여러 종양 마커의 대상으로하기위한 Polymalic 산 기반의 나노 생물 고분자 물질 : 개인화 된 약을위한 기회?

요약

polymalic 산계 나노 약물의 예는 암에 적용 가능하다 맞춤 의학의 합리적인 디자인으로 제시된다. 그것은 누드 마우스에 HER2가 긍정적 인간 유방암을 치료하는 나노 약물의 합성을 설명한다.

초록

Tumors with similar grade and morphology often respond differently to the same treatment because of variations in molecular profiling. To account for this diversity, personalized medicine is developed for silencing malignancy associated genes. Nano drugs fit these needs by targeting tumor and delivering antisense oligonucleotides for silencing of genes. As drugs for the treatment are often administered repeatedly, absence of toxicity and negligible immune response are desirable. In the example presented here, a nano medicine is synthesized from the biodegradable, non-toxic and non-immunogenic platform polymalic acid by controlled chemical ligation of antisense oligonucleotides and tumor targeting molecules. The synthesis and treatment is exemplified for human Her2-positive breast cancer using an experimental mouse model. The case can be translated towards synthesis and treatment of other tumors.

서문

암의 게놈이 (생명 공학 및 암 게놈지도 책에 대한 국립 센터) 풀어되었을 때 포스트 게놈 시대에 암 미래의 치료는 종종 같은 종양 ^1-4에서 종양의 유전 적 다양성을 설명 할 것이다. 생물 정보학 및 비용, 빠른되지 DNA 시퀀싱 할 수있는 개인 수준 ^2,4,5에 악성 유전자 / 돌연변이의 인수. 유전자가 확인 된 후에, 환자는 악성 유전자 ^6의 발현을 수정하거나 침묵하는 맞춤 의학으로 취급됩니다. 암세포를 표적으로하고있는 세포로 약물을 전달하기 위해 필요 작용기 전달 시스템을 요구한다. 물론, 나노 약물은이 요구 사항 ^7을 충족 할 수 있습니다.

발견의 노도에서 나노 입자는 화학 요법 약물, 단백질 및 / 또는 암 세포에 유전자 활성 물질의 페이로드를 가지고 적당한 입증했다. 그러나 부작용은 광고로 남아옷을 입고있다. 생분해의 부재와 관련된 그 중 하나는 질병을 야기 할 수있는 가능성과 건강한 조직과 기관에 자료의 침착의 원인이 될 수 있습니다. 증착을 최소화하기 위해, 우리는 비 독성과 비 면역 원성 polymalic 미생물 유래입니다 산, 그리고 H ₂ O와 CO ₂ ⁸ 생분해을 소개했다. 우리는 나노 약물의 모든 기능을 하나의 공유 유형을 합성 폴리머를 사용합니다. 그런 테모 졸로 미드, 독소루비신, 또는 안티센스 올리고 뉴클레오티드 및 혈관 외 유출, 조직 타겟팅, endosomolytic 배달 서비스를 제공 작용기를 화학적으로 부착 된 화학 요법이 포함되어 있습니다. 그들은 따라서 자신의 모든 제약 활동을 재생, 표적 종양 세포에 도착했을 때 약물은 본질적으로 나노 플랫폼에서 절단됩니다.

우리는 고분자 나노 플랫폼의 미생물 생산 방법, 그 정화 및 암 트라 스투 주 마브 (허셉틴)을 포함 나노 약물의 화학 합성을 서술HER2의 과잉 생산의 억제에 대한 타겟팅 및 안티센스 올리고 뉴클레오티드. 누드 마우스에 이종 인간 HER2가 양성 유방암에 나노 약물을 적용, 우리는 암 치료의 높은 효능을 보여줍니다. polymalic 산 나노 약물 여기 소개 종양 타겟팅 및 유전자 침묵의 원칙은 암의 다른 경우의 치료에 적용 할 수 있습니다.

프로토콜

모든 실험은 생체 내에서 수행 IACUC 프로토콜을 전체에 따른다 수술 및 비수술 절차를 포함하여 공식 동물의 규정을 준수합니다.

Polymalic 산 1. 생물 생산

1. 한천에 소 구체에서 시드 문화를 성장 보육 및 기초 배지 ^{8,9 진술} 열 25 ° C를 사용하여 100 ㎖의 배양 배지에 변형체를 전송할 수 있습니다.
2. 포자 형성을 방지하기 위해 빛의 배제하에 중력 포장 500 ㎖ 마이크로 변형체의 양을 생성한다.
3. 10 L 생물 반응기 용기에 8 L의 기초 배지에 현탁 _{80g의를 CaCO3를} 준비합니다. 장착 된 반응 용기에 500 ㎖의 포장 마이크로 변형체를 전송하고 25 ° C, 여과 된 공기와 세그먼트 교반 150 rpm으로 교반의 10 L / min의 유량에서 75 시간 동안 생물 공정을 할 수 있습니다.
4. 배양액은 PMLA의 생산의 끝을 나타내는 pH가 4.8이 될 때 종료 및 T에 의하여 PMLA 함량을 측정그 / 철 (III) 분석법 히드.
5. 17 ° C로 국물을 냉각하고 세포가 중력에 의해 해결 할 수 있습니다.
6. 4 ° C로 냉각하고는, pH를 7.5로 조정 2 M NaOH를 사용합니다. (5 ° C에서 20 mM 트리스 - 염산의 pH 7.5와 평형을 거친 곡물 DEAE) 위쪽으로 방향을 바닥에 DEAE-셀룰로오스 1.5 L로 채워진 칼럼을 통해 상층 액을 펌프.
7. 위쪽에서 아래쪽으로 방향을 변경 한 후 0.3 M의 NaCl을 포함하는 버퍼의 3 열 세척하고 0.7 M 염화나트륨의 존재에 PMLA을 용출.
8. 0.1 M 염화칼슘 _2로 조정하고 80 %의 얼음 냉 에탄올로 PMLA 칼슘을 침전. 50 kDa의 버퍼와 소금이없는 상태에서 물을 사용 - 300 kDa의 50 - - 80 kDa의, 10 (80)의 PMLA 칼슘에 세파 덱스 G25을 통해 분별.
9. 앰버 IR의 120H ⁺ 칼럼을 통해 각 부분을 통과하고, 즉시 동결 건조 용 액체 질소의 흐름을 통해 polymalic 산을 동결.
10. 건조 아세톤에 용해. 여과 후, 용매를 제거마이너스 20 ℃에서 건조 공기의 흐름, 냉동 건조 및 저장에

