검출 시각화 및 아메바 모델 시스템에서 활성 산소 종의 생성을 정량

요약

우리는 정량적 연구를위한 각종 아메바 및 포유류의 세포 모델에 적용 할 수있는 활성 산소 종 (ROS)의 측정을위한 일련의 프로토콜을 채택.

초록

활성 산소 종 (ROS)는 동적으로 상호 전환 또는 하나 촉매 또는 자발적으로 제거하는 반응과 짧은 수명, 산소 함유 분자의 범위를 포함한다. 때문에 대부분의 ROS와 그 소스와 세포 내 현지화의 다양성의 짧은 제품 수명에 완전한 그림은 프로토콜의 조합을 사용하여주의 측정에 의해 얻어 질 수있다. 여기에서, 우리는 OxyBurst 그린 (OBG)를 사용하여 세 가지 다른 프로토콜의 집합 코팅 구슬, 또는 dihydroethidium (DHE)를 제시하고 Amplex UltraRed (AUR)는 질적 및 양적 같은 Dictyostelium의 등 전문 식세포의 다양한 ROS를 모니터링 할 수 있습니다. 우리는 동적으로 단일 세포 수준에서 intraphagosomal ROS의 생성을 시각화하는 비즈 코팅 절차 및 사용 OBG 코팅 구슬과 라이브 현미경을 최적화. 우리는 E.에서 지질 다당류 (LPS)를 확인 Dictyostelium의에서 ROS의 생성을위한 자극제로 대장균. 또한, 우리는 거라고eveloped 실시간 정량적으로 각각 세포 내 과산화물 및 세포 H ₂ O _2의 생산을 측정하기 위해 DHE와 AUR를 사용하여 중간 처리량 분석.

서문

활성 산소 종 (ROS)는 같은 호스트 방어, 신호, 조직 개발 및 부상에 대한 응답뿐만 아니라 고혈압과 암과 같은 생물 학적 과정의 다양한 참여하고 있습니다. 잘 공부 phagosomal의 NADPH 산화 효소 기계는 호중구 'phagosomes를 ¹ 섭취 박테리아를 죽이고, 산화 버스트로 알려진 신속한 ROS 생성에 최선을 다하고 있습니다. 또한, 미토콘드리아 호흡 사슬의 부산물로서 전자의 누출은 이전에는 ROS의 규제 소스에 대한 책임을 져야하는 것으로 생각되었다. 그러나 최근에는 마우스 대 식세포 ² 박테리아의 intraphagosomal 살인에 기여하는 중요한 메커니즘으로 확인되었다. 최근 몇 년 동안, 사회 아메바, Dictyostelium의는 타고난 면역 반응의 세포 고유의 메커니즘을 연구 할 수있는 강력하고 인기있는 모델이되고 있습니다. 실제로, Dictyostelium의 인간 식세포는 molecula 보전의 놀라 울 정도로 높은 수준을 공유박테리아, 말림을 감지하고 ^{3,4 살인에} 대한 책임을 R의 기계. 단백질과 같은 NADPH 산화 효소, 카탈라제, 슈퍼 옥사이드 dismutases으로 ROS의 생산 해독 관련 효소의 동족체는, 인간과 Dictyostelium의 모두에서 찾을 수 있습니다. 최고의 공부 아메바으로, Dictyostelium의 포유 동물 모델 시스템에 대한 몇 가지 독특한 장점을 제공한다. 그들은 8-10 시간의 배가 시간으로, CO _2에 대한 필요없이 상온에서 성장한다. 그들은 쉽게 부착 또는 현탁액 문화로 유지 될 수있다. 또한, 자신의 완전한 염기 서열과 주석 반수체 게놈, 쉬운 유전자 조작 덕분에, Dictyostelium의 매우 매력적인 실험 모델 생물이되고있다.

이전의 연구에서, ROS에 의한 산화 후 형광을 방출 (이하 OxyBurst 녹색, OBG라고도 함) 형광의 다양한 염소와 불소 유도체, ROS의 기자로 사용되어왔다. 세포 투과 동부 표준시휴대 impermeant 덱스 트란 또는 단백질 결합 유도체는 ROS 세포를 측정하기 위해 사용되는 반면 erified 유도체, 세포질 ROS를 측정하는 데 사용된다. 특히, OBG BSA 코팅 된 비드 이미 포유류 세포 ^소재 phagosomal ROS의 생성을 검출하기 위해 사용되어왔다. 그러나, 마이크로 플레이트 리더 기반 접근법은 단지 세포 집단에서 평균화 ROS 생성 커브를 줄 수있다. 본 프로토콜로, Dictyostelium의 전문 식세포, 최적화 실험 조건을 사용하여, 우리는 구슬에 어떤 opsonin 공역없이 안정적이고 효율적으로 식균 작용을 구하십시오. DHE는 ROS 생산 ^6-9를 검출하는 그러한 포유류 호중구 및 대 식세포 등 다양한 모델 시스템에 사용되어왔다. 한편, 방법 ^8,10의 민감도와 특이도를 통해 몇 가지 논쟁이있다. Amplex 레드, AUR을 측정하는 것이 더 적합하다 산도에 덜 민감의 형광 강도의 개선 된 버전으로nonneutral 또는 약산성 milieus에서 ROS. AUR은 최근 여러 포유류의 시스템 ^{(11, 12)에} 적용되어 있지만, 꽤 자주 약산성 성장 미디어를 필요로 nonmammalian 모델에서의 사용은 아직보고되지 않았습니다. 또한, 정량적 동적 사회적 아메바 Dictyostelium의에서 ROS 생산 및 국산화를 측정 할 수있는 게시 된 프로토콜이 없습니다.

