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요약

이 연구는 크게 생리학 관련 전단 흐름에 따라 세포 롤링 연구의 처리량을 증가, 멀티 웰 플레이트 미세 유체 시스템을 사용했다. 캐스케이드 및 환자 세포의 외인성 개체군의 전신 전달 다음 세포 호밍의 중요성을 원점 다단계 셀에서 셀 압연의 중요성을 감안할 때,이 시스템은 세포 기반 치료를 개선하기위한 스크리닝 플랫폼으로 잠재력을 제공한다.

초록

세포 기반 치료를위한 주요 과제는 전신 정맥 내 또는 동맥 내 주입 다음 그 조직에 고효율로 생존 세포의 대량을 대상으로 할 수 없다는 것이다. 따라서, 휴대폰 호밍을 증가하는 것은 현재 세포 치료를 개선하기위한 전략으로 연구된다. 혈관 내피 세포에 압은 셀 원점 복귀하는 과정에서 중요한 단계이며 평행 평판 유동 챔버 (PPFC)를 이용하여 시험관 프로빙 할 수있다. 그러나,이 저조한 제어 흐름 조건, 매우 지루한, 낮은 처리량 분석이다. 대신, 우리는 정밀하게 제어, 생리학 관련 전단 흐름 1,2에서 높은 처리량 세포 롤링 특성의 연구를 가능하게하는 멀티 웰 플레이트 미세 유체 시스템을 사용했다. 이 논문에서, 우리는 P-및 E-셀렉틴 코팅 표면뿐만 아니라 세포 단층 코팅 표면에 HL-60 (인간 골수성 백혈병) 세포의 회전 특성이 readil 할 수있는 방법을 보여y를 조사했다. 더 염증성 조건을 시뮬레이트하도록, 미세 유체 채널 표면이어서 상당히 동적 조건하에 HL-60 세포와의 상호 작용을 증가 종양 괴사 인자-α (TNF-α)로 활성화 된 내피 세포 (EC에)으로 코팅 하였다. 향상된 처리량과 같은 속도를 압연과 경로를 압연과 같은 매개 변수의 신속한 분석을 허용 통합 된 다중 매개 변수 소프트웨어 분석 플랫폼은 체외 세포 롤링 특성을 평가하기위한 중요한 장점이다. 세포 압연 및 원점 복귀에 영향을 미칠 수 있도록 설계 엔지니어링 방식의 신속하고 정확한 분석을 허용,이 플랫폼은 사전 외인성 세포 기반 치료를하는 데 도움이 될 수 있습니다.

서문

세포 기반 치료의 성공적인 임상 번역의 주요 과제 중 하나는 비효율적 인 배달 또는 원하는 사이트 3,4에 체계적으로 주입 된 세포를 대상으로합니다. 따라서, 휴대폰 호밍을 개선하기위한 방법 일정한 검색이있어, 특히 세포 치료를 개선하기위한 전략으로, 압연 전지. 혈관에 롤링 세포는 고전적인 질병 사이트 5 모집 백혈구에 대해 정의 된 세포 유도 폭포,에서 중요한 단계입니다. 이 단계는 내피 셀렉틴 사이 특정 상호 작용에 의해 지배된다, 즉, P-및 E-셀렉틴 (P-및 E-SEL), 백혈구 5,6의 표면에 자신의 카운터 리간드. 더 나은 이해와 셀 원점 복귀의 효율 향상, 특히 압연 단계는 세포 기반 치료를 개선하기 위해 새로운 플랫폼에 대한 탐구에 매우 중요합니다. 지금까지이 두 평면 플랫폼을 포함, 평행 판의 흐름 챔버 (PPFCs)를 사용하여 달성되었다세포 현탁액을 주사기 7,8, 9 펌프 사용하여 관류 통해 상부 플레이트에있는 유입과 유출 포트와 그들 사이 가스켓와 에스. 바닥 판의 표면은 중요한 세포 단층 / 기질로 코팅 될 수 있고, 전단 유동하 관류 세포와 표면 사이의 상호 작용은 다음 7을 탐구이다. 그러나 PPFC 거품 형성, 누출, 주요 단점을 제시 제대로 제어 흐름과 낮은 처리량, 시약 소모 및 매우 지루한 방법입니다.