2. Polymalic 산 기반의 나노 의약품의 합성

1. 무수 아세톤 1 ㎖를 2 ㎖의 디메틸 포름 아미드 (DMF)의 1 밀리몰 N-히드 록시 숙신이 미드 및 1 밀리몰 디시 클로 헥실 카르 보디이 미드에서 PMLA-H의 116 mg의 (1 밀리몰 malyl 단위)를 혼합함으로써 PMLA (P)의 카르복실기를 활성화. 3 시간 동안 20 ℃에서 교반 하였다. 을 mPEG _{5000-NH 2} 0.05 밀리몰 트리 에틸 아민 (TEA) 다음에 1 ㎖의 DMF에 (malyl 단위 0.05 몰 %)의 0.05 밀리몰을 추가합니다.
2. 현명한 DMF 0.4 밀리몰 류신 에틸 에스테르 (LOEt) (malyl 단위의 40 몰 %)에 용해 드롭 추가 0.1 밀리몰 2 - 티올 일 - 에틸 아민 (2-MEA) (malyl 단위의 10 몰 %) 및 ​​0.5 밀리몰 TEA, 모든 DMF에 용해시켰다. 각 첨가 한 후, 1 시간을 허용하고 응답 (박층 크로마토 그래피, TLC) 닌히 드린 음으로 반응 완료를 확인합니다.
3. 인산염 완충 생리 식염수 (30 분, 산도 6.8)와 자연 가수 분해에 의해 남은 NHS-에스테르를 제거 마십시오. PD를 통해 탈염-10 열, 동결 건조하여 백색 분말로서 "preconjugate"를 얻을 수 있습니다. 마이너스 20 ℃에서 보관 건조
4. 100 MM의 인산 나트륨, 150 mM의 염화나트륨, pH를 5.5 4.5 ㎖에 30 밀리그램의 항체 (단클론 항체,의 IgG2a-κ)를 녹입니다.
5. 5 mM의 트리스 (2 - 카르복시 에틸) 20 ° C에서 30 분 동안 포스 염산염과 이황화 결합을 줄이고 PD-10 칼럼을 통해 정화.
6. 같은 버퍼의 2 ml의 말-PEG ₃₄₀₀ - 말을 녹이고 10 ㎖의 최종 부피의 감소 단클론 항체를 추가하고 4 ℃에서 밤새 교반 Vivaspin 20, 30 kD의 배제에 2.5 ml로 농축하고, 세파 덱스 G75을 통해 정화. 초 HPLC를 통해 제품을 확인하고 photometrically 280 nm 파장에서 양을 측정합니다.
7. 말 - PEG - 말 - 단클론 항체를 연결 "preconjugate"P / PEG ₅₀₀₀ (5 %) / LOEt (40 %) / 단클론 항체 (0.2 %) / 2-MEA (10 %)를 획득 티올. 위의 버퍼의 pH 5.5에서 50 밀리그램 (P /을 mPEG ₅₀₀₀ / LOEt/2-MEA) 200 nmol의 단클론 항체-PEG ₃₄₀₀ - 말의 5 ㎖를 혼합하여이 작업을 수행 할 sulfhy의 농도를 조정2 mm로 dryl 3 시간 (수율 98 %) 20 ° C에서 알을 품다.
8. 용해 3'-H ₂ N-AON DMF / PBS에서 테스트 닌 하이 드린 (1:1 V / V) DMF / 메탄올 (에 (산도 7.2)과 반응 N-숙신 3 - (2 - 피리 딜) 프로 피오 네이트 (SPDP) ) 후, 물 및 냉동 건조에, 메탄올 세파 덱스-LH20에 AON-PDP를 정화.
9. 이황화 교환 반응이 종료 될 때까지 밤새 상기에서 제조 된 말-PEG ₃₄₀₀ - 말 - 단클론 항체 - preconjugate와 5.5 pH 완충 800 nmol의 활성화 AONs을 품어.
10. 통합 형광 알렉사 플 루어 680 - 말레이 미드 고분자-2-MEA-SH와 티오 형성한다. 3 - 피리 딜 - 프로 피오 네이트 (PDP)를 초과 sulfhydryls을 차단하고 세파 덱스 G75을 통해 정화. 4 ° C에서 저장 또는 추가로 사용할 때까지 -80 ° C에서 냉동 스냅.

