전자관 X-선 마이크로 분석에 의한 뉴런의 총 칼슘의 측정

요약

이 논문은 생리 학적으로 정의 된 생물 표본의 세포 이하의 해상도에서 총 칼슘 함량과 분포의 정량적 측정에 cryoanalytical 전자 현미경의 응용 프로그램에 대해 설명합니다.

초록

이 문서에서는 전자 프로브 미량 분석 (EPMA)로 알려진 기술을 사용하여 도구, 기술 및 세포 내 원소 함량의 정량적 측정을위한 적절한 도구가 설명되어 있습니다. Intramitochondrial 칼슘 때문에 미토콘드리아 칼슘 과부하가 신경 퇴행성 질환에서 활약하는 중요한 역할의 특정 초점이다. 방법은 X-선 분석 시료와 전자빔의 상호 작용에 의해 전자 현미경 (EM)에서 생성에 기초한다. 전자 현미경 표본의 확산 요소의 기본 분포를 유지하기 위해서, EPMA는 극박 저온부의 제조이어서 조직 "c​​ryofixation"를 필요로한다. 배양 된 세포 또는 Organotypic 슬라이스 문화의 급속 냉동은 각각 차가운 금속 블록에 액체 에탄 또는 슬램 냉동 동결 급락에 의해 수행된다. 저온부는 공칭 두께의 80 나노는 캘리포니아에서 다이아몬드 나이프로 건조 절단됩니다. -16076, C는 탄소 / pioloform 코팅 된 구리 그리드 상에 장착하고, 전문 cryospecimen 홀더를 사용하여 극저온-EM에 cryotransferred. C 낮은 전자 선량 ° ≤ -160에서 시각적 조사 및 위치 매핑 한 후, 냉동 수화 저온부는 동결 건조 ~ 30 분 -100 ° C에있다. 건조 저온부의 세포 기관 수준의 이미지는 느린 스캔 CCD 카메라와 분석을 위해 선택한 그 세포 내 영역에 의해, 또한 낮은 복용량에 기록됩니다. 문구, 집중, 고강도 전자 프로브의 ROI에서 출사 X-선은 에너지 분산 X-선 (EDX)에 연결된 전자 장치에 의해 처리 분광계, 및 X-선 스펙트럼으로 제시에 의해 수집되는, 즉, 에너지 대 X-선 강도의 줄거리. 추가 소프트웨어를 용이하게 : 자신의 "특징"피크 에너지와 지문에 의한 원소 성분의 1) 식별하고, 피크 면적 / 배경의 추출 2) 정량 분석​​. 이 논문은 일반적인 설명 두 가지 예와 결론미토콘드리아 칼슘 분석 허혈 저항의 근거를 제시 흥분 독성 손상 및 다른 메커니즘에 중요한 통찰력을 제공하는 하나의 EPMA 응용 프로그램.

서문

칼슘 이온은 시냅스 전달 및 유전자 발현 등 다양한 통상의 공정에서 필수적인 역할을 논증 생물학에서 가장 중요하고 다양한 세포 신호 전달 실체이다. 한편, 칼슘은 세포 죽음에서 동등하게 중요하다. 특히, 칼슘 규제 완화 뇌졸중의 신경 세포의 손상에 중요한 요소이다, 파킨슨 병, 알츠하이머 병 등 신경 퇴행성 질환 ^3,5. 따라서, 칼슘이 세포 내에서 어떻게 분포되는지를 정량적으로 이해하는 것이 매우 중요하고, 어떻게 이런 일이 생리적 또는 병태 생리 학적 자극을 다음과 같이 변경합니다. 용액에 무료 또는 기판에 결합 - - 셀룰러 칼슘 농도는 자극의 결과로서 수십배 이상 변경이 그 목표는 칼슘 동적 개의 물리적 상태 사이에서 분포되어 있다는 사실에 의해 복잡하게된다.

