나무 조직 내에서 절지 동물과 미생물 군집 유학을위한 기술

요약

We provide a technique to preserve intact tree phloem and prepare it for observation. We create an apparatus called a phloem sandwich that allows for the introduction and observation of arthropods, microbes, and other organisms that inhabit phloem tissues.

초록

Phloem tissues of pine are habitats for many thousands of organisms. Arthropods and microbes use phloem and cambium tissues to seek mates, lay eggs, rear young, feed, or hide from natural enemies or harsh environmental conditions outside of the tree. Organisms that persist within the phloem habitat are difficult to observe given their location under bark. We provide a technique to preserve intact phloem and prepare it for experimentation with invertebrates and microorganisms. The apparatus is called a ‘phloem sandwich’ and allows for the introduction and observation of arthropods, microbes, and other organisms. This technique has resulted in a better understanding of the feeding behaviors, life-history traits, reproduction, development, and interactions of organisms within tree phloem. The strengths of this technique include the use of inexpensive materials, variability in sandwich size, flexibility to re-open the sandwich or introduce multiple organisms through drilled holes, and the preservation and maintenance of phloem integrity. The phloem sandwich is an excellent educational tool for scientific discovery in both K-12 science courses and university research laboratories.

서문

침엽수의 체관부와 나무 껍질 조직은 유기체의 수천을 찾을 수 있습니다. Phloeophagy, 내부 껍질의 체관부 조직에 영양 공급, 보통 나무에서 사는 나무 껍질 딱정벌레, woodborers, 그리고 여러 가지 다른 무척추 동물과 미생물 분류군과 관련된 습관 ⁽²³⁾ 나무 껍질 딱정벌레. (딱정벌레 목 : Curculionidae) 개발 및 제외 체관부 범위 내에서 생활 성인 새 호스트 나무를 추구 짧은 기간. ⁽³¹⁾ 나무 껍질 딱정벌레가 광범위하게 나무 ^{(18, 19)에} 자신의 경제적 영향에 의한 연구되어 왔지만, 나무 재료 내에서 곤충의 직접 행동 관찰이 제한되어왔다. ⁴ 또한, 갤러리 나무 껍질 딱정벌레에 의해 건설 . 종의 수많은 서식지가 곰팡이 ^{(30) (11)} 광대 한 숫자, 박테리아 ^3, 진드기 ^10,21 및 선충 다른 약탈과 기생 절지 동물과 함께 ^{16, 19 (22, 24)은} 체관부 물질에 거주. 여기에 제공된 기술수피 딱정벌레, 진드기, 일반적으로 피질 환경에서 사는 나무 송곳을 직접 관찰 할 수 있습니다. 프로토콜에 약간의 변화는 곰팡이와 박테리아를 연구 할 수있다.

나무 조직 내에서 수피 딱정벌레 및 관련 생물 이용하여 연구 한 "사부 샌드위치를."이 기술의 조기 사용이 Dendroctonus (다시는 더글러스 전나무 딱정벌레의 애벌레 령충을 관찰하는 데 사용 된 1933에 문학 데이트에서 찾을 수 있습니다 다른 재료를 사용할되면서 pseudotsugae). ² 체관부 샌드위치는 많은 유도를 통해왔다. 원래,이 장치는 탄성 밴드가 함께 가압을 2 매의 유리판 사이에 배치 체관부의 부분으로 구성되었다. ^(2)는 나중에, 클램프, 테이프, 접착제, 플라스틱 및 다른 재료는 샌드위치 구조에 사용되어왔다. ^{13,14 여기에} 설명 ^15,17,26,28 프로토콜은 과거 디자인의 몇 가지 이상의 향상된 기능을 제공합니다. 예를 들면,과거, 시험 생물 종은 유리 또는 플라스틱 판 사이에 샌드위치의 측면을 체결했다. 이 한 방향으로 갤러리의 구성을 제한. 상판에 진입 구멍의 사용은 시험 생물 종 자연 갤러리 공사를 시작하기위한 더 큰 자유를 허용한다. 제시된 프로토콜의 또 다른 장점은 쉽게 몇 가지 도구로 구성 될 수있는 그것의 단순화 된 디자인이다. 체관부 샌드위치의 사용은 먹이 행동, 재생, 개발의 직접 관찰을 허용하고 있으며, 생물의 상호 작용 그렇지 않으면 불가능했을 것이라고. ^{1,5, 22이} 방법은 K-12 교육과 과학을위한 훌륭한 도구입니다 프로그램 및 표시됩니다.