프로토콜 제시된 세트의 목표는 다양한 ROS 및 현지화를 모니터링하기 쉽고 다양한 솔루션을 제공하고, 또한 ROS 관련 세포 메커니즘에 대한 통찰력을 제공한다. OBG 분석을 위해, 우리는 Dictyostelium의 세포로 OBG 코팅 구슬의 흡수 후 phagosomal의 ROS 생성의 전 과정을 모니터링하는 라이브 현미경을 사용하고, 박테리아의 intraphagosomal 살인의 메커니즘을 연구하기 위해 새로운 접근 방식을 제공했다. 우리는 세포 내 superox을 측정하기 위해, Dictyostelium의 매체 처리량 DHE와 AUR 분석를 최적화강력한 ROS 자극으로 LPS를 사용하여 각각 IDE 및 세포 H ₂ O ₂ 생산. LPS 최근 포식 균 ^(13)를 향해 Dictyostelium의의 살균 활성을 증가 표시했다합니다. 또한, DEDTC 및 catalase의 치료는 명시 적으로 두 가지 방법이 구체적으로 다양한 종류와 Dictyostelium의에서 ROS의 세포 내 현지화를 측정하는 것을 확인했다. 마지막으로, OBG 분석은 상기 동물 세포의 식세포 수용체에 대한 리간드와 함께 비즈 opsonizing 의해, 어떤 접착 식세포 세포에 적용 할 수있다. 원칙적으로, DHE와 AUR 분석은 미세 조정 적절한 실험 조건에서 어떤 부착 또는 비 접착 세포에서 측정 할 수있다.

프로토콜

1. 시각화 및 phagosomes를있는 ROS 생산의 질적 측정

OBG - 코팅 된 비드를 미리 준비한다. 비즈 코팅 절차 및 한천 오버레이 기술은 출판 참조 ^5,14에서 적응됩니다.