전통적인 PPFC에 대한 대안 기술은 낮은 시약 소비 1,10으로, 정확하고, 컴퓨터로 제어되는 전단 흐름에서 세포 분석의 높은 처리 성능 (PPFCs보다 최대 10 배 이상)을 허용, 멀티 웰 플레이트 미세 유체 시스템입니다. 셀 롤링 실험은 USI를 세포 단일 층 또는 설계 기판 코팅 및 이미지가 될 수는 미세 유체 채널 내에서 수행된다NG 롤링 특성을 가진 현미경은 쉽게 적절한 소프트웨어를 사용하여 분석 하였다. 이 연구에서, 우리는 인간 골수성 백혈병 다른 표면에 (HL-60) 세포의 회전 특성을 연구하여이 멀티 웰 플레이트 미세 유체 시스템의 기능을 보여줍니다. HL-60은 P-및 E-SEL뿐만 아니라 다른 롤링 수용체를 발현하는 세포의 단층을 분석 하였다 같은 기판 상에 롤링. 또한, 항체 (AB)에 그 표면에 HL-60의 회전 운동을 중재의 특정 셀렉틴의 직접 참여를 설명하는 데 사용되었다 블로킹. 롤링 실험은 같은 회전 속도, 회전 세포 수 및 압연 경로 속성으로 키 롤링 매개 변수의 효율적인 분석을 허용하는, 최소한의 시약 / 셀 소비, 안정적인 전단 흐름에 따라, 용량 증가 하였다.

프로토콜

1. 세포 배양

  1. 인간 골수성 백혈병 (HL-60) 세포
    1. 75cm 문화 HL-60 세포를 20 % (V / V) 소 태아 혈청 (FBS), 1 % (V / V) L-글루타민 및 1 보충 Iscove의 수정 된 둘 베코의 중간 (IMDM), 15 ㎖ 2 플라스크 % (V / V) 페니실린 - 스트렙토 마이신을.
    2. 세포 현탁액의 볼륨의 절반을 흡입하고 완전한 IMDM 미디어로 교체하여 3 일마다 미디어를 변경합니다.
    3. 카르복시 디 아세테이트를 들어, 숙신 에스테르 (CFSE) 염색, 원심 분리기 HL-60 세포 현탁액 (400 XG, 5 분), 1 μM의 CFSE 용액에 resuspend (데워진 PBS에서 준비) 및 37 ℃에서 15 분 동안 품어 그런 다음 30 분 동안 신선한 데워진 배지에서 원심 분리기 세포, 기음 뜨는에 resuspend 세포. PBS로 세포를 세척 한 후 (P-SEL 코팅 표면에 CFSE 염색 HL-60 세포의 대표 이미지 그림 1B 참조) 롤링 실험을 위해 사용합니다.

참고 : CFSE 염색은 선택 사항이며, 미세 유체 채널의 롤링 현상을 설명하기 위해 여기에 표시됩니다. 이 논문에서 제시 롤링 매개 변수의 분석은 표준 시야의 영상을 사용하여 흠없는 세포에서 수행 하였다.