에서 해석하기 어렵거나 원고에보고하지 않은 체관부 샌드위치를​​ 만드는 몇 가지 미묘한 차이가있다. 우리는 체관부 샌드위치의 생성 시각 (즉, 비디오)에 대한 설명이 필요하며 것이라고 믿는다과학자와 phloeophagous 생물 공부에 관심이 교육자들에게 값. 우리의 프로토콜은 절지 동물, 미생물 및 체관부 조직에 서식하는 다른 생물을 관찰 할 수있는 간단하고 저렴한 방법을 제공합니다.

프로토콜

1. 체관부 선택 및 나무에서 제거

1. 특정 특성을 가진 나무를 선택합니다. 소나무에서 사부를 수집 (즉, 속 Pinus 나무) 그들은 몇 mm 두께 특유의 체관부 층. ^18,27 나무가 위치한되면 곤충 공격과 같은 다른 결함이 있는지 검사, 약간 낮은 지점을 갖고있는로 및 / 또는 병원체. 또한, 이러한 체관부 샌드위치에서 가문비 나무 나무와 같은 다른 침엽수 나무에서 사부를 사용합니다. ⁽⁹⁾ 다른 나무 종은 활엽수로 체관부 제거에 적합 할 수있다.
   참고 : 큰 크라운 침엽수는 일반적으로 두꺼운 체관부 조직을 가지고있다. 사부의 양을 최대화하기 위해, 트렁크 (나무의 줄기)에 몇 가지 결함 지점을 가지고 나무를 절단하는 것이 가장 좋습니다. 최고의 자기 - 가지 치기 작업입니다 소나무 종. 사부는 일반적으로 재배 기간 동안 두꺼운이며 지상 근처보다 트렁크까지 더 두껍다. 체관부는 remov 때로는 어렵다가을 또는 겨울 시즌 동안 나무에서 전자.
2. 아래로 나무를 잘라 또는 체관부 조직을 얻기 위해 최근에 잘라 로그를 사용합니다. 나무에 손상뿐만 아니라 근처의 나무를 최소화 떨어지는 방향을 선택합니다. 트렁크 잘라 가지 체관부 제거하는 동안 나무 껍질 재료에 쉽게 액세스 할 수 있도록합니다.
3. 나무가 절단되면 (벌채, 지상에 떨어졌다) 날카로운 무승부 블레이드 (. 그림 1A)와 트렁크 오프 껍질을 긁어 시작합니다. 체관부 층에 도달 할 때까지 오프 껍질의 면적을 긁어.
   참고 : 외부 껍질 색. (그림 1B)에서 건조하고 어두운 상태에서 체관부 층은 일반적으로 색 (예를 들어, 크림 색상)와 습기에 가볍다. 체관부가 긁히지 않도록 각별히주의하십시오. 나무 껍질의 면적이 필요 체관부 조각 (들)의 크기에 따라 달라집니다 긁어.
4. 껍질이 제거 된 후, 날카로운 칼 체관부 조각의 윤곽을 잘랐다. 칼은 모든 방법 목부 (그림. 2A)로 인하해야합니다.
5. 체관부를 제거하려면, 조심스럽게 체관부를 다시 벗겨 손가락을 사용 체관부 조각의 모서리에서 시작합니다. 목부 오프 체관을 긁어을 지원하기 위해 칼을 사용합니다. 작품 전체가 제거 될 때까지 사부를 계속 가져갈.
   참고 : 사부는 일반적으로 여름에 가장 쉬운 나무의 박리. 제거하는 것이 대단히 곤란하다 체관부 들어 주걱 형상 도구는 노력에서 도움을 줄 수있다.
6. 무균 가방에 즉시 체관부 조각을 놓습니다. 최상의 결과를 얻으려면, 진공 ziploc 가방을 사용하는 경우, 가방에서 모든 공기를 제거, 가방 (그림. 2B)를 밀봉 또는. 이 사부의 수명을 증가시킨다. 선택적으로, 하나의 가방에 체관부의 여러 조각을 배치합니다. 약간의 신선도를 유지하기 위해 (1, 10C 사이) 동결 위의 밀폐 된 가방에 보관 체관부.