3. 분석 실험 및 속성

1. 초 HPLC 분석에 의해 4 ° C와 37 ° C에서 순도와 안정성 PBS의 혈청에 대한 테스트를 수행합니다. molec 폴리스티렌 술폰산을 사용신경근 무게 기준. 나노 크기 분포 및 제타 전위를 측정한다. 상용 시스템을 사용합니다.
2. 320 μL의 시료에 10 %의 160 μL (w / v)의 히드 록실 암모늄 클로라이드 및 10 %의 160 μL의 NaOH (V / W)를 추가합니다. 15 분 후, (W / V) 철 (III) CL ₃ 12 %에서 5 %의 160 μL와 혼합 (V / V) 염산 및 히드 / 철의 ₅₄₀ 읽기 (III). PMLA가 1 ㎎ / ㎖ PMLA 2.5 _(540)에 해당하는 가정 계산합니다.
3. 110 ° C에서 2 M 염산 하룻밤 나노 약물을 가수 분해 및 샘플을 참조하여 역상 크로마토 그래피에 대한 분석 사과산은 사과산 표준 스파이크. 100 mM의 디티 오 트레이 톨로 나노 약물을 베기 및 모르 폴리 노 AON 표준에 대한 정량적 인 역상 HPLC에 의해 모르 폴리 노 - AON을 측정합니다.
4. 절단하지 않고 나노 약물을 가지고 단백질 분석 키트를 사용하여 항체를 측정합니다. 암모늄 ferrothiocyanate과의 반응을 허용하여 mpeg 및 정량화, 클로로포름으로 추출하여 510 nm 파장 ^{(10)에서의} 흡광도를 읽고 .
5. 잘 항체 활동 및 colligation 테스트 당 나노 약물 (1-10 μg의 단클론 항체)의 5 ㎕ 씩 ELISA를 수행합니다. 판 코팅 항원 및 과산화 효소 결합 차 항체로 각각 0.5 ㎍ / 잘 트랜스페린 수용체 및 HER2를 사용합니다.
6. (예보기 표 1 및 표 2 참조), 사과산 (100 %)에 관해서 AON, mpeg 및 단클론 항체에 대해 달성 %를 계산하고 설계된 의도 %와 비교한다.

4. 시험 관내 시험

1. (4,5 - 디메틸 티아 졸 -2 - 일) -5 - - (3 - carboxymethoxyphenyl) -2 - (4 - 설포 페닐 옐로우 시약 [3을 줄이기 위해 자신의 활동에 의해 시간이 지남에 따라 세포 생존 배양 암세포와 메이저 나노 약물 부화 )-2H-테트라 졸, 내부 소금 (MTS) 청색 염료 및 광도계 상대 흡광도를 참조하십시오. 장비 공급 업체의 지시 사항을 따르십시오.
2. 체외 또는 웨스턴 블롯에 대한 생체의 세포 추출물을 준비합니다. 얼음처럼 차가운 추출 B를 사용SDS 및 프로테아제 억제제 칵테일이 포함 uffer. SDS-폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동을 감소 시켜서 별도의 단백질.
3. 샘플 추출에 대한 관심의 단백질을 웨스턴 블로 팅 작업을 수행합니다. 알칼리성 인산 가수 분해 효소에 접합 된 차 항체를 사용합니다.
4. 형광 라벨을 사용하여 세포의 이해와 나노 약물 폴리머 플랫폼, AON과 엔도 좀의 공동 현지화을 보여주기 위해 공 초점 현미경을 사용합니다. 형광 레이블로 AONs에 나노 복합 플랫폼과 리사 민 알렉사 플 루어 680을 연결합니다. 표지 된 분자의 분포를 시각화하는 현미경 5X 스펙트럼 스캐너와 살아있는 암세포를 사용
5. 얼룩 엔도 좀의 스티 릴 빨간 형광 염료 막과 엔도 좀의 colocalization을하거나 릴리스를 보여줍니다.

5. 생체 내 테스트

1. 인간의 HER2-양성 유방암의 마우스 모델 (: 크롬 : (MCR) Foxnnm 누드 마우스 전술)을 준비합니다. 펠렛을 방출 0.72 밀리그램의 17β-에스트라 디올을 삽입 (90 일 발매)의ubcutaneously 각 마우스의 목.
2. 그런 피하 오른쪽 측면에 1 × 10 ⁷ BT-474 종양 세포를 주입하고 종양이 성장하자.
3. 종양이 꼬리 정맥에 각 항체의 2.5 ㎎ / ㎏ AON 및 / 또는 4.5 ㎎ / ㎏을 함유하는 150 ㎕의 나노 복합체를 주입하여 크기가 120mm ³ 때 치료를 시작합니다. 처리를 위해, 일주일에 두 번 완전히 여섯 번을 주입.
4. 두 번 약한 캘리퍼스와 종양의 크기를 측정하고 식 (길이 x 높이 x 폭) × (π / 6)를 사용하여 볼륨을 계산합니다. 2 주 마지막 주사 후 자궁 전위 다음 케타민과 Dexmedetomidine의 솔루션을 진정 후 동물을 안락사.
5. 형태 학적 평가를 위해 H & E와 종양과 얼룩 부분을 분리합니다.
6. 동물 규모에 약물 분포를 평가, 형광 이미징 시스템을 사용한다. 24 및 48 시간에 알렉사 플 루어 680 레이블 나노 약물 및 이미지를 주입한다.
7. 동물을 안락사와 불소를 검출격리 및 관류 종양 및 장기에 escence.

결과

HER2 수용체 발현을 침묵과 HER2-신호 ^(12)를 차단하여 인간의 HER2-양성 유방암 억제

전략

인간 유방암의 다른 형태 중에서, HER2-양성 종양은 최악의 임상 결과가있다. 우리는 누드 마우스 모델에서 인간 HER2 과발현 유방암의 성공적인 처리를 제시한다. 전략은 수용체의 HER2-mRNA에 따라 합성 (그림 1)를 차단하는 허셉틴과 HER2 특정 AON을 사용 HER2 신호 전달 경로의 즉각적인 침묵 모두에서 활성 나노 약물을 포함한다. 허셉틴 및 안티 HER2 AON을 포함하는 리드 나노 복합체 함께 허셉틴 또는 AON 하나 찾아 볼 수없는 두 개의 컨트롤 그림 3에서 볼 수 있습니다. 리드 화합물은 죽 transcytosis에 의해 활성 혈관 외 유출을 달성하기 위해 안티 MsTfRmAb 포함우 종양 혈관의 TFR 내피에 바인딩을 연결합니다. 종양에 훨씬 덜 섭취는 항체의 부재에서 언급 된 종양 따라 EPR 효과 ^(13)에 기인했다. 알렉사 플 루어 (680)를 포함하는 나노 복합체의 형광 버전은 이미징 연구를위한 합성 하였다.