FR의 분석에 사용할 수있는 여러 가지 고급 방법론이 있지만세포 내 칼슘을 전자, 정의 세포 내 구획에서 총 칼슘 농도의 결정은 현실적으로 한 가지 방법, 즉, 전자 탐침 미세 분석 (EPMA)로 제한됩니다. EPMA 그 커플 투과형 전자 현미경 (TEM)에 대한 X-선 분광계 기술이다. TEM 전자총 관심 및 전자 충격의 결과로서 발광 소자 고유의 X-레이의 세포 내 영역에 고정, 서브 마이크론 전자 탐침을 포커스는 (상세한 기술 리뷰를 참고 ^{7, 4} 참조)를 수집 및 분석된다. EPMA의 장점은 하나의 세포 기관 수준의 해상도와 submillimolar 감도 있습니다. 그러나 실제로, EPMA 시편 준비 및 분석을위한 전문 cryotechniques 및 계측을 필요로한다. 여기에, 도구, 기술 및 EPMA를 사용하여 세포 내 칼슘의 측정을위한 적절한 도구가 설명되어 있습니다. Intramitochondrial 칼슘은 특별 난입니다중요한 역할의 계정에 nterest하는 신경 퇴행성 질환에서 미토콘드리아 칼슘 과부하 재생됩니다.

프로토콜

여기에 설명 된 접근 방식은 특정 악기, 도구 및 소프트웨어를 사용하여 개발되었다. 실험실이 같은 실험 장치를 사용하지 않기 때문에 접근이 가능한 일반화되어있다.

1. 급속 냉동

그들이 동결 순간 생균에 있었던 것에 정량적 확산 조직 성분 및 화학 원소의 분포를 유지하는 방식으로 세포 또는 조직의 하나) "cryofixation"설명하는 분석 방법에 대한 극저온 접근법에 절대적으로 의존 그리고 2) 극박의 제조는 TEM 이미징 및 분석에 적절한 저온부. 이러한 기술은 간략히 설명하지만, 다른 실험실에서이 절차를 재현하는 데 필요한 세부 사항은이 기사의 범위를 벗어난다됩니다. 관심있는 독자는 우수한 최근 기사 ^{8:9,14라고합니다.}

주의 :이 섹션에서는 액체 비누의 사용을 설명합니다가연성 및 폭발 위험이 있습니다 efied 에탄,, 적절한 예방 조치가 취해 져야한다. 연산자는 액체 질소에 대해 잘 알고 있어야합니다 (LN ₂₎ 보호 실험실 코트, 안경 및 장갑을 포함 cryoresistant 안전주의 사항. 참고 : 다음과 전반에 걸쳐, 모든 도구 (집게 등) 냉동 표본 실수로 해동을 피하기 위해 사용하기 전에 LN ₂ 예비 냉각해야합니다 처리하는 데 사용.

커버 슬립에 배양 된 세포

1. LN ₂ 냉각 중앙에 잘 -160 ° C에서 기체 에탄을 응축에 의해 급락 냉동 장치를 준비합니다. 마크에 입력하고 피벗 알루미늄 뚜껑을 사용하지 않을로 잘 커버.
2. 얇은 수성 필름 실험적으로 적절한 조건에서 배양 된 세포의 플라스틱 커버 슬립을 얼룩 여과지 웨지를 사용. 조직을 건드리지 않도록으로 에지로부터 가릴; 시행 착오에 의해 결정된 최적의 잔여 필름은, 가능한 한 얇은하지만 너무 번째 아니다조직 표면의 건조를 증발 할 수 있어야하기에.
3. 클램프 집게로 모서리를 커버 슬립을 들고, 신속하게 수동으로 또는 중력 구동 플런저를 사용하여, 액체 에탄에 몰두.
4. 장기 저장 용기에 커버 슬립의 원하는 번호를 조작하기에 충분히 큰 LN _2의 인근 스티로폼 그릇에 고정 된 커버 슬립을 놓습니다. LN _2에서 포착하지 않는 알루미늄 스크류 캡 캔 권장합니다.