2. 체관부 샌드위치 만들기

1. 맑은 아크릴, 폴리 카보네이트, 또는 유사한 단단한 물질 클리어 (예, 유리)이 약간 큰 두 개의 동일한 조각을 잘라사부의 조각 (그림. 2C)보다 R. 아크릴의 가장자리 둘레에 파라 필름 씰을 찢어 모서리를 방지합니다. 이 프로토콜은. 두께의 투명 아크릴의 1/8을 사용합니다.
   참고 : 절단 조각의 크기는 대상 생물의 요구와 연구의 길이에 따라 달라집니다. 예를 들어, 나무 껍질 딱정벌레의 쌍 개월 동안 체관부 4 DM ^2를 이용하지만, 연구는 며칠 이내에 일어나는 경우에만 1 DM ^{2가 필요하다.}
2. 연구 유기체 (들)의 엔트리를 허용하도록 아크릴 조각 중 하나에 구멍을 드릴. 구멍의 크기와 수는 목표 (도. 2D)에 의존한다.
3. 아크릴 조각 사이의 체관부를 배치하기 전에, 아크릴 표면 (> 70 % 에탄올)을 살균하거나, 새로운 아크릴을 사용하는 경우, 보호 필름을 제거하십시오.
4. 멸균 아크릴 조각 사이에 체관부의 신선한 조각을 놓습니다. 체관부의 내측 또는 외측에 구멍 (들)과 동양 아크릴 편 whicheveR이 필요하다. 전형적으로, 삽입구쪽으로 사부 (그것에 껍질 있었다 측)의 외측에 직면한다.

3. 체관부 샌드위치를​​ 씰링

1. 체관부 샌드위치 주변에 임시 도장을 만들려면 2를 사용합니다. 체관부 샌드위치 (그림. 2C)의 가장자리 주위 뽑아 넓은 파라 필름 스트립. 선택적으로, 가장자리를 밀봉하기 위해 폴리 염화 비닐 리덴 랩을 사용한다. ⁽⁶⁾ 다음에, 체관부에 아크릴 집어 넣은 샌드위치의 각 측면에 배치 클램프. 전체 표면이 아크릴과 체관 (그림 2C) 사이의 공기 공간을 방지하기 위해 고정되어 있는지 확인합니다. 제대로 고정되지 않으면, 표본은 아크릴과 체관부 사이에 이동할 수 있습니다.
2. 반영구적 인 도장은 체관부 주위에 비 접착 에폭시 또는 석유 젤리를 추가 작성합니다. 재료가 완전히 체관부를 둘러싸고 있는지 확인합니다. 다음, 볼트와 클램프 또는 나사를 사용 체관부 꽉 아크릴을 개최 (미리 구멍을 드릴해야 할 수도 있습니다).샌드위치는 최대 하나 또는 두 달 동안 가능한 남아있다.
3. 연구 유기체의 산소를 필요에 따라, 샌드위치의 하나 이상의 측면 상에 에어 필터를 추가한다. 이것은 공기가 체관부 샌드위치에 입력하지만 체관부에서 수분 손실을 제한 할 수 있습니다. 또한 진균 및 세균 오염의 위험을 줄일 간단한 숯 필터를 사용한다.
4. 의지의 입구와 출구를 필요로 연구 표본의 경우, 곤충에 지루하게 할 수 있습니다 나무 또는 이와 유사한 재료로 아크릴 조각 중 하나를 교체합니다. 그들의 유충 상태 체관부 층 완성이 나무 뚫는의 관찰에 특히 중요하기 때문에 이후, 그들은 다음 목부로 보아.
5. 항목 구멍을 종료에서 시험 과목을 방지하기 위해 구멍을 통해 작은 배양 접시 (또는 다른 개체, 테이프), 차단 탈출을 배치합니다. 이 공간에있는 생물이 낮은 조명 수준에 익숙해 있기 때문에, 그것은 어두운 방이나 상자, 또는 장소 O에 샌드위치를​​ 배치 할 필요가있다위에 페이크 재료는 빛을 차단한다.

체관부 샌드위치 4. 관측 생물

1. 체관부 샌드위치 (그림. 2D)의 항목 구멍으로 연구 표본을 소개합니다. 붉은 빛 또는 낮은 설정 (그림. 2E)로 설정 흰색 빛 아래 해부 현미경을 사용하여 표본을 관찰한다.
2. 체관부 샌드위치에서 표본의 활동이나 성장을 기록하려면 현미경에 카메라 또는 비디오 카메라를 연결합니다. 현미경의 접안 렌즈 (그림. 2E & F)에 특수 비디오 카메라를 연결합니다. 진드기, 선충, 전갈 (pseudoscorpions)와 같은 매우 작은 유기체를 들면, 현미경에 부착 된 고해상도 비디오 카메라를 사용한다.
3. 소리를 녹음하려면, 체관부 샌드위치의 입구 구멍에 또는 체관부 샌드위치의 측면을 통해 마이크를 삽입합니다. 항목 구멍이 작기 때문에, 이러한 일렉 트릿 콘덴서 마이크로폰으로 작은 마이크를 사용합니다.
4. 의 측면 또는 표면에서 기록하려면체관부 샌드위치 피에조 소자 (도. 3B)를 사용한다. 사운드를 재생하기 위해, 동일한 피에조 소자를 사용하거나 아크릴계의 상부 또는 하부 표면에 촉각 변환기 (excitor)를 붙여.