. HER2-양성 유방암 세포에 AON 배송 및 종양 성장 억제의 그림 1 기계 왼쪽 상단 :. 나노 복합체 그림 3에서 적응. 왼쪽 아래 : 표면에 TFR을 표현하는 마우스 종양 혈관. 나노 약물은 수용체에 결합하고 transcytosis에 의해 종양을 들어갑니다. 또한, 종양에 대한 접근이 어​​느 정도는 종양에 따라 강화 된 흡수 및 retenti 참여 무질서 내피 층을 통해 가능(EPR) ^13. 다음에, nanodrug는 인간 암세포에 발현 HER2에 결합 및 초기 엔도 솜으로 내부화. 바인딩 또한 블록 HER2는 신호 통로. 엔도 좀의 성숙과 자신의 산성화 한 후, 나노 약물의 엔도 좀 탈출 메커니즘이 활성화됩니다. Nanodrug 세포질을 입력하는 것은 이황화 스페이서의 환원 분해하여 나노 플랫폼을 발표하고 HER2 합성을 차단하는 HER2-mRNA에 바인딩됩니다. 합성의 블로킹은 HER2-신호의 차단을 연장하고, 종양 성장 억제를 유도한다.

polymalic 산 플랫폼의 미생물 생산

나노 복합 플랫폼, polymalic 산 (PMLA)는, 배양 Physarum의 polycephalum의 microplasmodia 및 프로토콜에 설명과 그림 2에 도시 된 바와 같이 국물에서 정제에 의해 제작되었다. 생산 및 정제 부드럽고 재현했다. 그것은 CONT에 중요 ROL 시간, pH와 중합체의 자발적인 분열을 방지하기 위해 온도. 조심 세척 및 DEAE 컬럼의 용출 DNA, 탄수화물, 독소와 컬러 물질을 제거하기 위해 권장합니다. 극단적 순도 무수 아세톤에 용해시키고 불용성 물질을 제거한 후에 수득 하였다. 생산 PMLA의 총계는 캠페인 당 5 ± 1 g이었다. 1.5 ± 0.5 g의 금액이 높은 10 L 생물 반응기를 사용하는 경우 80,000-100,000는 재현성을 달성했다 _승 M의 PMPLA을 정제. SEC-HPLC 용출 프로파일은 대칭되었습니다. 개수 분포에 따른 동적 광산란 분석은 13 ± 1 nm의 수력 학적 직경에 대응하는 단일 피크 및 PDI의 다분 산성 지수 = 0.10 ± 0.02, 가정 구형 입자에 대한 장비 소프트웨어에 의해 계산을 나타냈다. 제타 전위였다 -22 ± 2 MV (산도 7.5).

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그림 2. 생산 및 (리 등. ^{9 일부터} 적용) Physarum의 polycephalum의 배양 마이크로 변형체에서 polymalic 산의 정제. Polymalic 산 (PMLA)은 생물 반응기에 Physarum의 polycephalum의 변형체에서 생산 및 음이온 교환 (DEAE)에 바인딩하여 배양액에서 수집됩니다. 리제는 칼슘 염으로 에탄올 침전된다. 칼슘 염의 솔루션은 세파 덱스-G25을 통해 MW-분획이다. PMLA 포함하는 분획을 앰버 IR-120H의 ^+를 통해 산에 칼슘 소금 변환됩니다. 무료 PMLA은 마지막으로 드라이 화이트 분말을 얻을 동결 건조된다.

리드 나노 복합체의 화학 합성

P /을 mPEG ₅₀₀₀ (5 %) / LOEt (40 %) / AON (2.5 %) / 허셉틴 (0.2 %) / NTI-MsTfRmAb (0.2 %)

리드 나노 약물의 두 전구체 나노 복합체의 개략적 인 구조도 이용 URE 3에 나타낸다. 전구체는 AON 또는 _HER2 항체 허셉틴 하나 부족하도록 설계되었습니다 동안 리드는 모든 성분이 들어 있습니다. AON 및 모노클로 날 항체 이외에, 화합물은 혈장 단백질에 대한 결합을 최소화하기 위해, 폴리에틸렌 글리콜, mpeg _5000을 포함, 효소 적 절단에 의해 reticulo-내피 계 (RES) 및 분해를 통해 통관. 안티센스 서열 5'-CAT-GGT-GCT-CAC-TGC-GGC-TCC-GGC-3 '개의 Her2 mRNA를 보완했다 조심스럽게 HER2를 차단으로 높은 특이성을 얻기 위해 여러 HER2 발현 세포주에 대한 시험 관내에서 테스트되었습니다 합성 및 오프 대상 효과를 보여주고 있지.

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그림 3. 나노 인간 HER2-양성 유방암을 치료하는 접합체. 선도하는 나노 약물 (상단 구조는) 두 약물 (허셉틴, AON _HER2)가 포함되어 있습니다. 버전 2와 3은 약물의 하나가 포함되어 있습니다. 인간 HER2 과발현 종양 세포에 1 및 2의 흡수는 허셉틴의 결합에 의해 관리된다. 허셉틴을 포함하지 않는 나노 복합체 3, 인간의 세포에 의해 엔도 좀 이해를위한 안티 HuTfRmAb을 받았다. 알렉사 플 루어 680와 결합 이미징 목적을 위해 선택했다. 빨간색 막대는 나노 복합 플랫폼 PMLA / LOEt (40 %)을 나타냅니다. %는 지정된 리간드 (nanodrug = 100 % 사과산 잔기의 총량)의 결합에서 소비 사과산 잔기의 비율을 나타냅니다.