  1. 폐의 미세 혈관 내피 세포 (LMVECs)
    1. 코트 100mm 페트리 0.1 % 젤라틴 용액 (PBS에서의 v / V)와 함께 요리와는 적어도 30 분 동안 37 ° C에서 알을 품다.
    2. 전체 내피 성장 매체의 젤라틴 코팅 100mm 배양 접시에 문화 LMVECs은 (내피 기초 매체-2 (EBM-2)), 특정 성장 보조 장비 보충은) 시약을 참조하십시오. 미디어에게 80~90% 합류에 도달하면 매일과 하위 문화의 세포를 변경합니다.
    3. 하위 문화, PBS로 세포를 씻어 준 후 분리 세포를 1X 트립신-EDTA 4 ㎖로 3 분 동안 37 ° C에서 완전 EBM-2 미디어의 동일한 볼륨에 중화. 15 ML 튜브 및 centrifug에 세포 현탁액을 전송E (400 XG, 5 분). 원심 분리 후, 완전한 내피 미디어 1 ML에서 펠렛을 재현 탁하고 혈구와 세포를 계산합니다. 이 모든 실험을위한 통로 (7)에 따라 만 세포를 자신의 형태와 기능 사용에 영향을 미치는 등, 이상하지 통로 세포를 수행합니다.
  1. 중국어 햄스터 난소-P-셀렉틴 (CHO-P) 세포
    1. 안정적으로 인간의 P-SEL을 표현하는 형질 전환 된 CHO 세포이다 CHO-P 세포, 공동 작업자 (베스 이스라엘 디코 니스 메디컬 센터, 하버드 의대) (11, 12)에 의해 제공되었다.
    2. F-12 미디어 25 ㎖에있는 T175의 CM 문화 CHO-P는 세포 2 플라스크.
    3. 계대를 들어, 4 ~ 5 초 동안 PBS 10 ㎖로 세포를 세척 한 다음 전체 미디어에서 중화 한 다음 37 ℃에서 3 분에 대한 1X 트립신-EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 10 ㎖에를 Trypsinize.
    4. 원심 분리 세포 현탁액 (400 XG, 5 분), 정중, 상등액을 흡인 전체 미디어 1 ㎖ 중에 세포 펠렛을 재현 탁과 함께 세포를 세어혈구.

2. 통합 다 잘 플레이트 미세 유체 시스템의 작동

  1. 모든 장비가 제대로 연결되어 있는지 확인하고, 다른 모듈을 켜 : 컴퓨터, 컨트롤러, 거꾸로 현미경과 CCD 카메라.
  2. 이미징 소프트웨어를 열고, 멀티 웰 플레이트 모듈과 영상 모듈이 화면에 표시되어 있는지 확인하십시오.
  3. (컨트롤러에 연결) 증기 트랩에 튜브를 연결하고 또한 그들에게 압력 인터페이스에 연결합니다.
  4. 플레이트 히터 / 어댑터 멀티 웰 플레이트를 놓습니다. 우물 (아래에 설명)에 시약을 추가하고 접시 위쪽에 인터페이스를 연결합니다. 자동화 된 단계에 이미징 플레이트를 놓습니다.
  5. 인터페이스는 플레이트의 상부에 부착하고 멀티 웰 플레이트를 이용하여 쉽게 제어 할 정의 유속 미세 유체 채널을 통해 유체를 구동 웰의 상부에 컨트롤러로부터 공기압을 적용수동 모드에서 모듈 화면.
  6. 웰 사이에 관찰 영역에 걸쳐 채널 흐름 시약. 미세 유체 채널의 크기는 70 μm의 높이 350 ㎛의 넓​​은 x입니다. 선형 채널의 길이가 1mm이고 채널의 바닥은 브라이트, 위상, 및 공 초점 형광 현미경과 호환 180 μM의 유리 커버 슬립을 포함한다.
  7. CCD 카메라 (스트림 획득, 11 프레임 / 초)를 사용하여 영상을 획득하고 호환 가능한 소프트웨어를 통해 분석 할 수 있습니다.

