걀 껍질을 제거하는 키틴으로 처리됩니다. 배아 세포는 다음 수동 피펫에 의해 해리와 혈청 풍부한 미디어 기판 덮인 유리에 도금되어있다. 아이솔레이션 셀 24 시간 이내에 형태를 변화시킴으로써 세포를 발현하는 특정 마르크 의해 구별하기 시작할RS. C. 엘레이 방법을 사용하여 배양 된 세포는 체외에서 2 주까지 생존 및 전기 생리학, 면역에 사용 된, 그들은 정렬 및 마이크로 어레이 프로파일에 사용 된 같은 영상도 분석한다.

서문

예쁜 꼬마 선충 (C. elegans의)는 세포 기능 분화 및 동작의 분자 기초를 조사하기위한 강력한 모델 생물이다. 게놈, 신진 대사와 생합성 경로는 척추 동물과 유사하지만, 유전 및 분자 온순함 2 훨씬 크다. 장점 중의 크기와 간단한 해부학, 급속한 수명주기 (25 ° C에서의 3 일), 짧은 수명 (2 개월)과 자손의 많은 수 (> 200)이다. 그것의 자웅 동체 자연과 짧은 수명주기에, 분자 및 유전자 조작은 C로 간단합니다 형질 전환 동물 3,4와 같은 RNA 간섭과 같은 5 유전자 녹다운 기술의 애플리케이션의 생성 등의 elegans. C. 엘레 몸 껍질은 투명합니다. 따라서 세포는 쉽게 성인 및 표준 현미경을 사용하여 난자에 시각화 될 수있다. 지난 40 년 동안, C. 엘레 커뮤니티 C.를위한 귀중한 자원을 만들었습니다 돌연변이, 녹아웃 및 형질 전환의 큰 컬렉션, 신경계 (8)의 전체 복원 등의 해부학과 개발 6,7에 대한 자세한 설명, 잘 주석과 공동체 전체에 사용할 수있는 완전히 시퀀스 게놈 (포함 엘레 조사 www.wormbase.com ).

많은 장점에도 불구하고, 몇 가지 실험 방법은 C에 도전 한 엘레. 이러한 조직 또는 세포 유형의 세포 및 아이솔레이션의 원형질막에 액세스를 필요로하는 것들을 포함한다. 실제로 C. 엘레 조직은 쉽게 효소 처리 또는 세제에 의해 소화되지 않는 그 압력 수압 골격 내에 국한된다. 1990 년대 말에 미리 암 굿맨과 자넷 리치먼드 C.의 전기 생리학 녹음하는 방법을 개척 엘레현장 9,10에있는 신경 세포와 근육 세포. 이러한 방법은 우리에게 신경 및 생체 내에서 근육의 기능에 중요한 통찰력을 준 반면, 도전과 낮은 처리량이다. 생체 내에서 세포의 기능을 연구하는 다른 방법은 대부분, 특히 같은 GCamP과 카멜레온 11-13로 유전자 인코딩 칼슘 센서를 사용하여 생체 내 칼슘 이미징, 개발했다. 그들이 그대로 살아있는 동물에 적용되기 때문에 이러한 방법은 그러나, 약리학 적 도구의 사용을 허용하지 않는다.

배양 C.의 첫 번째 시도 대규모 체외에서 elegans의 세포는 자신의 박사 학위 논문 (14)의 준비 기간 동안 레어 꽃에 의해 만들어졌다. 불행히도, 어려움이 기판에 세포 접착 불량으로 발생한 불량 세포 분화 및 생존은 강력한 세포 배양 방법으로 초기 프로토콜의 설립을 방지. 1995 년 에드가와 동료 절차를 출판단일 C의 분리 및 배양 세포 분열 형태 형성을 알아보고자 하였다. 엘레 15 배아. 효소 처리 및 수동 해리의 조합으로 달걀 껍질의 소화하여 얻은 배아 세포는 ~ 500 세포를 15까지 생산, 증식을 계속했다. 그 후, 양조위와 동료 장 형태 형성을 연구하는 할구의 작은 숫자를 배양. 그들은 하나의 체외 격리 E의 할구가 혀끝있는 adherens 접속점 (16)를 통해 서로 상호 작용에 의해 장 루멘과 유사한 구조를 만든 편광 장 세포를 생산 것을 보여 주었다. Buechner와 동료는 또한 배양 C에 대한 유사한 방법을보고했다. 관내 17 배아 세포 엘레 간스.