그림 4. 나노 화학 합성접합체 P / LOEt / AON _HER2 / anti-MsTfR/Herceptin 위에서 아래로 :. 펜던트 카르 복실 레이트 (화학 활성화)의 PMLA-N-하이드 록시 숙신 에스테르 (PMLA-NHS)의 합성. 2 - 머 캅토 -1 - aminoethan (2-MEA)와 아미드 형성에 의해 NHS 교체, PEG ₅₀₀₀ 메틸 - 아민 (MPEG _{5000-NH 2),} trileucine (LLL) 또는 류신 에틸 에스테르 (LOEt). 이 "preconjugate는"절단 가능한 이황화 결합의 형성에 의해 티오 형성과 AON으로 단클론 항체 - 말 - PEG-말을 첨부합니다. 남은 2-MEA는 아미도 - 디티 - 프로피온산을 형성 캡핑된다. 하나의 단클론 항체 만 첨부 파일이 표시됩니다. 여러 첨부 파일은 단클론 항체의 혼합물을 사용하여 관리됩니다. 백분율 %는 다양한 리간드 (무료 PMLA 100 %)에 바인딩 카르 복실 레이트의 분수를 나타냅니다.

무화과 우레 4에 요약 된 나노 복합체를 합성 하였다. 리드의 계산 분자량어원은 719,000이었다. 합성의 전체 수율은 사과산 내용에 관해서는 45 ± 5 %였다. 100 kDa의 PMLA 플랫폼의 862 malyl 단위 (= 100 %), 평균적으로 40 % LOEt, 5 % MPEG, 2 % AON 2 %, 0.2 % 허셉틴 0.2 % 방지 MsTfR 단클론 항체를 실시했다. 각 항체의 양이 PMLA 플랫폼의 분자 당 1.7 분자의 평균에 맞습니다. %는 설계 및 그룹 분석에 의해 확인 % ± 5 % 이내에서 동일 하였다. 예 설계된 내용과의 비교를 도시 말산, AON, 단클론 항체 및 MPEG ₅₀₀₀ 및 표 2의 실험 콘텐츠의 계산을 위해, 표 1에 주어진 경우이다. 부 (3) 아래의 기준에 따라 고순도의 높은 반응 수율 및 크기 배제에 의한 효율적인 분리 (예를 들어 단클론 자유롭고 단클론-nanoconjugate가 급 - HPLC에 1 분에 의해 분리된다), 및 용매에 선택적 용해도에 기초하여 달성되었다. 모노클로 날 항체의 활성이었다 나노 약물 합성 전반에 걸쳐 유지되는 것으로 도시하고, 이는 항체의 2 종류가 동일한 중합체 플랫폼에 조립 된 것이 확인되었다. 비정형 ELISA 실험의 결과는도 5의 URE에 도시된다. 일반적으로, 말산, AON, 단백질, PEG 정량적 기 분석 및 ELISA에 대한 분석은보고 된 합성의 경우뿐만 아니라, 다른 사람 및 계측 실시한 경우 재현 가능한 결과를 수득 강력한되었습니다, 또한 분석을 위해 사용될 때 다른 합성 nanoconjugates의.

사과산 내용을 참조 nanodrug 조성 표 1. 계산.

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디자인 구성과 실험 나노 약물 성분 표 2. 비교.

그림 5. ELISA 화학 합성 한 후, 다른 항체의 여러 결합을 보여주는 항체의 친 화성 측정. 나노 약물은 항체 단클론 항체 각각 항원 A와 B에 대하여 (A) 및 항체 단클론 항체 (B)가 포함되어 있습니다. ELISA 플레이트는 항원 (A)로 코팅되어있다. 자유로운 단클론 항체 (A), 자유로운 단클론 항체 (B), 및 나노 약물은 ELISA 플레이트에 적용된다. 만 단클론 항체 (A)는 항원 (A)에 결합되는 동안 세척 한 후, 항체, 단클론 항체 (A) 또는 단클론 항체 (B) 하나의 특정 보조 과산화 효소 결합 항체로 시험한다. 그것은 무료 및 나노 약물 단클론 항체 (A)가 결합하고, 간접적으로 같은 나노 약물 분자의 단클론 항체 (B) 복합하지만, 무료 단클론 항체 (B)없는 것을 알 수있다, 접시에 유지됩니다. 농도 의존성은 화학 결합 항체 결합 활성에 영향을 미치지 않았 음을 나타냅니다, 무료 및 접합 단클론 항체 (A)에 대한 비교 결합 친화력을 보여줍니다. 또한, 동일한 물리적 엔티티 (나노 플랫폼) 단클론 항체 (B)의 검출 결과에 대한 단클론 항체 (A)와 단클론 항체 (B)의 코 게이션. 여기에 표시된 실험 결과는 반대로 인간의 TfRmAb (A) 및 항 - 마우스 TfRmAb (B)를 참조하십시오. 비슷한 결과는 반대로 MsTfR 단클론 항체 및 항-HER2 단클론 항체 (허셉틴)와 같은 테스트 다른 항체 커플을 위해 표시되었습니다.

물리 화학적 연구는 유체 역학적 직경을 표시 22.1 ± P /을 mPEG (5 %) / LOEt (40 %) / AON (2 %) / 허셉틴 (0.2 %) / 안티 MsTfRmAb (0.2 %) (납, 두 2.3 nm의 약물 버전), 20.1 ± P /을 mPEG (5 %) / LOEt (40 %) / AON (2 %) / 안티 MsTfRmAb (0.2 %) / 안티 HuTfRmAb (0.2 %) (AON 약물 버전) 2.4 nm의 , 및 15.1 ± P /을 mPEG (5 %) / LOEt (40 %) / 허셉틴 (0.2 %) (허셉틴 약물 버전) 1.2 nm의. pH가 7에서 제타 전위0.5이 순서 -5.2 ± 0.4 MV, -5.7 ± 0.6 mV 범위와 -4.1 ± 0.4 MV에 있었다. 그것은 나노 복합체의 측정 된 유체 역학적 직경이 무료 구성 요소에 대한 측정 된 직경의 가산을 수행하지 않았 음을 언급해야한다.