3. 단백질 기질 또는 세포 단층과 미세 유체 채널의 코팅

  1. 피브로넥틴 또는 P-/E-selectin과 미세 유체 채널을 코팅
    1. PBS에서 20 ㎍ / ml의 피브로넥틴 용액 1 ㎖를 준비합니다. 코팅되어야하는 채널들의 수 (채널 당 피브로넥틴 25-50 μl를 사용)에 기초하여 부피를 바꾼다.
    2. 물론 각각의 입구에 피브로넥틴 솔루션의 25 ~ 50 μl를 추가합니다. 2 DYN / ㎠의 전단력 적용5 분 채널을 perfuse하는 데 필요한 권한입니다. 액체가 아니라 콘센트에 나타나는의 구슬을 유의하시기 바랍니다. 실온에서 30 ~ 45 분 알을 품다
    3. 우물에서 솔루션 (채널을 공급하는 중간 원에서 직접 흡인하지 않습니다) 1,13 대기음. 콘센트도에 PBS의 200 ~ 500 μl를 추가하고 5 분 동안 2 DYN / ㎠의 전단 흐름을 적용하여 PBS와 채널을 씻어. 채널은 정상적으로 피브로넥틴 및 사용 준비로 코팅된다.
    4. 표면 코팅을 할 수 있도록 37 ° C에서 1 시간 배양과, 상기 한 바와 같이 P 또는 E-SEL, PBS에서 원하는 사람의 재조합 단백질의 5 ㎍ / ㎖의 용액을 제조하고, 코트 채널 코트.
  2. 미세 유체 채널 내부 CHO-P 또는 LMVEC 단층의 생성
    1. 부드럽게 전체 미디어와 원심 분리기의 2 배 용량 (400 XG에서 5 분)를 사용하여 소멸, 3 분 동안 배양 접시에서 세포를 Trypsinize. 전체 미디어와 원심 분리기 10 ㎖ (400 XG에서 5 분)로 재현 탁 셀 전압 강하N.
    2. 현탁액으로 세포 농도를 결정하기 위하여 세포를 카운트. 채널 내부 합류 LMVEC 단층의 형성을 보장 15-20000000 세포 / ml로 세포 농도를 가지고. 합류 CHO-P 세포 단일 층의 경우, 50-60000000 세포 / ml를 사용합니다. 각 채널에 대한 세포 현탁액의 25 ~ 50 μl를 사용합니다 - 따라서 실험에 사용되는 결정 초기 셀 수.
    3. 잘 입구에 적절한 농도로 세포 현탁액의 25 ~ 50 μl를 추가합니다. 현미경의 무대에서 접시를 놓고 세포가 전체 채널을 작성 화면에서 관찰하고 흐름을 중단 할 때까지 채널 (2 DYN / ㎠)로 세포를 소개합니다.
    4. 전체 LMVEC 또는 CHO 미디어 중 하나를 200 ㎕ 씩 출구와 입구를 모두 입력합니다. 세포가 정착하자 인큐베이터에서 3 시간 동안 준수 (37 ° C에서 5 % CO 2).
    5. 3 시간 배양 한 후, 무소속 제거하기 위해 전체 미디어 (2 DYN / ㎠, 10 ~ 15 분)와 채널을 씻어세포. 세포는 이제 완전히 합류 나타납니다과 채널의 사용 준비가 완료됩니다. 초기 셀 시딩 밀도에 따라, 안정화 시간을 추가로 2 ~ 3 시간은 세포 표면의 전체 범위를 확인해야 할 수 있습니다.

4. LMVEC 프로 염증 활성화 및 P-/E-selectin의 항체 차단

  1. LMVEC 기초 미디어에서 TNF-α 용액 (10 NG / ML)를 준비합니다.
  2. , 채널에 LMVEC의 염증 활성을 유도 아니라 입구에 TNF-α 용액 100 μl를 추가하고 5 분 동안 2 DYN / ㎠의 전단 흐름을 적용하여 채널에 솔루션을 소개합니다. 제어 채널 (활성화되지 않은되는 EC)는, 흡입구 LMVEC 기저 매체의 100 μl를 잘 추가 채널 (5 분간 2 DYN / cm 2)로 소개한다. 채널은 지금 롤링 분석을위한 준비가되어 있습니다.
  3. P-SEL 및 LMVECs 및 CHO-P 세포에 E-SEL을 차단하기 위해, P-SEL (복제 AK4, 바에서 5 ㎍ / ㎖의 중화 소개샐 미디어) 또는 E-SEL (복제 P2H3, 기저 미디어 5 ㎍ / ㎖)을 채널로 항체 및 37 ℃에서 1 시간 동안 배양 다음으로, (5 분 2 DYN / ㎠) 기저 매체와 채널을 씻어. 채널은 지금 롤링 분석을위한 준비가되어 있습니다.