초기 작업을 바탕으로, 크리와 동료 배아 C를 배양하기위한 강력한 프로토콜을 개발했다. 엘레 체외 1 세포. 그들그 고립 C를 보였다. 엘레 세포는 다양한 세포 유형으로 분화 및 세포 특정 마커의 발현을 포함하여 그들은 생체 내에서 소유 기능을 유지할 수있다. 생체 내에서 도전하고 몇 가지 기술, 절연 C.에 적용 할 수 있습니다 배아 세포 엘레 간스. 이러한 전기 생리학 1,18 19, 이미징 및 면역 화학적 방법 (20, 21)뿐만 아니라, 세포의 특정의 cDNA 라이브러리 (22, 23)의 건설 (FACS)를 정렬 형광 활성화 된 셀에 의해 특정 세포 유형의 격리 (가) 있습니다. 이러한 RNA 간섭 (RNAi의)와 같은 유전자 녹다운 (knockdown) 기술은 배양 된 C.에 적용 할 수 있습니다 엘레 셀 1 및 당 단백질 발견을위한 도구로서 아지 설탕을 사용한 신규 한 대사 표지 방법은 최근 체외 배양 C. 개발되었다 엘레 세포 24.

결론적으로, 세포 배양 방법은 어레이 O를 앞서C.에 적용 할 수있는 F 기법 살아있는 유기체의 컨텍스트에서 유전자 기능을 해독하기위한 노력의 elegans 모델. 우리는 C.를 배양 여기 프로토콜을 설명 주로 첫 번째 크리스티안와 동료 1에 기술 된 프로토콜을 기반으로 체외에서 배아 세포 엘레 간스.

프로토콜

크리스텐슨 등과 비교하여 별표 (*)는 신규 또는 수정 된 단계를 나타냅니다. 1

1. 재질 설정

  1. 세포 배양 과정은 임신하는 인원수로부터 격리 계란 대량을 요구한다. C. 성장한다 계란의 대량 분리하는 박테리아 - 엘레 8P 한천 플레이트에 NA22 (CGC C. elegans의 유전 컨소시엄을 통해 사용 가능)과 시드. 이 판에 사용 펩톤의 양은 일반적으로 NGM 플레이트에 사용되는 8 배의 양입니다. 높은 펩톤 농도 OP50가-두꺼운 층 성장에 반대되는,보다 효율적 NA22 박테리아의 성장을 유지한다.

8P 접시 조리법 :

3g 염화나트륨, 20g 박토 - 펩톤, 30 분간 멸균 및 오토 클레이브의 1 L에 25g의 한천을 녹인다. 55 ° C에서 매체의 열이 식도록 한 후 1 ㎖ 1 MgCl2를 콜레스테롤의 멸균 여과 1 ㎖ (EtOH를 5 ㎎ / ㎖)을 추가,, 망초 1 ㎖ 및 KP 버퍼 (500 ㎖의 재고 : 5g의 K 2 HPO 4, 30g의 KH 2 PO 4, 산도 6.00) 25 ㎖. 10cm 배양 접시 (25 ㎖ / 플레이트)에 액체 한천 배지를 붓는다.