종양 세포 막을 통해 나노 약물의 배송 및 0 HR 및 3H R 후 세포질로 방출

엔도 좀 흡수에 의한 세포막을 통한 나노 약물의 전달은도의 URE 6에 도시되어 0 시간 및 3 시간 후. 형광 라벨 (녹색 알렉사 플 루어 680) 나노 약물 플랫폼 및 (빨간색 리사 민) AON에 부착된다. 이들의 중첩은 D & L과 함께 패널 G & O.에 표시된 엔도 좀 (파랑)의 형광으로 패널에 표시됩니다 피어슨 상관 계수 (R (R)는 플랫폼 / 엔도 좀의 공동 현지화, AON / 엔도 좀, 0 시간, 3 시간 동안 플랫폼 / AON. T에 대한 이미지에서 계산 하였다그는 3 시간 이미지는 세포질에있는 글루타티온 의존 이황화 분열에 의한 나노 약물에서 AON의 세포질과 분리에 엔도 좀의 방출을 지적했다.

그림 6. (딩 등. ^11에서 적응) 표적 세포에 의한 나노 복합체의 이해를위한 공 초점 현미경. 세포는 이중 폴리머 플랫폼에서 리사 민 AON에 연결 (빨간색)와 알렉사 플 루어 680 (녹색)으로 표시했다 나노 약물로 37 ° C에서 30 분 동안 배양 하였다. 또한, 엔도 좀은 FM1-43 (블루)로 염색 하였다. 현지화 0 시간 (A), 3 시간 (B) 배양 한 후 표시됩니다. 패널 A, AB, & B, 혼자 나노 복합체의 형광에 의한 IJ 쇼 염색하고,A, CD & B, KL에서의 공동 지방화. 또한, 엔도 좀의 염색은 패널 A, E & B, M 및 나노 복합체 및 endosomesin 패널의 colocalization을에 표시됩니다 FG & B, NO. 각 패널의 패널 A, H & B, P 쇼의 위상 콘트라스트. (C) 피어슨의 상관 관계는 플랫폼 엔도 좀, AON-엔도 좀, 0 시간, 3 시간 동안 계산 된 플랫폼 AON의 colocalization을위한 R (r)을 계수. 를 클릭하세요 여기이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.

시험 관내 및 생체 내에서 인간 유방암 억제

COM에서 HER2 과발현 세포주 BT-474의 체외 성장 억제낮은 발현 세포주 MDA-MB-231과 함께 파리 손 그림의 우레 7에 표시됩니다. 억제의 정도는 리드 나노 복합체 P /을 mPEG / LOEt / AON _HER2 / 허셉틴 / 안티 MsTfRmAb으로 각각 50 %와 30 %이다. 다른 화합물에 의한 억제는 MDA-MB-231 세포에 대한보다 BT-474 덜하지만 더 높다. BT-474 세포주 이종 유방암 마우스의 치료를 위해 선택되었다.

도 7. HER2가 BT-474 유방암 세포를 과발현 및 저 HER2가 BT-474 유방암 세포주를 과발현에 대한 성장 억제. 비교 (이노우에 외. ^12에서 적응) MDA-MB-231 세포 (발현의 시험 관내 성장 억제 왼쪽) 및 HER2의 낮은 발현 유방암 세포주 MDA-MB-231 (오른쪽). TFR (들)은 안티 MsTfRm을 의미AB와 TFR (후진타오 / MS)는 안티 - HuTfRmAb & 안티 MsTfRmAb이다. 리드 나노 약물, P /을 mPEG / LOEt / AON _HER2 / 허셉틴 / TFR (MS)와 허셉틴 또는 AON _HER2 하나 찾아 볼 수없는 나노 약물 PBS, 허셉틴과 AON _HER2와 비교된다. 허셉틴의 부재에서, 항-MsTfRmAb는 종양 세포에 의해 엔도 좀 이해를 제공하기 위해 결합시켰다. 농도는 항체, AON _HER2, 4 μM의 endoporter (AON의 응용 프로그램)에 관한 4 μM과 관련하여 40 ㎍ / ㎖를했다. 의미는 *로 표시, P <0.05, ** P <0.02 : ***, P <0.003 PBS와 비교.

그림 8에있는 생체 치료의 결과는 인간의 유방암을 과발현 BT-474 개의 Her2 베어링 마우스에 표시됩니다. 성장은 PBS (그림 우레 8)로 치료 컨트롤에 비해 허셉틴과 HER2 특정 AON를 포함하는 리드 nanodrug으로> 95 % 억제되었다. 금지혼자 허셉틴, P /을 mPEG / LOEt / 허셉틴 또는 P /을 mPEG / LOEt / AON / 안티 MsTfRmAb / 안티 HuTfRmAb 60 % 이하였다. 종양 추출물의 웨스턴 블롯 분석은 HER2 합성 및 Akt의 인산화 모두의 억제를 보였으 나, 전체의 Akt의 변화와 가사 효소가없는 GAPDH. PARP는 아폽토시스의 증가 된 수준에 대응하여 절단 하였다. 치료, 종양의 회귀를 설명 H & E 염색 조직 섹션 후 종양의 사진은 그림의 우레 9에 나타낸다.