배양 된 뇌 조각의 급속 냉동

5. 해부 현미경,보기 및 방향 그대로 여전히 문화 막 삽입에 첨부 된의 Organotypic 해마 슬라이스를 아래에서. 검은 빈틈 형 펜 및 사진과 조각의 가장자리 부근에있는 막에 기준 마크를 배치합니다.
6. 아직도 현미경, 약 잘라. 사각형을 중심으로 각각의 조각 5 × 5 ㎜의 막 사각형입니다. 조각을 만지거나 membran이 구부러지지 않도록전자.
7. (아래에 설명) cryoultramicrotome에 맞게 사용자 정의 만든 디자인 된 알루미늄 디스크의 직경 한천 패드의 ¼에 의해 쿠션 막 지원 조각, 설치합니다. 신속 공압 정의 "슬램 동결"장치에 의해 LN ₂ 냉각 사파이어 블록에 대해 그것을 추진하여 슬라이스를 동결.
8. 배양 된 세포에 설명 된대로 스토리지로 이동합니다.

2. 저온 절편 제작

주의 : 간단하고 논리적, 교육, 인내와 많은 연습을 필요로하는 동안 성공적으로, 얇은 부분의 건조 컷 리본을 생산.

1. -135 ° C.에 cryoattachment 멋진 장착 cryoultramicrotome를 구워
2. 약에 냉동 커버 슬립을 잘라. 날카로운, 예비 냉각 메스를 사용하여 3 × 3mm 사각형. 문화가 표준 3, 점성 액체 "cryoglue"에 (에탄올 1시 6분 혼합물과 2 - 프로판올 ¹¹⁾ 향 조각을 포함마이크로톰 시험편 척 맞게 설계된 mm 직경의 알루미늄 핀. 문화 표면에 cryoglue 유출하지 마십시오. -160 ° C를 ≤하는 cryobox 온도를 낮추는 방법으로 cryoglue 고형화
   • 냉동 뇌 조각의 경우, 안전하게 나사 고리에 의해 맞춤 제작 표본 척에 직접 디스크를 연결합니다.
3. 약에 - 조각의 커버 슬립의 조각 또는 확인 된 지역의 예를 들면 세포가 풍부한 지역 - 냉동 표본의 선택 영역을 낸다. 다이아몬드 트리밍 도구를 사용하여 250 × 250 μm의 블록 얼​​굴 ~ 100 μm의 깊이.
4. 캘리포니아에서 얇은 부분의 드라이 컷 리본. 35 ° 다이아몬드 cryoknife를 사용하여 -160 ° C에서, referencs ^{4, 9에} 설명 기본적으로. 절삭 속도와 나이프 여유 각은 경험적으로 결정되며 좋은 출발점이 9 ℃에서 0.4 ~ 0.6 mm / 초이다. 수화 부분의 공칭 두께, 즉 표본 사전, 난섹션은 주로 압축으로 인해, 실제로는 1.5-2.0 배 두꺼운 있지만, 일반적으로 80 나노 미터의. 만족 절편의 경우, 정전기 방지 장치가 필수적이다. 나이프 에지에서 장치 0.5 cm의 이온화 팁을 놓고 섹션의 만족스러운 리본이 될 때까지 출력을 조절합니다.
5. 나무 주걱 지팡이 (에폭시) 속눈썹을 접착하여 속눈썹 프로브를 준비합니다. 이러한 프로브를 사용하여, 픽업 칼의 뒷면에서 전송 섹션 100 메쉬 접는 구리 그리드에 캐스팅 글로우 방전, 탄소 코팅 pioloform 지원 필름 상에 뒤에 작업 선반에 반 접힌 인듐 호일 봉투에 휴식 칼. 감기 눌러 도구를 사용하여 그리드와 봉투의 위쪽 절반 눌러 접는다.
6. 알루미늄 편리한 그리드 상자와 상점에 전송 포장 그리드는 단계 1.4에서 설명 할 수있다.

3. 전자 현미경에 대한 표본의 Cryotransfer

EPMA의 핵심 장비이 실험실에서 120 kV의에서 운영하고 cryomicroscopy에 장착, 즉, 깨끗한 진공, 표본 면적 anticontaminator, 2K X 2K 고감도 디지털 카메라와 cryotransfer 시편 홀더를 설계 분석 전자 현미경입니다. 모두 낮은과 높은 배율 모드에서 현미경을 정렬 및 작동 상태를 미리 확인하고 이상적 ≤ ^10-7 Torr의 만족스러운 열 진공을 확인합니다. 필요에 따라 튜닝.