  1. 다음날 NA22 E. 1 ㎖로 농축 각 펩톤 한천 판의 표면 전체에 확산 2XYT 미디어 (16g 트립 톤, 10g의 효모 추출물, 멸균, 산도 7.0의 1 L에 5g의 NaCl) 37 ° C에서의 대장균 밤새 배양 이러한 박테리아는 임신하는 인원수 다량의 성장을지지하는 두꺼운 층을 형성 할 것이다 풍부한 음식 소스를 구성한다. 박테리아의 성장을 할 수 있도록 실온에서 하룻밤 시드 판을 둡니다. 이 과정은 4 ~ 5 시간 동안 37 ° C에서 배양에 의해 가속 될 수있다.
  2. 시드 8P 접시에 굶주린 동물을 전송합니다. 5-6 M9 버퍼 또는 ㎖의 물을 사용하여 굶주린 NGM 플레이트를 동물을 씻어 각 8P 판에 현탁액의 1-2 ML을 추가합니다.
  3. 동물의 성장과 증식이 UNT 허용일리노이 플레이트를 임신하는 성인에 의해 합류에 채워집니다.
  4. C.의 제조에 필요한 달걀을 분리 용해 액의 5-6 ML을 사용하여 임신하는 성인의 배아 세포를, 엘레.

용해 액 레시피

신선한 표백제의 5 ㎖, 10 N NaOH를 1.25 ㎖의 멸균 H 2 O의 18.5 ML 이 혼합물을 사용하기 전에 매번 신선한 준비해야합니다.

  1. 계란 버퍼를 사용하여 임신하는 성인으로부터 격리 계란을 세척 :

계란 버퍼 레시피

118 밀리미터의 NaCl, 48 mM의 KCl을, 2 MM의 염화칼슘, 2 mM의 MgCl2를, 25 mM의 헤 페스, pH가 7.3, 삼투압이 340 mOsm.

  1. 키틴으로 처리하여 계란을 둘러싼 껍질을 제거합니다. 키티 나제는 산성 pH 25에서 가장 높은 활성을 가진 효소이다. 2 ㎎ / ㎖의 최종 농도 달걀 버퍼 pH를 6.5로 키티 나제 (시그마, 카탈로그 없음. C6137)을 녹인다. 키티 나제 주식을 저장멸균 15 ML 원뿔 튜브에 1 ㎖ 분량 씩 -20 ° C에서 솔루션을 제공합니다. 분취 량은 몇 개월 -20 ° C의 최대 저장할 수 있습니다.
  2. C. 성장한다 땅콩 렉틴으로 덮여 멸균 커버 슬립 (12mm 직경)에 elegans의 배양 세포. 멸균 (0.5 ㎎ / ㎖)에 땅콩 렉틴을 녹입니다. 땅콩 렉틴 용액을 여과 또는 멸균 할 수 없습니다. 또한 UV 광으로 처리 될 필요가 없다. 최대 6 개월 -20 ° C에서 보관 2 ㎖ 씩 분주.
  3. 완전한 세포 배양 배지 (500 ml)을 깁코, 50 ㎖ 태아 혈청 (열 불 활성화), 19.5 g의 수 크로스 (45 mOsm), 100 U / ㎖ 페니실린 및 100 μg 5 ㎖ /부터 500 ㎖ L-15 배지가 포함 ml의 스트렙토 마이신 (2 %). 완전 배지는 다음 0.20 μm의 기공 필터를 사용하여 필터링된다.

계란 버퍼와 배지를 각각 340의 삼투압이 345 mOsm을 가지고 있습니다. 실제로, 포유 동물 세포에 반대, C. 엘레 세포는 비교적 높은 삼투압을 가지고즉, 세포의 세포막과 직접 접촉 할 수있는 솔루션을 준비 할 때 카운트 고려 될 필요가있다. 이러한 시약의 조리법 osmometer 하나를 사용하여 측정 하였다 원하는 삼투압에 도달하도록 조절 하였다. 이들 레시피를 정확히 따르는 손질 이들 시약의 제조에 사용되는 경우 osmometer를 사용할 필요가 없다. 다른 솔루션은 그 조리법 여기에보고되지 않습니다 또는 C를 사용하는 게시의 경우에, 준비해야하는 경우, 하나는 osmoter를 사용한다 배양 된 세포 엘레 간스.