(이노우에 등. ^12에서 적응) 납 및 전구체 나노 약물로 치료하는 동안 그림 8. 종양의 크기와 단백질. 다양한 치료 (42 일, 완전히 8 주사에 대한 21 일)에 대한. 종양의 크기. 바 표준을 나타냅니다평균 편차. 안티 개의 Her2 AON과 허셉틴가 결합 리드 혼자 허셉틴 또는 단일 약물 함유 나노 복합체. B도 우수했다. HER2, 인산화 된 Akt, 전체의 Akt, PARB의 표현에 대한 다양한 치료의 효과, 절단 PARB 및 GAPDH는 서쪽 블로 팅으로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

누드 마우스에 HER2 양성 BT-474 인간의 유방암의 그림 9. 치료 (Ionue 등. ^12에서 적응) 조직 섹션에서. 종양의 회귀 및 괴사 / 세포 사멸. 어퍼 : 종양 (빨간색 화살표)의 수축. 종양의 성장 (파란색 화살표)를 지원하는 에스트로겐 펠릿의 표시. 로우R : 종양 섹션 Hematoxilin 및 에오신 (H & E) 염색. 증식 성 종양은 종양 세포의 조밀 한 포장에 의해 도시된다. 괴사 조직이 종양 세포가 제거 된 곳을 볼 수있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

생분해 성 천연 고분자에서 나노 약물의 제조를위한 실험적 경로는 맞춤 의학의 합성에 사용될 수있는 제시된다. 설명은 나노 약물 합성을위한 다양한 플랫폼 polymalic 산의 제어 생산 및 정제로 시작합니다. 재현 가능한 기술을 이용하여, 중합체는 고 분자량 및 의약품 합성에 적합한 극단적 순도가 얻어진다. 합성은 효율적 HER2-양성 유방암을 치료하는 도시되어 나노 약물에 대해 설명한다. 설명은 암의 치료를위한 다른 대부분의 나노 의약품의 합성으로 번역 될 수있다. 타겟팅은 HER2 단백질 또는 효율적으로 내면화하는 다른 종양 표지자로 종양 특이 항원에 결합 등 허셉틴과 같은 항체를 포함한다. 나노 약물을 효율적으로 레에서 암의 성장을 억제합니다 안티센스 올리고 뉴클레오티드 및 화학 요법의 선택을 제공합니다atment. 이 예에서, 허셉틴은 HER2와 함께 특정 안티센스 올리고 뉴클레오티드 어닐링에 결합 HER2 코딩의 mRNA는 HER2-신호 및 HER2-양성 유방암의 심각한 감소의 지속적인 차단의 결과. 종양 타겟팅 및 안티센스 올리고 뉴클레오티드에 의한 유전자 발현 억제의 기본 원칙을 바탕으로 우리는 최신의 여러 가지 다른 나노 약물과 성공적으로 억제 전임상 인간 아교 모세포종과 트리플 부정적인 유방암 ^11,14-18을 합성했다.

합성 작업은 Physarum의 polycephalum ( "점액 금형"가족의 종)의 배양액에서 polymalic 산 고도로 정제 된 나노 약물 플랫폼의 준비를 시작한다. 제제는 수많은 항체, 펩티드, 올리고 뉴클레오티드 및 활성 약물 전달 및 종양 성장 억제에서 기능하는 다른 분자의 부착을 허용하는 원리에서, 중합체의 고 분자량을 강조한다. Followi제어 배양 및 정제를 겨, 예측 가능한 수익률 폴리머의 재현 품질이 생산되고 있습니다. 폴리머는 언제든지 편리한 조건에서 저장된다.

중합체 - 펜던트 카복실 레이트의 화학적 활성화로 시작 PMLA 나노 복합체의 합성은 몇 합성 단계에서 수행된다. 단계 사이에서, 합성 중간체는 선택적으로 임의의 양의 제제를 허용 보류 될 수 있고, 따라서 스케일링을하여 사용할 수있다. 합성의 진행은 TLC 및 HPLC 급 -​​ 뒤에되고, 나노 약물 조성물 및 활성 모두는 그룹 특정 화학 정량 분석​​법, ELISA, 물리적 다양한 측정에 의해 제어된다. 우리의 경험은 이러한 합성이 우수한 수율 및 순도 원활하고 재현성있게 진행되고 있다는 점이다. PE에 필요한 항체 및 안티센스 올리고 뉴클레오티드의 특이성을 선택하여 나노 약물의 변형은 유리하게 합성약을 rsonalized.