1. cryoholder의 듀어 구성 요소의 진공 단열이 양호한 지 확인합니다. 필요에 따라 펌프.
2. 통제 상자 홀더를 연결하는 케이블을 분리, 현미경 단계 내에서 높은 진공 상태 동안의 최저 온도, 최소 -160 ° C로 cryoholder 쿨. 연산자와 현미경 표면에 흘리 LN _2를 최소화하기 위해 홀더를 제거하기 전에 고니 오 미터 45 ° 시계 방향으로 기울이십시오.
3. 적분 보온 냉각하여 벤치 탑 cryoworkstation 준비160 ° C.를 ≤하는 D 컵
4. 전송 (quickly!) 현미경에서 냉각 cryoholder 워크 스테이션을내는합니다. 홀더의 서리 방패를 집어.
5. LN ₂ cryoworkstation의 작업 테이블에 저장 및 장소에서 그리드 샌드위치에서 검색합니다. 홀더의 표본도에 대한 고정 링은 테이블에 배치됩니다.
6. 인듐 봉투를 열고 cryoholder의 표본도에 동봉 된 접이식 격자를 이동합니다. 스패너 도구를 제공하고 서리 실드를 닫를 사용하여 고정 링을 사용하여 그리드를 고정합니다.
7. 빨리 cryoworkstation에서 cryoholder을 제거하고 현미경의 출입구에 삽입 가능한 한 빨리 펌핑 순서를 통해 이동합니다. 삽입에서 열 진공 최소한의 중단이 있어야합니다.
8. 0 ° 경사에 고니 오 미터를 반환합니다. 다시 연결하고 제어 상자를 재 활성화하고, 시편의 온도가 150 ℃에게 ≤되어 있는지 확인
9. 의 듀어 리필홀더를 표본 진공 및 온도가 완전히 복구 할 수 있습니다.

4. 섹션의 시각적 조사

1. 표본을 노출하고 전자 빔을 켜 홀더의 서리 방패를 집어.
2. 시각적으로 낮은 배율, 일반적으로 250X, 낮은 조명에서 표본을 평가합니다. 그림 1에 나타낸 바와 같이, 섹션은 얇고 부드러운, 접힌하지 않거나 중복, 평평하고 잘지지 필름에 부착, 일반적으로 그리드 막대로 가려지지한다.
3. 선택적으로 선택한 부분을 촬영하고 있습니다. (참고 : 냉동 수화 섹션 빔에 의한 손상에 매우 취약하기 때문에, 빔의 노출을 최소화합니다.) 선택된 부분의 좌표를 저장하는 자동화 된 디지털 고니 오 미터의 단계를 사용합니다.

5. 섹션의 동결 건조

1. 동결 건조 섹션을 CA에 홀더의 온도를 증가시켜. ~ 30 분 -100 °의 C를.
2. 아래 -160 ° C에서 나에 홀더를 Recool.
3. 이미징 전에 의한 열 순환 및 / 또는 진동 픽업에 이미지 드리프트를 방지하기 위해 cryoholder 제어 장치와 물리적으로 분리 컨트롤러 케이블을 해제합니다.

6. 세포와 세포 기관의 영상

동결 건조 부분의 구조 이미지는 캘리포니아에서 얻을 수있다. -160 ° C의 낮은 복용량, 적절한 소프트웨어에 의해 제어되는 2K X 2K 느린 스캔 CCD 카메라를 사용하여 디지털로 기록 된 제로 손실 이미지.

1. 하이 잡지 모드에서 EM을 활성화합니다.
2. 선택 및 이미지 ~ 2,000 X에서 (TIFFs을 같은 그림 2 참조) 선택된 셀 및 위치 이전에 기록 저장되어 고품질의 섹션에 대한 관심의 세포 내 영역을. (참고 : 건조 섹션은 이제 실질적으로 더 적은 연약하고 전자빔 손상에 덜 민감하다.
3. X-선 분석을위한 관심 영역 (ROI에)을 선택하기 위해 이미지를 평가합니다. 이 단계는 선택적으로 오프라인으로 수행, EM이 설정 될 수있는 경우에 할 수있다끄고 실온으로 가온 시험편.