2. 계란 격리

  1. 그것은 (24 - 웰 플레이트에서) 배양 된 세포의 12 우물에 충분한 계란을 수집하기 위해 적어도 네 8P 플레이트로 시작하는 것이 좋습니다.
  2. 절차를 시작하기 전에 땅콩 렉틴 원액 한 튜브를 해동. 24 웰 플레이트의 우물의 바닥에 멸균 커버 슬립을 놓고 커버 슬립에 땅콩 렉틴의 200 μl를 추가합니다. 1 시간 또는 u 품다그리로 갈때 세포는 도금 될 준비가 된 것입니다. 완전히 땅콩 렉틴을 제거하고 멸균 멸균 물 1 ㎖로 한 우물을 씻어. 커버 슬립의 땅콩 렉틴의 완전한 제거는 세포의 응집을 방지하는 데 필수적이다.
  3. 멸균 멸균 물을 사용하여 한천 플레이트 떨어져 임신하는 성인을 씻으십시오. 두 멸균 원뿔 50 ML 튜브로 현탁액을 수집합니다. 튜브 (*)의 하단에있는 벌레의 강수량을 할 수 있도록 최대 5 분 동안 얼음에 튜브를 남겨주세요. 전송 플라스틱 피펫으로 물을 제거하고 신선한 멸균 멸균 물을 교체합니다. 200 XG 10 분 (~ 1,200 RPM) (*)에서 테이블 탑 원심 분리하여 웜 펠렛. 적어도 3이 마지막 단계를 반복합니다.
  4. 멸균 15 ML 원뿔 튜브로 웜을 전송하고 200 XG에 10 분 동안 (~ 1,200 RPM) (*)에 그들을 펠렛. 뿐만 아니라 튜브의 하단에있는 박테리아를 수집하지 않도록하기 위해 더 높은 원심 분리 속도를 사용하지 마십시오. 때로는 centrifugations 후 벌레가 완전히 펠렛되지 않습니다. AF터 각 세척 및 제거하기 전에 상층 액을 얼음에 5 분 동안 튜브를 놓습니다. 식힌 물 웜 튜브 바닥에 침전.
  5. 물을 제거하고 용해 액의 5 ~ 6 mL를 넣고 (재료가 설정 참조). 5 ~ 10 분 동안 부드럽게 정지 록하고 매 2-3 분 실체 현미경을 이용하여 웜 용해 모니터링을 시작합니다. 현탁액의 방울은 쉽게 검사 용 커버 슬립 상에 배치 될 수있다. 배양 시간은 표백제의 신선도에 따라 달라집니다, 표백제의 작은 병을 구입하고 매월 새로운 병을 엽니 다.
  6. ~ 웜 70 ~ 80 %의 (배양 시작부터 10 분)를 용해하는 경우, (재료가 설정 참조) 계란 버퍼 산도 7.3의 9 ML을 추가하여 용해 반응을 중지합니다. 10 분 동안 200 XG (~ 1,200 RPM)에서 현탁액을 원심 분리기. 계란 (*)의 재 오염을 방지하기 위해 벤치에 분젠 버너를 가지고이 시점에서.
  7. 조심스럽게 멸균 플라스틱 전송 피펫을 사용하여 상층 액을 제거하고 펠렛 3-4 씻어용액을 명확 X 달걀 완충액까지. 각 세척하는 동안 알 버퍼에 펠릿 잘 혼합해야합니다.
  8. 계란 30 % 수크로오스 용액을 사용하여 동물 사체로부터 분리된다. 살균 계란 버퍼의 2 ㎖에 펠렛을 재현 탁 2 ML 60 % 자당 용액 (살균 계란 버퍼의 주식을)를 추가합니다. 잘 섞어 200 XG (~ 1,200 RPM) (*)에서 20 분 동안 원심 분리.
  9. 조심스럽게 원심 분리기에서 튜브를 제거합니다. 계란은 솔루션의 상단에 떠있다. P1000의 피펫 멸균 팁을 사용, 신선한 멸균 15의 ML 원뿔 튜브에 모든 달걀을 전송합니다.
  10. 10 분 200 XG (~ 1,200 RPM)에서 튜브와 원심 분리기에 살균 계란 버퍼 10 ML을 추가합니다. 세척 3 X를 반복합니다. 계란이 완전히 각 세척하는 동안 알 완충액되어 있는지 확인하십시오.