5. 기판 / 세포 단층 코팅 미세 유체 채널에서 HL-60 롤링 분석

  1. 조심스럽게 채널이 제대로 (세포와 코팅의 경우, 완전히 합류 세포 단층이 관찰되어야한다) 코팅되어 있음을 확인하기 위해 현미경으로 채널을 검사합니다.
  2. 롤링 실험, 원심 분리기 HL-60 세포 현탁액 (400 XG에서 5 분)에 대한 HL-60 세포 현탁액을 준비하고 기저 매체와 한 번 씻어. 5,000,000 세포 / ml로 HL-60 세포 현탁액을 생성하기 위해 (칼슘 2 + 2 + 및 Mg를 함유 기저 매체) IMDM에서 세포에 resuspend 횟수. 롤링 분석을 수행하기 위해 각 채널에 대한 세포 현탁액의 25 ~ 50 μl를 사용합니다.
  3. 셀 suspe의 25 ~ 50 μl를 추가합니다nsion 현미경 단계에 온도 조절 플레이트 홀더 (37 ° C) 및 장소 안에 잘 장소 접시를 콘센트에. 다음으로, (세포가 입구에 콘센트에서 흐르는 15 초 이내에 관찰되어야한다) 2 DYN / ㎠의 전단력을 적용하여 채널에 세포를 소개합니다.
  4. 전단 응력의 ​​함수로서 압연 응답을 검사하려면, (5 DYN까지 0.25부터 서서히 전단력을 증가 DYN / cm 2 0.25 전단을 줄이고 원하는 각 전단에 ( "스트림 취득"기능을 사용) 20 ~ 30 초의 영상을 취득 / cm 2. 그것은) 높은 가위를 사용하는 것도 가능하다.
  5. CCD 카메라 (스트림 획득, 11 프레임 / 초)를 사용하여 영상을 획득하고 호환 가능한 소프트웨어를 통해 경로를 회전하고 회전 속도를 분석 할 수 있습니다.

6. 표면 분자의 발현을 감지하는 유동 세포 계측법

  1. 트립신 처리 후, 원하는 세포 유형 (HL-60,-CHO의 (1-2 × 105 세포 / 샘플을 사용) 세포 현탁액을 준비PBS에서 P 또는 LMVECs) (- / -), 2 % FBS가 보충. 두 번 세포를 세척하고 50 μL (같은 버퍼를 사용하여)에 샘플 볼륨을 가져온다.
  2. 20 분 4 ° C에서 원하는 형광 - 복합 AB (자세한 내용은 첨부 표 참조) (알루미늄 호일로 커버) 각 샘플을 품어.
  3. 두 번 (같은 버퍼) 세포를 세척하고 200 μL에 스테인드 세포 현탁액의 최종 볼륨을 가져옵니다. 표면 분자의 발현을 검출하는 유동 세포 계측기를 사용하여 샘​​플을 분석한다.

결과

HL-60 세포가 피브로넥틴에 P-및 E-셀렉틴 표면에 롤 아니지만

그들은 롤링 리간드 P-SEL 당 단백질 리간드-1 (PSGL-1) 시알 릴 루이스 X (SLEX)을 포함하여 원점 복귀 리간드의 다양한 5,14 (그림 1A 표현으로 HL-60 세포는 황금 표준 "롤러"로 간주됩니다 ). 과 특정 상호 작용을 매개하는 테트라 당 SLEX위한 발판으로 표면 단백질 PSGL-1의 역할, P-및 E-SEL, 염증 5...