7. X-선 스펙트럼의 취득

X-선 스펙트럼 중 하나를 사용하여 기록 할 수있는 몇 가지 상용 또는 사용자 정의 설계된 X-선 최소한의 에너지 분산 X-선 (EDX) 검출기, 관련 펄스 프로세서의 전자 제품과 호환 수집 및 디스플레이 소프트웨어로 구성된 분석 시스템. (본 실험에 사용 된 시스템은 표 1에 기재되어있다.)

1. 열 (필요한 경우)으로 EDX 검출기를 삽입 대물 조리개를 배출하고, 임의의 표유 방사선 개구 넣고 중심으로 X-선 취득 EM 구성. 시편의 서리 오염이 방지되는 가장 낮은 온도로 cryoholder을 조정하지만, 적어도 -100 ° C 이하
2. 홀더에게 발견을 향해 20 °를 기울이십시오.
3. 광 시야 촬상 조건 하에서, 그리고 하나의 individua에 행렬을 분석하고자 가정L 미토콘드리아는 분석을위한 미토콘드리아를 선택 필드의 중심으로 이동하고 초점을 맞 춥니 다.
4. (일부 현미경에 단지 제 2 응축기 포커스를 사용하여 빔을 수렴) 스포트 모드로 이동하여 100 nm의 자리에 (패러데이 컵 또는 유사한로 측정). 3 nA의 CA에 빔 전류를 증가시킨다.
5. 스펙트럼 수집 소프트웨어를 시작하고 디스플레이 모니터에서 방송 시간을 볼 수있는 100 초 인수를 시작합니다. 기록 스펙트럼 (그림 2)을 저장합니다. 표준형 EMSA 형식이 바람직하다.
6. EM을 종료하고 (오프라인) 분석 워크 스테이션에 여러 스펙트럼의 파일을 전송할 수 있습니다.

8. X-선 스펙트럼 분석

정성 분석

EDX 스펙트럼 (그림 2, 삽입)는 본질적으로 에너지 대 X-선 강도의 XY 플롯이다. 스펙트럼은 T의 원소 조성에 대한 정성 및 정량 정보를 포함피크의 "특성"에너지 강도가 그 요소의 양을 반사하면서 그 절정에 이르게 요소를 식별한다는 점에서 그 부피를 분석했다. 특징적인 피크는 서서히 변화 배경, "연속체"의 상단에 타고. (그림 2 전설 더 EDX 스펙트럼의 현저한 세부 사항에 대해 설명합니다.) 전체 주기율표의 피크 매니 폴드의 에너지 요소의 잘 알려진 전자 구조, 자동의 구성 요소를 식별하는 데이터베이스에 따라서 모든 EDX 소프트웨어 링크에 의해 정의된다 분석. 생리 학적 맥락에서, EDX 분석에 적합하다 일반적으로 흥미 요소 나 (1.04 케빈에서 K _(α)), P (2.01 케빈), K (3.31 케빈) 및 CA (3.69 케빈) 등이 있습니다.

1. 스펙트럼의 주요 요소를 식별하는 데 사용할 수있는 소프트웨어 데이터베이스 및 피크 일치하는 루틴을 활용할 수 있습니다. 생물학적 시료에서 나, 마그네슘, P, S, 망할 CIA, K, 및 CA에 대한 피크를 찾을 것으로 기대합니다. (주의 :마지막 두 요소는 중첩!)

정량 분석

EDX 스펙트럼의 정량 분석​​은 식별 된 피크의 통합 영역을 추출하고 농도로이 값을 변환 이루어져있다. 생물학적 분석을 위해 확립 된 방법은 (상기도 2에서 정의) 연속체의 강도는 분석 된 부피의 건조 질량에 비례한다는 사실을 이용한다 홀 피크 / 연속체 방법 ^4,7,10이며 . 공지 된 조성물의 표준 스펙트럼의 동일한 비율과 비교할 때 따라서, 피크 면적 / 연속체 영역의 비는 표적 세포 구획에서 농도를 지정한다. 이 방법은 일반적으로 밀리몰 / kg 건조 중량으로 표현 중량 당 몰 단위로 농도를 제공합니다. 이 기기는 특이하고 해석 엘에게 설명한 바와 같이, 예를 들어, 밀리몰 / L 젖은 중량 밀리몰 / mg의 단백질을 추가로 변환 할 필요가있다^4,10를 sewhere.