결과

위에서 설명한 프로토콜은 나무의 껍질 아래에있는 암호 같은 환경에 사는 생물을 관찰하는 연구를 가능하게 할 것이다. 이 실험에서이 기술. ^(12)를 사용하여 우리는 우리의 실험실에서 대표 연구를 설명하는이 기술의 사용을 설명하기 위해, 체관부 샌드위치 (그림 생식 출력, 터널링 거리, 나무 껍질 딱정벌레의 생존에 음향 치료의 효과를 관찰하기 위해 사용되었다 . 2E와 2F). 체관부 샌드위치의 사용에 의해 가능하게 딱정벌레의 직접 관찰, 결과 몇 가지 흥미로운 사실​​이 발견되었습니다. 첫째, 우리는 마커마다 24 시간과 아크릴의 딱정벌레 '위치를 표시하여 매일 터널링 거리를 기록했다. 이 과정은 체관부 샌드위치 숨겨진 것 사운드 처리에서 유의 한 차이가 나타났다. 다음으로, 우리는 특정 사운드 처리와 산란율의 감소를 관찰했다. 전자에 허용 된 체관부 샌드위치의 이동 특성GG 관찰 딱정벌레 방해없이 해부 현미경을 완료한다. 이러한 관찰 동안, 우리는 현미경에 부착 된 고화질 카메라 비틀 산란을 동작 캡쳐. 다른 주목할만한 관찰은 동료의 살해 특히 음향 처리와 관련된 비행의 개시를 포함. 체관부 샌드위치 분석은 음향 치료에 껍질 비틀 반응의 연구에 매우 중요했다. 나무의 껍질 아래에 관찰하는 것은 불가능하다 이러한 발견은, 껍질 비틀 발생 맞서 싸우는위한 관리 옵션을 개발하는 데 중요한 공헌이다.

그림 1. A) 도구는 나무에서 나무 껍질을 제거 할 필요가 있었다. 항목 1과 2는 나무 떨어져 껍질을 긁어하는 데 사용 무승부 블레이드입니다. 항목 3 (도끼), 4 (풀 톱) 지점을 제거하는데 유용하다근처 면도 영역입니다. B) 무승부 블레이드의 사용은 나무에서 나무 껍질을 제거합니다. 붉은 껍질 아래에있는 사부의 밝은 색상을 알 수 있습니다.

그림 2. A) 껍질 후 사부의 제거는 나무. B) 진공 봉인 된 가방. C) 클램프 함께 아크릴 조각을 들고와 파라 필름 주변 오염 및 체관부의 탈수를 방지하기 위해 모서리 체관부 샌드위치에 저장 신선한 체관부 긁어 낸했다. D ) 껍질 비틀 근처의 구멍은 체관부 샌드위치를 ​​관찰하는 현미경을 사용하여) 아크릴. E로 드릴. 체관부 샌드위치 내 껍질 딱정벌레의 F) 비디오 디스플레이.

그림 3. A) 체관부 샌드위치 딱정벌레에서 페로몬 획득. 에어 체관부 샌드위치 내 산 소나무 딱정벌레에 압전 변환기 (사진 중앙)을 통해 슈퍼-Q 흡수. B) 녹음 및 사운드의 재생을 포함하는 튜브를 통해 뽑아되고있다.

토론

체관부 샌드위치는 절지 동물, 미생물 및 체관부 조직에 서식하는 다른 작은 생물의 도입과 관찰 할 수 있습니다.이 기술은 새로운 발견 결과는 ^{1,7,8,9,17,18과} 행동의 더 나은 이해를, 생명 역사의 특성, 개발 및 나무 체관부 내에서 생물의 상호 작용. 샌드위치 프로토콜은 여기에 설명 ^{1,5,10 과거} 디자인의 하이브리드, 쉽게 최소한의 장비 및 재료로 구성되는 경제적 샌드위치를 ​​제공 할 것입니다. 유리, 아크릴, 폴리 카보네이트 조각들은 재사용 될 수 있으며, 단지 소모성 재료 파라 필름 및 체관부이다.