3. 배아 세포 해리

층류 후드를 사용하여 멸균 조건 하에서 과정의 다음 단계를 실시한다. 동물은 있지만모든 박테리아하지 않을 경우 대부분 제거해야 세균 플레이트, 세척 및 표백제가 포함 된 용해 용액으로 처리에 가운. 따라서 과정의이 시점에서 층류 후드를 사용하는 달걀 현탁액의 새로운 오염을 방지한다.

  1. 2 ㎎ / ㎖ 키티 나제 (계란 버퍼의 pH 6.5 (*) 재고) 1 ㎖에 계란 펠렛을 재현 탁하고 새로운 멸균 15 ML 원뿔 튜브로 전송할 수 있습니다. 실온에서 10-30 분 동안 튜브를 흔들어. 정확한 배양 시간은 효소와 실내 온도의 신선도에 따라 변화하고, 따라서 각각의 제조에 대해 결정되어야한다. 그것은 배양 10 분 후 반전 된 세포 배양 현미경으로 계란을 모니터링을 시작하는 것이 좋습니다. 참고 : 우리의 경험에서, 낮은 pH는 키티 나제 효소의 활동을 증가시킨다. 이러한 이유로 우리는 키티 나제 (pH를 수산화 나트륨을 사용하여 6.5로 조정 위에서보고 레시피를) 용해 pH가 6.5에 달걀 버퍼를 사용합니다.
  2. ~ 달걀 껍질의 80 %가 소화 될 때키티 나제 치료 (그림 1 AB)는 900 XG 3 분 (~ 2,500 RPM) (*)에서 원심 분리하여 계란 펠렛. P1000의 피펫 멸균 팁을 사용하여 조심스럽게 뜨는을 제거하고 L-15 배지 3 ㎖ (*)를 추가합니다.
  3. 6cm 직경 플레이트에 달걀을 전송하고 부드럽게 18 G 바늘을 구비 한 10 ㎖ 멸균 주사기를 사용하여 세포를 해리. 신선한 플라스틱 페트리 접시에 현탁액 드롭을 배치하고 현미경으로 보면 해리도를 모니터한다. 손상 세포를 방지하기 위해이 절차를 수행하는 동안 주사기로 공기를 흡인하지 마십시오. 세포의 80 %가 분해됩니다 ~까지 해리를 계속합니다.
  4. 살균 5 μm의 밀리 포아 필터를 사용하여 현탁액을 필터링합니다. 세포 현탁액은 세포 덩어리, 소화되지 않은 계란과 부화 유충을 제거하기 위해 필터링해야합니다. 모든 세포를 복구하기 위해 필터를 통해 신선한 L-15 미디어의 추가 4 ~ 5 ㎖의 필터. DA을 방지하기 위해 여과 단계에서 과도한 힘을 사용하지 마십시오필터 및 / 또는 세포를 maging.

4. 세포를 배양

  1. 3 분 (*) 900 XG (~ 2,500 RPM)에서 원심 분리하여 해리 세포 펠렛. P1000의 피펫 멸균 팁을 사용하여주의 깊게 뜨는을 제거합니다. 전체 L-15 중간 플레이트 1 ML / 잘 펠렛 세포를 Resuspend. 첨가 매체의 사용량은 8P 플레이트의 개수, 접시에 웜의 합류 및 셀에 대해 수행 될 실험의 유형에 따라 달라진다. 세포 밀도는 혈구 계를 사용하여 측정 할 수있다. ~ 230,000 셀 / ㎠가 최적의 밀도를 도금 패치 클램프 녹음하십시오.
  2. 배양액의 증발을 방지하기 위해 젖은 종이 타월을 함유 플라스틱 섬유 복합 재질 용기에서 24 웰 플레이트를 유지한다. 20 ° C와 주위 공기에 가습 인큐베이터에서 컨테이너를 저장합니다.
  3. 세포는 보통 24 시간 이내에 실험을위한 준비가되었을 때 형태 학적 분화와 표현GFP 마커의 이온이 완료됩니다. 세포는 최대 2 주 동안 문화 유지 될 수 있지만, 도금 후 보통 7-9일까지 대부분의 건강. 매체는 건강한 세포를 유지하기 위해 하루에 한 번 교체해야.