토론

외인성 세포 기반 치료의 성공적인 번역의 주요 과제 중 하나는 효율적으로 높은 생착 효율 3 부상과 염증의 사이트에 세포를 제공 할 수 없다는 것입니다. 셀룰라 롤링 결국 조직 (5)에 내피 통해 확고한 부착 및 이주에 이르는, 혈관의 벽에 세포의 감속을 용이 셀 원점 복귀하는 과정에서 중요한 단계를 나타낸다. 후보 세포 유형에 대한 압연 공정의 더 나은 이해는 세포 호밍을 ?...

공개

저자는 이익의 갈등을 선언하지 않습니다.

감사의 말

CHO-P 세포 박사 바바라 Furie (베스 이스라엘 디코 니스 메디컬 센터, 하버드 의과 대학)에서 일종의 선물이었다. 이 작품은 JMK에이 작품은 또한 JMK에 Movember - 전립선 암 재단 챌린지 상에 의해 부분적으로 지원되었다 건강 보조금 HL095722의 국립 연구소에 의해 지원되었다

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Human Lung Microvascular Endothelial CellsLonzaCC-2527
P-selectin-expressing Chinese Hamster Ovary Cells (CHO-P)Kind gift by Dr. Barbara Furie11,12
HL-60 CellsATCCCCL-240
Cell Culture Reagents
Endothelial Basal MediumLonzaCC-3156
EBM-2 MediaLonzaCC-3156
Endothelial Basal Medium SupplementsLonzaCC-4147
EGM-2 MV SingleQuotsLonzaCC-4147
IMDM - Iscove's Modified Dulbecco's Medium 1xGibco12440
F-12 (1x) Nutrient Mixture (Ham)Gibco11765-054
Penicillin Streptomycin (P/S)Gibco15140
L-Glutamine (L/G) 200 mMGibco25030
Fetal Bovine Serum (FBS)Atlanta BiologicalsSa550
Petri DishesBD FalconBD-353003
100 mm Cell Culture Dish, Tissue-Culture Treated Polystyrene
Centrifuge Tubes (15 ml polypropylene conical tubes)MedSupply PartnersTC1500
T75 FlasksBD Falcon353136
Gelatin Solution (2%)SigmaG1393
dPBS (without calcium chloride and magnesium chloride)SigmaD8537
Trypsin-EDTA Solution (10x)SigmaT4174
Antibodies
Anti-hE-Selectin/CD62ER&D SystemsBBA21
FITC Conjugated Mouse IgG1R&D SystemsBBA21
Anti-hP-SelectinR&D SystemsBBA34
FITC Conjugated Mouse IgG1R&D SystemsBBA34
FITC Mouse IgG­1 κ Isotype ControlBD Bioscience555748
Anti-SLeX /CD15s Ab, Clone: 5F18Santa CruzSC70545
FITC ConjugatedSanta CruzSC70545
Normal Mouse IgM-FITC Isotype ControlSanta CruzSC2859
PE Mouse Anti-Human CD162, Clone: KPL-1BD Pharmingen556055
PE Mouse IgG1 k Isotype ControlBD Pharmingen550617
Anti-P-Selectin Ab (AK4)Santa CruzSC19996
Anti-E-Selectin Ab, Clone P2H3MilliporeMAB2150
Mouse IgG1 Isotype ControlSanta CruzSC3877
Other Reagents
Recombinant Human TNF-alphaPeproTech300-01A
Cell Trace CFSE Cell Proliferation Kit - For Flow CytometryInvitrogenC34554
Human P-selectin-FC recombinant proteinR&D Systems137-PS-050
Human E-selectin-FC recombinant proteinR&D Systems724-ES-100
Fibronectin Human, PlasmaInvitrogen33016-015
Equipment
Bioflux 1000Fluxion BiosciencesBioflux Montage was the software used to run the experiments and analyze the data
BioFlux 48-well platesFluxion Biosciences
BD Accuri C6 Flow CytometerBD BioscienceCFlow Plus was the software used to run the experiments and analyze the data
Nikon Eclipse Ti-SNikon
CoolSnap HQ2 CCD cameraPhotometrics

참고문헌

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