프로토콜의 모든 단계가 중요하지만, 특정 단계는 성공의 최고 수준을 보장하기 위해 엄격하게 따라야한다. 먼저, 나무는 가지, 무료 또는 비교적 자유로운 나무의 줄기 부분을 갖도록 배치하여야한다. 많은 지점을 가지고 나무는 면도하기 어려운 y는 것체관을 제거 할 때 모든 지점 주변에 절단해야하기 때문에 약간의 ield 가능한 체관부 조각. 다음에, 체관부의 대기에의 노출을 최소화하는 것이 중요하다. 우리는 신속하게 제거시 가방의 각 체관부 조각을 배치합니다. 3-6 개 제거되면, 이들은 진공 밀봉 백에 전달된다; 우리는 필드 차량 배터리 오프 실러를 실행하는 전력 인버터를 사용한다. 마지막으로,이 프로토콜을 실행하는 것은 샌드위치에 곰팡이를 줄일 때 아크릴 조각 및 일반 청결 소독. 이 확장 관찰에 특히 중요하다.

전술 한 바와 같이, 체관부 샌드위치 장치의 한계가있다. 체관부 층이 얇기 때문에, 일반적 체관부에 남아 만 작은 유기체 샌드위치 내로 도입 될 수있다. 이러한 나무 송곳 같은 큰 곤충 (즉, Buprestid, Cerambycid 종)을 도입 라이프 사이클의 초기 단계에 대해 관찰 할 수있다. 이 기간은 일반적으로 2 개에 한정되는삼주; 이 시점 이후 유충이 용화에 구멍에 목질부 나무가 필요합니다. 반면, 속 IP에 추가 특히 껍질 딱정벌레를 들어, 전체 라이프 사이클 관찰을 포함 할 수있는 성인 딱정벌레에 짝짓기, 달걀 부화, 먹이, pupating 및 우화. 이 시점에서, 샌드위치의 생존은 일반적으로 탈수와 곰팡이로 인해 소모된다. ⁽²⁸⁾ 또한이 장치는 곤충 자유롭게 자연스럽게 식민지 또는 체관부 샌드위치를 ​​종료 할 수 없습니다. ⁽²⁷⁾

우리 프로토콜은 크기, 형상, 및 사용 사부의 형태의 관점에서 유연하다. 짧은 연구는 적은 체관부 재료를 필요로 샌드위치 크기는 따라 확장 할 수 있습니다. 대부분의 침엽수 종은 체관부 샌드위치에 체관부 기증자로 사용되어왔다 (예를 들어, 폰 데로 사 소나무 ^(12), 더글러스 전나무 ^2, 가문비 나무 ^(29), loblolly 소나무 ²⁷ longleaf 소나무 ^27). 샌드위치 재료는 변경 될 수 있습니다 EX에 대한충분한, 유리판 대신 에폭시 또는 아크릴 및 파라 필름 테이프 대신에 사용될 수있다.

이 프로토콜의 가장 어려운 부분은 체관부 제거 공정이다. 서로 옆에 나무는 체관부 제거하는 것이 얼마나 어려운 다를 수 있습니다. 나무가 어려운 체관부가있는 경우, 인내가 중요합니다. 이 경우,주의 깊게 하드 목질부와 스폰지 체관부 사이에 칼을 실행합니다. 이 프로세스는 트리 스키닝 같이 그대로 느낀다.

기본 샌드위치 기술을 마스터 한 후, 프로토콜에 변화가 맞는 특정 요구를 할 수 있습니다. 예를 들어, 체관부를 제거하는 데 필요한 기술을 연마하여, 큰 조각을 제거하고, 큰 샌드위치를​​ 만드는 데 사용될 수있다. 또한, 변경은 화학적 배출 (도. 3A), 또는 레코드 또는 재생 사운드 (도. 3B)를 모니터링하는 등의 특정 기기, 추가 구멍을 수용하도록 할 수있다. 수정은 반영구적 체관부 보존 및 장기 수 있도록 만들어 질 수있다ISMS, 이상 무료로 할 수있는 생물의 일시적인 관측.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Draw blade	Big Horn Brand	20265	11” blade
Fillet Knife	American Angler	30530	9” blade
Polycarbonate	Nexan	GE-33	0.093 in. thickness
Parafilm M	Fisher Scientific	S37441	2” wide
Clamps	Pony Jaw Opening	3201-HT-K	4” x 1”
Vacuum Sealer  and bags	FoodSaver	V2840; FSFSBF0742-015	VacLoc vacuum  bags in rolls