인간 HER2-양성 유방암의 성공적인 치료의 양상은 마우스 암 모델의 제조, 나노 약물, 이미징 및 종양 성장 분석에의 응용에 유효 대표이다. 시험 관내 생존 시험의 결과는 세포주 및 동물 실험에 사용되는 주요 약물을 선택하는 데 유용하다. 생체 Xenogen 이미징 나노 약물이 실제로 종양에 전달되는 것을 검증한다. 웨스턴 블랏의 결과는 특정 단백질의 수준은 암 치료 동안 예측 된 방식으로 반응 여부를 보여준다. 종양의 크기를 측정, 즉 억제 후퇴 또는 회귀에 대한 치료의 성공에 대해 알려준다. 한 예는 예측, 재현성 및 주목할만한 독성이없는 높은 정도를 나타내는 다른 polymalic 산 기반의 나노 약물과 우리의 경험을 반영한다. 독성과 여러 t의 효능에 대한 최근 결과트리플 부정적인 유방암 치료를위한 argeted polymalic 산 복합체는이 개념 ^18의 강력한 지원에 있습니다. 종양의 중간에 넘쳐에 의한 내피 장벽, 엔도 좀의 흡수에 의한 종양 세포의 막과 류신 에틸 에스테르 또는 trileucine 그룹의 작용에 의해 엔도 좀 막 중단 : 주요 기능은 우리의 나노 약물 바이오 장벽을 통과 할 수 있다는 것입니다. 혈관 외 유출 및 엔도 좀 흡수를 확실 나노 약물에 부착 된 특정 항체에 의해 달성된다. 반대로 마우스 트랜스페린 수용체 항체는 수용체가 가장 종양 혈관에 과발현 아마 때문에, transcytosis에 의해 종양에 효과적인 유입을 중재한다. 다른 항체는 구체적받는 종양 세포에 나노 약물을 연출 같은 나노 복합체 분자의 기능에 부속. 두 항체의 존재는, transcytosis의 하나 엔도 좀의 이해에 대한 다른 하나는, 최적의 작동을 위해 필수적입니다. m의 정량 분석ALIC 산 항체가 높은 나노 약물의 최적의 구성을 제어하기 위해 권장합니다. 마지막으로이 모든 기능을 하나의 공유 결합 나노 약물이받는 사람의 종양 세포에 호스트 혈관을 통해가는 길 화학적으로 연결된 형태로 약을 제공하는 것을 주목해야한다. 그들이 대상 사이트의 나노 복합 플랫폼에서의 분열로 무료 약물로 재구성 될 때까지 화학 첨부 (전구 약물) 대부분의 약물이 비활성 상태로 렌더링합니다. 재 활성화 양상이 전달 및 부작용을 불러 일으킬 수있는 최소한의 기회 동안 고도의 안전을 제공하기 때문에 중요합니다. 다 기능성, 효능과 안전성이 좋은 맞춤 의학의 필수 속성입니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercapto-1-ethylamine (Cysteamine; 2MEA)	Sigma-Aldrich	30078-25G
4’,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Vector Laboratories, Burlingame, CA
90-Day release 17β-estradiol pellet	Innovative Research of America
Alexa Fluor 680 C2 maleimide	Invitrogen	A20344
Amberlite IR 120H	Sigma-Aldrich	6428
Antifoam Y-30 Emulsion	Sigam-Aldrich	A5758
Anti-laminin-411 chain mAbs	Santa Cruz	SC-59980
Anti-pAkt mAb	Cell Signalling	9271S
Anti-PARB mAb	BD Biosciences	556494
Anti-von Willebrand Factor antibody	Abcam	AB6994
Bacto Yeast Extract	Bacto, Dickinson/Sparks, MD	212720
Beta-actin	Cell Signalling	3700
BT-474	ATCC	HTB-20
Calcium Carbonate	Alfa Aesar	36337
Cell Proliferation Assay kit	Promega, Madison, WI, USA	PR-G3580
Centriplus 100	Millipore	4414
Dicyclohexylcarbodimide	Fluka	36650
DMEM	Sigma-Aldrich	D5796
Eosin	Cardinal Health	S7439-4
Galardin (MMP-inhibitors)	Santa Cruz	SC-994
GAPDH	Cell Signalling	2118
Hematoxilin	Cardinal Health	S7439-3
Hemin from porcine	Sigma-Aldrich	51280
Herceptin	Genentech	15534
Herceptin (Western blotting)	Cell Signalling	2165S
IgG2a-kappa murine malignoma	Sigma	M77695X5m
Immun-Star AP Substrate Pack	Biorad	170-5012
Immun-StarTM AP Substrate Pack	Biorad	170-5012
LAL Reagent water	Lonza, MD	W50-1000
Laminin-411 mAbs	Abcam
Leucine ethyl ester (LOEt)	Sigma-Aldrich	61850-10G-F
Limulus Amebocyte Lysate (LAL) PYROGENT-5000 tests	Cambrex BioScience	N384
Lissamin-Morpholino AON	Gene Tools	Custom made
L-malic acid	Sigma-Aldrich	M6413
Malate dehydrogenase	Sigma-Aldrich	M2634
Mal-PEG-Mal	Laysan	mal-PEG-mal-3400
Matrigel	BD Biosciences	354248
Milk, nonfat powdered	Proteomics	M203-10G
Morpholino oligonucleotides	GeneTools	custom made
mPEG5000	Lysan	mPEG-NH2-5000
N-hydroxysuccinimde (NHS)	ACROS Organics	15727100
Ninhydrin	Merck	1.06762.0100
Nitrocellulose Membrane Filter Paper Sandwich	Invitrogen	LC2001
Nitrocellulose Membrane Filter Paper Sandwich, 0.45 µm	Invitrogen	LC2001
Novex ® Tris-Glycine Transfer Buffer (25x)	Invitrogen	LC3675
Nude Mice [Tac:Cr:(MCr)-Foxnnm]	Taconic
PBS pH 7.2 10x	Gibco	10010-49
PBS pH 7.2 1x	Gibco	70013
PD-10 desalting columns	GE Healthcare	17-0851
Physarum polycephalum M3CVII	ATCC	204388
Pierce BCA protein assay	Thermo Scientific	23225
Protease inhibitor cocktail	Roche	1.18362E+11
Protein Detector ELISA Kit	KPL	54-62-18
Sephadex G-25 superfine	GE Healthcare	17-0031
Sephadex G-75	GE Healthcare	17-0050
Sephadex-LH20	GE Healthcare	17-0090
SKBR-3	ATCC	HTB-30
SPDP	Proteochem	C1116
Streamline-DEAE	GE Healthcare	17-0994
Styryl Red FM 1-43	Life Technologies	T-3163
TBS 10x	Bio-Rad	170-6435
TCEP	Sigma-Aldrich	C4706-2G
TLC, silica coated aluminia sheets	Merck, Darmstadt, DE	60F254
Trileucine (LLL)	Bachem	H-3915
Triton X-114	Sigma-Aldrich	X114
Tween®20	Sigma-Aldrich	P1379
Vivaspin 20	VWR	14005-302
DAPI	Vector Laboratories, Burlingame, CA
Dexmedetomidine	Pfizer
Atipamezole	Pfizer
Carprofen	Pfizer
Betadine	Foster and Smith, Wisconsin