결과

C. 배양 세포가 특정 마커를 차별화하고 표현 세포 엘레

크리스텐슨과 트리 판 블루 염색법을 사용하여 동료는 것을 보여 주었다 배아 C.의> 99 % 엘레 세포는 분리 절차를 생존. 9 일 도금 후 22에서 각각 85 %와 65 %는 여전히 1 살아있다. 고립 된 배아 C. 엘레 세포 분화하기 위하여 기판에 부착한다. 양식 대단히 짧은 시간을 준수하는 데 ...

토론

C. elegans의 개발, 행동과 노화에 관련된 유전자 경로를 해독하기위한 강력한 모델 생물이다. 그것의 편익은 주로이 유전자 조작 할 수있는 용이성에서와 짧은 수명주기에서 유래한다. 의 편의에도 불구하고, C. 엘레는 한계가있다. C.를 엘레 세포는 작은 그러한 마이크로 어레이 분석에 의해 유전자 발현 프로파일과 직접적인 같은 전기 생리학 및 약리학 기술 등 셀에 대한 액세...

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
REAGENTS
Bacto PeptoneVWR International Inc.90000-382
Difco Agar GranulatedVWR International Inc.90000-784
Bacto TryptoneVWR International Inc.90000-284
Bacto Yeast ExtractVWR International Inc.90000-724
Leibovitz's L-15 Medium (1x) LiquidInvitrogen11415-064
Fetal Bovine SerumInvitrogen16140-063
Penicillin-streptomycinSigmaP4333-100ML
Chitinase from Streptomyces GriseusSigmaC6137-25UN
NA22 Escherichia coliCaenorhabditis Genetics Center
Peanut LectinSigmaL0881-10MG
SucroseSigma57903-1KG
D-(+)GlucoseSigma67528-1KG
Ethylene glycol-bis (2-amin–thylether), N,N,N',N'- tetraacidic acid (EGTA)SigmaE0396-25G
HepesSigmaH3375-500G
Cholesterol
NaClSigma57653-1KG
KClSigmaP9333-500G
CaCl2SigmaC1016-500G
MgCl2SigmaM8266-100G
MgSO4SigmaM2643-500 g
K2HPO4SigmaP2222-500G
KH2PO4SigmaP9791-500G
NaOHSigmaS8045-500G
KOHSigmaP1767-500G
Ethanol
Autoclaved distilled H2O
Bleach
EQUIPMENT
101-1000 μl Blue Graduated Pipet TipsUSA Scentific1111-2821
10 ml Sterilized Pipet Individually WrappedUSA Scentific1071-0810
Ergonomic Variable Volume (100-1000 μl) Pipettor with tip ejectorVWR International Inc.89079-974
Portable Pipet Aid, DrummondVWR International Inc.53498-103
Transfer Plastic Pipet SterileVWR International Inc.14670-114
15 ml Conical Tube USA Scentific1475-1611
50 ml Conical TubeUSA Scentific1500-1811
Sterile 18 gauge NeedlesBecton, Dickinson and Co.305196
Sterile 10 ml SyringesBecton, Dickinson and Co.305482
Plastic Syringe Filters Corning 0,20 μm pore size Corning431224
Acrodic 25 mm Syringe filter w/5 μm versapor MembraneVWR International Inc.28144-095
60x15 mm Petri Dish SterileVWR International Inc.82050-548
100x15 mm Petri Dish SterileVWR International Inc.82050-912
12 mm Diameter Glass CoverslipsVWR International Inc.48300-560
Clear Cell Culture Plates 24 Well Flat Bottom w/lid Thomas scientific6902A09
Dumont #5- Fine Forceps Fine Science Tools11254-20
Centrifuge 5702Eppendorf022629883
Laminar Flow Hood
Inverted Microscope with x10 objective
Ambient air humidified Incubator