1. 1.5 ML 튜브에 3.0 μm의 카르 실리카 비드 (약 1.8 × 10 ⁹ 구슬) 1 ㎖ 현탁액을 추가, 비즈 빠른 스핀과 소용돌이로 교반하여 1 ㎖의 PBS로 3 배 씻는다.
2. 25 ㎎ / ㎖ 시안 아미드를 (공유 BSA를 prelabeled 바인딩 카르 실리카 비드를 활성화하는 방법)를 포함하는 PBS 1 ㎖에 구슬을 재현 탁, 15 분 동안 바퀴에 품어.
3. 커플 링 버퍼의 1 ㎖로 세척 배 빠른 스핀으로 (0.1 M 붕산 나트륨, 산도 8.0) (또는 5 초 동안 테이블 탑 미니 원심 분리기의 최대 속도로 원심 분리기 또는 테이블 톱 원심 분리기에서 1 분 2,000 XG에 원심 분리기)와 과량의 시안 아미드를 제거하는 텍싱.
4. C 500 μL로 세척 구슬을 혼합OxyBurst 그린 (OBG) H2HFF (디 하이드로-2 ', 4,5,6,7,7'- hexafluorofluorescein)-BSA의 1 ㎎을 함유하는 버퍼를 oupling 표준 상한까지 고로 가스 수에서 질소 가스 튜브를 채우고, 어둠 속에서 실온에서 14 시간 (야간)의 바퀴에 품어.
5. 구슬이 (PBS에서 글리신 250 ㎜)의 빠른 스핀과 소용돌이로 교반하여 담금질 버퍼를 제거하는 커플 링 버퍼로 두 번 반응 OBG를 제거하고 버퍼를 급냉 1 ㎖로 2 배 씻는다.
6. BSA에 활용하는 알렉사 형석 594 숙신 에스테르 50 μg을 함유하는 커플 링 버퍼의 1 ML을 추가합니다. 모자를 씌우기 전에 질소 주입 튜브, 그리고 어둠 속에서 실온에서 1.5 시간 동안 바퀴에 품어.
7. 구슬이 빠른 스핀과 소용돌이로 교반하여 1 ㎖의 PBS로 3 배 세척 한 후, 구슬이 빠른 스핀과 반응을 중지 소용돌이로 교반하여 버퍼를 급냉 1 ㎖로 3 배 씻으십시오.
8. 마지막으로, 장기 저장을위한 V 지드 / w 10 %의 2 μL로 PBS 1 ㎖에 비드를 재현 탁. concentratio을 측정혈구 (보통 1 ~ 2 × 10 ⁹ 구슬 / ㎖)와 서스펜션에있는 구슬의 N은, 모자를 씌우는 전에 질소 튜브를 채우고, 어둠 속에서 4 ° C에 보관하십시오.
9. OBG의 형광의 코팅 효율은 500 nm에서 여기를 이용한 방출 스펙트럼을 확인하여 시험 될 수있다. 양 고추 냉이 퍼 옥시 다제 (HRP)의 존재하에 H ₂ O _2에 의해 산화되면, 발광 피크 (538 NM)에서 산화 비드의 형광 강도는 nonoxidized 코팅 비드에 비해 11 ~ 12 배 높다.
10. 수확은 기하 급수적으로 광학적으로 투명한 플라스틱이나 유리 바닥에 3cm 접시에 세포의 밀도가 다른 접시, 밤새 그들을 성장, 10cm 페트리 접시에서 Dictyostelium의 세포를 성장. 실험에 대해 80 %의 합류 요리를 선택합니다. Dictyostelium의 세포 배양에 대한 자세한 프로토콜 ^15을 발표했습니다.
11. 하세요! loflo 매체 (LF 매체)로 배지를 교체, 알을 품다HL5C 배지의 세포 및 intraendosomal 형광도를 감소시키기 위하여 실험 전 2 시간.
12. 병행 10-15 기다려, 약 1 ㎜ 두께 한천 층을 형성하기 위해 평탄면 (x 10cm 10cm의 즉 유리판)에 한천을 넣어 LF 배지에 10 ml의 1.5 % 박토 한천 녹지 분 응고한다. 나중에 사용하기 위해 LF 매체에 2cm X 2cm 사각형과 장소에 한천 층을 잘라.
13. 한편, 회전하는 디스크 또는 넓은 필드 현미경을 준비하고 22 ° C의 환경 챔버의 온도를 설정하고이 실험에 대한 설정을 조정합니다. (토론에 추가 의견을 참조하십시오.)
14. 배양 2 시간 후, 3cm 접시로부터 LF 매체를 대기음하지만 세포 단일 층은 여전히​​ 매체의 박막에 의해 보호되어야한다. 1.5 × 10 ⁷ 구슬 / ㎖로 코팅 구슬을 희석하고, 세포 층에 10 μl를 추가합니다.
15. 하나 스퀘어 한천 장을 가지고, 과잉 액체를 배출하지만 계속 젖은 상태. 조심스럽게 일을 넣어전지 층의 위에 전자 한천 사각형. 그것은 세포에 누워 때 한천 광장을 이동하지 마십시오. 한천 오버레이함으로써 흡수를 향상 구슬과 세포 사이의 접촉을 증가시키는 데 사용하고, 또한 약간의 대물 초점면에 더 잘 유지, 세포를 압축한다.
16. , 접시에 뚜껑을 배치 현미경 스테이지에 배치하고 자동으로 적색, 녹색 및 위상 채널에서 사진을 찍고 2 시간 이상마다 1 분.
17. 선택 식균 작용의 전 과정을 포함하는 세포 사건에 초점을 맞 춥니 다. 최적화 된 3 채널 병합 및 전문 화상 처리 소프트웨어를 사용하여 동영상으로 사진을 조립한다. 빨간색과 녹색 채널에서 선택한 각 구슬의 형광 강도를 정량화하고, 그린 / 레드의 비율은 세포의 동적 phagosomal ROS 생산을 반영합니다.