2. Z = 10 ~ 20 사이의 생물학적 요소 (0.5-4.0 케빈)의 피크 면적 (오류 추정)를 추출, 즉 나, 마그네슘, P, S, 망할 CIA, K, 및 칼슘, 분석에 내장 된 피팅 루틴 중 하나를 사용하여 소프트웨어 (특히 4 각주, 표 1 참조). 이 연구소는 단면 또는 여러 최소 제곱 피트를 사용합니다. 이 피팅은 K와 CA 피크 사이의 중첩을 (그림 2 참조) 해결에 세심한주의가 필요합니다.
3. 1.45-1.61 케빈 사이의 연속성을 통합 할 수 있습니다. 대체 무 간섭 영역이 사용될 수있다.
4. 기준과 비교하여 다음 피크 / 연속체의 비율과 농도를 계산한다. 분석을 통해 오류를 전파.
5. 생물 다양성을 반영 평균을 추정하기 위해 표준 통계 소프트웨어와 수식을 사용합니다.

결과

뇌 세포는 일반적으로 허혈성 조건에서 발생 병리 신경 전달 물질 방출의 결과로서 흥분 독성 손상 서스테인. EPMA 칼슘 막대한 양의를 격리 할 수​​있는 신경 세포의 미토콘드리아의 기능이 손상의 메커니즘을 이루는 방법을 발견에 매우 중요했다. 그림 3의 전자 현미경 사진은 빠르게 흥분 독성 자극 (100 μM NMDA)에 30 분 노출 후 냉동 배양 해마 신경 세포의 동결 건조 저온부에있는 ...

토론

전자 현미경 기반의 분석 방법 여기에 제시된는 탐지, 식별, 그리고 나, K, P, 특히 칼슘 등의 생물학적 그 몇 가지 요소, 정량 할 수 있습니다. 이러한 분석은, 세포 내에서 수행 될 수있다, 즉, 인트라 소기관, 급속 냉동 검체로부터 제조 저온부의 고품질 이미지에 대한 관심의 구조를 찾아 식별하는 능력 때문에 해상도. 전혀 오염이 조직 요소의 위치를​​ 정량적으로 보존 상태에서도, 종?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS/MATERIALS
Thermanox plastic coverslips	Thermo Fischer Scientific	72280
Culture inserts	BD Falcon	353090	For 6-well plates
Cryopins	Leica Microsystems	16701952	Grooved
Wood applicators	EM Sciences	72300
Folding EM grids	Ted Pella	4GC100/100	100 mesh
Indium foil	Alfa Aesar	13982	0.25 mm thick
EQUIPMENT
Plunge freezing device	Leica Microsystems	KF-80
Slam freezing device	LifeCell	CF-100
Ultramicrotome	Leica Microsystems	UC6
Cryoattachment for microtome	Leica Microsystems	FC6
Diamond cryotrimming tool	Diatome	Cryotrim 45
Diamond cryoknife	Diatome	Cryo 35
Antistatic device	Diatome	Hauf Static Line
Cryo electron microscope	Carl Zeiss Microscopy	EM912 Omega
EM cryo specimen holder	Gatan	CT3500
Slow-scan CCD camera, 2k x 2k	Troendle (TRS)	Sharpeye
Image acquisition software	Olympus SIS	iTEM suite
ED x-ray detector	Oxford Instruments	Linksystem Pentafet
Pulse Processor	Oxford Instruments	XP-3
PCI backplane card	4pi Systems	Spectral Engine II
Desktop computer	Apple	Any OS9-compatible model
X-ray analysis software	NIST	DTSA, DTSA II
Spreadsheet software	Microsoft	Excel
The CF100 is no longer sold commercially, although the machine is available at many academic facilities, and complete machines or parts can be found on-line. A video tutorial for the CT3500 cryotransfer holder is available at http://www.gatan.com/files/Movies/CT3500_Cryo_transfer_holder.mp4. The SEII is obsolete; the Universal Spectral Engine Is a later, PC-compatible product with comparable functionality. 4pi has ceased manufacturing and sales but still provides technical customer support. Used systems are often found online. The original DTSA is now obsolete. NIST offers in the public domain an updated successor, DTSA II 12 (http://www.nist.gov/mml/mmsd/software.cfm)