참고문헌

  1. Christensen, M., et al. A primary culture system for functional analysis of C. elegans neurons and muscle cells. Neuron. 33, 503-514 (2002).
  2. Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R., Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. . C. elegans II. , (1997).
  3. Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans. Molecular and cellular biology. 5, 3484-3496 (1985).
  4. Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C. elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. The EMBO journal. 10, 3959-3970 (1991).
  5. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
  6. Sulston, J. E., White, J. G. Regulation and cell autonomy during postembryonic development of Caenorhabditis elegans. Developmental biology. 78, 577-597 (1980).
  7. Chalfie, M. Caenorhabditis elegans development. Current opinion in cell biology. 1, 1122-1126 (1989).
  8. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological sciences. 314, 1-340 (1986).
  9. Goodman, M. B., Hall, D. H., Avery, L., Lockery, S. R. Active currents regulate sensitivity and dynamic range in C. elegans neurons. Neuron. 20, 763-772 (1998).
  10. Richmond, J. E., Jorgensen, E. M. One GABA and two acetylcholine receptors function at the C. elegans neuromuscular junction. Nature. 2, 791-797 (1038).
  11. Miyawaki, A., Griesbeck, O., Heim, R., Tsien, R. Y. Dynamic and quantitative Ca2+ measurements using improved cameleons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 2135-2140 (1999).
  12. Kerr, R., et al. Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of C. elegans. Neuron. 26, 583-594 (2000).
  13. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature. 19, 137-141 (2001).
  14. Bloom, L. . Genetic and molecular analysis of genes required for axon outgrowth in Caenorhabditis elegans. , (1993).
  15. Edgar, L. G. Blastomere culture and analysis. Methods in cell biology. 48, 303-321 (1995).
  16. Leung, B., Hermann, G. J., Priess, J. R. Organogenesis of the Caenorhabditis elegans intestine. Developmental biology. 216, 114-134 (1999).
  17. Buechner, M., Hall, D. H., Bhatt, H., Hedgecock, E. M. Cystic canal mutants in Caenorhabditis elegans are defective in the apical membrane domain of the renal (excretory) cell. Developmental biology. 214, 227-241 (1999).
  18. Suzuki, H., et al. In vivo imaging of C. elegans mechanosensory neurons demonstrates a specific role for the MEC-4 channel in the process of gentle touch sensation. Neuron. 39, 1005-1017 (2003).
  19. Carvelli, L., McDonald, P. W., Blakely, R. D., Defelice, L. J. Dopamine transporters depolarize neurons by a channel mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 16046-16051 (2004).
  20. Bianchi, L., et al. The neurotoxic MEC-4(d) DEG/ENaC sodium channel conducts calcium: implications for necrosis initiation. Nature. 7, 1337-1344 (2004).
  21. Frokjaer-Jensen, C., et al. Effects of voltage-gated calcium channel subunit genes on calcium influx in cultured C. elegans mechanosensory neurons. Journal of neurobiology. 66, 1125-1139 (2006).
  22. Von Stetina, S. E., et al. Cell-specific microarray profiling experiments reveal a comprehensive picture of gene expression in the C. elegans nervous system. Genome biology. 8, R135 (2007).
  23. Fox, R. M., et al. A gene expression fingerprint of C. elegans embryonic motor neurons. BMC genomics. 6, 42 (2005).
  24. Burnham-Marusich, A. R., et al. Metabolic Labeling of Caenorhabditis elegans Primary Embryonic Cells with Azido-Sugars as a Tool for Glycoprotein Discovery. PloS one. 7, e49020 (2012).
  25. Kim, K. J., Yang, Y. J., Kim, J. G. Purification and characterization of chitinase from Streptomyces sp. M-20. Journal of biochemistry and molecular biology. 36, 185-189 (2003).
  26. Chalfie, M., Wolinsky, E. The identification and suppression of inherited neurodegeneration in Caenorhabditis elegans. Nature. 345, 410-416 (1990).