2. 세포 내 과산화물 생산의 정량 및 중간 처리량 측정

1. (을)를 수집NE 80 %의 합류 HL5C 배지 10 ㎖에 Dictyostelium의의 요리. 5 신중 분, 완전히 대기음 초과 매체 850 XG에 원심 분리기 Dictyostelium의 세포. SS6.4 버퍼에 재현 탁 세포 [소렌슨 버퍼에 0.12 M 소르비톨 (14.69 밀리미터 KH ₂ PO _4, 6.27 mM의 나 ₂ HPO _4), pH를 6.4], 셀 카운트 및 6 × ¹⁰⁶ 세포 / ml의 최종 농도로 희석 (토론에 추가 의견을 참조).
2. (토론에 추가 의견을 참조) 흰색 불투명 한 96 웰 플레이트의 각 웰에 세포 현탁액의 50 μl를 추가합니다.
3. 필요한 경우 각이 잘 멀티 채널 피펫을 사용하여에 DHE 재고 (DMSO 30 ㎜)로 희석 DHE의 SS6.4, 피펫 50 μl의 500 배 희석. DHE의 최종 농도는 30 μM이다. 반응이 즉시 시작됩니다.
4. 자극 또는 억제 특정 요구에 따라이 시점에서 추가, 또는 다른 시간 지점에서 할 수있다.
5. 엔드 포인트 "최고 읽기 & #을 사용하여(34) 522 nm/605 nm에서 형광 여기 / 방출과 형광 마이크로 플레이트 리더의 모드는, 22 ℃에서 1 시간, 중간 흔들림 5 초 / 분마다 2 분을 읽어

3. 양적 및 세포 외의 높은 처리량 측정 H ₂ O ₂ 생산

1. 2.1 및 2.2과 동일한 단계를 따릅니다.
2. SS6.4, 소용돌이 10 ㎖에 HRP 주식의 5 μL (증류수 100 U / ㎖)를 첨가하여 희석 한 HRP를 준비하거나 잘 혼합하고 나중에 사용하기 위해 얼음에 계속 튜브를 반전. 희석 된 HRP 솔루션은 0.05 U / ㎖에 있습니다.
3. 각각 AUR 재고 (DMSO 10 ㎜ AUR)와 6.25 μM의 최종 농도에 SS6.4 버퍼에 희석 한 HRP 솔루션, 0.005 U / ㎖를 혼합하여 AUR 반응 혼합물을 준비합니다. 예로서, 40 반응에, 반응 혼합물을 제조 희석 HRP의 400 μL와 AUR 스톡 용액 2.5 μL로 SS6.4 1600 μL를 혼합한다.
4. AUR 믹스의 50 μl를 추가합니다필요한 경우 각이 잘 멀티 채널 피펫을 사용하여에 진짜야. 지금 반응이 시작됩니다.
5. 자극 또는 억제 특정 요구에 따라이 시점에서 추가, 또는 다른 시간 지점에서 할 수있다.
6. 530 nm/590 nm에서 형광 여기 / 방출과 형광 마이크로 플레이트 리더의 종점 "최고 읽기"모드를 사용하여, 22 ℃에서 1 시간, 중간 흔들림 5 초 / 분마다 2 분을 읽어

결과

된 phagosomes에 ROS의 생성은 현미경 (파일 S1)에 의해 성적으로 동적으로 시각화 할 수 있습니다. 알렉사 형석 594에 의해 방출되는 적색 형광은 pH를 구분하고 OBG의 산화 녹색 채널의 형광을 증가하는 동안, phagosomal 환경에서 일정하게 유지된다. 체외의 방출 스펙트럼은 산화 nonoxidized OBG 코팅 비드 산화 후의 강도의 상당한 증가를 나타내는,도 1b에 비교된다. 라이브 이...

토론

전술 한 방법에 비해, OBG 분석법 동적 대신 세포 집단에서 보통 ROS 신호 측정, 단일 세포 수준에서 phagosomal ROS 생성의 과정을 시각화한다. 이러한 인구 평균 방법은 비동기 식균 작용에 의한 중요 정보를 모호하게하는 경향이있다. 우리는 성공적으로 Dictyostelium의에 DHE와 AUR 분석을 적용하고 프로토콜을 최적화. 가장 중요한 것은, 우리는이 두 가지 분석에 의해 측정 된 유형과 ROS의 세포 내 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
OxyBURST Green H2HFF BSA	Invitrogen	O-13291
Alexa Fluor 594	Invitrogen	A-20004
Carboxylated silica beads	Kisker Biotech	PSi-3.0COOH
HL5C medium	ForMedium	HLC0102
LoFlo medium	ForMedium	LF1001
Bacto agar	BD	204010
Dihydroethidium	Sigma	37291-25MG
Amplex UltraRed	Invitrogen	A36006
Horseradish peroxidase	Roche	10108090001
Diethyldithiocarbamate (DEDTC)	Sigma	D3506-100G
Catalase	Sigma	C9322-1G
Cyanamide	Sigma	187364-25G
Lipopolysaccharides	Sigma	L2630-25G
EQUIPMENT
ibidi μ-Dish 35 mm, high	ibidi	81156	Bottom made of optically clear plastic
MatTek dish 35 mm	MatTek corporation	P35G-1.5-14-C	Bottom made of a glass coverslip
Scepter Cell Counter	Merck Millipore	PHCC00000
White 96 well plate	Nunc	236108
Centrifuge	SORVALL	Legend RT
Microplate reader	BioTek	Synergy Mx