  27. Parpura, V. Voltage-gated calcium channel types in cultured C. elegans CEPsh glial cells. Cell calcium. 50, 98-108 (2011).
  28. Miller, D. M., Niemeyer, C. J. Expression of the unc-4 homeoprotein in Caenorhabditis elegans motor neurons specifies presynaptic input. Development. 121, 2877-2886 (1995).
  29. Lickteig, K. M., et al. Regulation of neurotransmitter vesicles by the homeodomain protein UNC-4 and its transcriptional corepressor UNC-37/groucho in Caenorhabditis elegans cholinergic motor neurons. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 21, 2001-2014 (2001).
  30. Zhang, H., et al. UNC119 is required for G protein trafficking in sensory neurons. Nature. 14 (7), (2011).
  31. Maduro, M., Pilgrim, D. Identification and cloning of unc-119, a gene expressed in the Caenorhabditis elegans nervous system. Genetics. 141, 977-988 (1995).
  32. Chalfie, M., Sulston, J. Developmental genetics of the mechanosensory neurons of Caenorhabditis elegans. Developmental biology. 82, 358-370 (1981).
  33. Fukushige, T., et al. MEC-12, an alpha-tubulin required for touch sensitivity in C. elegans. Journal of cell science. 112 (Pt. 3), 395-403 (1999).
  34. Driscoll, M., Chalfie, M. The mec-4 gene is a member of a family of Caenorhabditis elegans genes that can mutate to induce neuronal degeneration. Nature. 349, 588-593 (1991).
  35. Xu, K., Tavernarakis, N., Driscoll, M. Necrotic cell death in C. elegans requires the function of calreticulin and regulators of Ca(2+) release from the endoplasmic reticulum. Neuron. 31, 957-971 (2001).
  36. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual review of physiology. 46, 455-472 (1984).
  37. Strange, K., Christensen, M., Morrison, R. Primary culture of Caenorhabditis elegans developing embryo cells for electrophysiological, cell biological and molecular studies. Nature protocols. 2, 1003-1012 (2007).
  38. Goodman, M. B., Lockery, S. R. Pressure polishing: a method for re-shaping patch pipettes during fire polishing. Journal of neuroscience. 100, 13-15 (2000).
  39. Nickell, W. T., Pun, R. Y., Bargmann, C. I., Kleene, S. J. Single ionic channels of two Caenorhabditis elegans chemosensory neurons in native membrane. The Journal of membrane biology. 189, 55-66 (2002).
  40. Ward, A., Liu, J., Feng, Z., Xu, X. Z. Light-sensitive neurons and channels mediate phototaxis in C. elegans. Nature neuroscience. 11, 916-922 (2008).
  41. Parpura, V. Cell culturing of Caenorhabditis elegans glial cells for the assessment of cytosolic Ca(2)(+) dynamics. Methods Mol. Biol. 814 (2), 153-174 (2012).
  42. Zhang, Y., et al. Identification of genes expressed in C. elegans touch receptor neurons. Nature. 418, 331-335 (2002).
  43. Cinar, H., Keles, S., Jin, Y. Expression profiling of GABAergic motor neurons in Caenorhabditis elegans. Current biology : CB. 15, 340-346 (2005).
  44. Bacaj, T., Tevlin, M., Lu, Y., Shaham, S. Glia are essential for sensory organ function in C. elegans. Science. 322, 744-747 (2008).
  45. Colosimo, M. E., et al. Identification of thermosensory and olfactory neuron-specific genes via expression profiling of single neuron types. Current biology : CB. 14, 2245-2251 (1016).
  46. Shih, J. D., Fitzgerald, M. C., Sutherlin, M., Hunter, C. P. The SID-1 double-stranded RNA transporter is not selective for dsRNA length. RNA. 15, 384-390 (2009).
  47. O'Hagan, R., Chalfie, M., Goodman, M. B. The MEC-4 DEG/ENaC channel of Caenorhabditis elegans touch receptor neurons transduces mechanical signals. Nature. 8, 43-50 (2005).
  48. Du, H., Gu, G., William, C. M., Chalfie, M. Extracellular proteins needed for C. elegans mechanosensation. Neuron. 16, 183-194 (1996).
  49. Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. Isolation and culture of larval cells from C. elegans. PloS one. 6, e19505 (2011).

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