세포 배양과 병아리 배아에서 축슨 유도 수용체의 역학을 평가하기 위해 pHluorin의 사용

요약

우리는 여기에서 pH 에 민감한 녹색 형광 단백질 변이체, pHluorin의 사용을 설명, 축 슨 유도 수용체의 스파티오-측두동역학을 연구 하는 세포 표면에 인신 매매. pHluorin 태그 수용체는 병아리 배아의 전기 기공을 사용하여 세포 배양 및 생체 내에서모두 표현된다.

초록

개발 하는 동안, 축 하 안내 수용 체 매력적이 고 반발 단서 모두에 축 슨 감도 조절에 중요 한 역할을. 실제로, 유도 수용체의 활성화는 축축기 팁, 성장 콘, 리간드에 반응하는 신호 메커니즘의 첫 번째 단계이다. 따라서 셀 표면에서의 가용성을 조절하는 것은 성장 원뿔 감도 설정에 참여하는 메커니즘 중 하나입니다. 우리는 여기에서 개발 중인 병아리 척수에서 체외 및 생체 내 모두에서 축소 유도 수용체의 현세세포 표면 역학을 정확하게 시각화하는 방법을 설명합니다. 우리는 플라즈마 막에 해결되는 축축물 유도 수용체의 분획을 구체적으로 검출하기 위해 녹색 형광 단백질 (GFP) 변이체의 pH 의존형 형광 특성을 이용했습니다. 우리는 먼저 이러한 pH 의존 구조의 체외 검증을 설명하고 우리는 더 관심축산축산구체의 스페티오 -측두동역학을 평가하기 위해, 병아리 척추 화음에서 생체 내에서의사용을 자세히 설명합니다.

서문

탐색 하는 동안 축 하 그들의 대상을 향해 그들을 안내 하는 여러 환경 단서를 통합. 이러한 단서는 축축단 단자 표면의 안내 수용체를 활성화, 성장 콘, 차례로 적절한 신호 경로를 시작합니다. 따라서, 수용체의 세포 표면 분포의 시간적 및 공간 조절은 성장 원뿔^1의감도를 설정하는 데 중요하다. 이러한 맥락에서, 상생축축에 의한 중간선 횡단은 수용체 세포 표면 수준의 조절을 조사하는 우수한 모델이다. 개발 척수에서, commissural 축축은 처음에 그들이 중간라인을 건너 복부 바닥 플레이트쪽으로 끌리고 있습니다. 횡단 후, 그들은 바닥 플레이트 매력에 대한 응답성을 잃고 바닥 판 기피제에 대한 반응을 얻어 서 바닥 판을 빠져 나와 신경계^2,3의단점 면에서 최종 목적지로 이동할 수 있습니다. 성장 콘 표면에서 수용체 가용성의 조절은 미드 라인 큐^4,5에응답의 전환의 기초 메커니즘 중 하나입니다. 따라서, 성장 콘의 혈장 막에 존재하는 수용체의 선택적 모니터링은 매우 중요하다. 당사는 개발 중인 병아리 척수에서 시험관 내 및 생체 내 혈장 막에 해결되는 축축 유도 수용체를 구체적으로 시각화하기 위해 녹색 형광 단백질(GFP) 변이체의 pH 의존형 형광 성질을기반으로 하는 방법을 설명한다.

로스만 과 동료는 일식 pHluorin^6을포함하여 GFP의 포인트 돌연변이 pH 민감 변이체에 의해 설계되었다. 이클립성 pHluorin은 산성 pH (<6)에 노출될 때 불형성인 성질을 가지며, 중성 pH에서 형광이 되는 동안. 이를 통해 세포내 산성구획(즉, 내성, 인신매매 소포)에서 국소화된 비형성 수용체를 혈장 막에 통합하여 세포외 중립 pH^7에노출된 형광 수용체로부터 구별할 수 있다. 이를 통해 미들라인 충충제 세마포린 3B^5(도 1A)에 대한 성장 콘 반응을 중재하는 축삭 유도 수용체인 plexinA1의 플라즈마 막 국소화를 모니터링하였다. 우리는 여기에 pHluorin-plexinA1 구조의 체외 특성화를 설명, 개발 병아리 척수에서이 구조의 오보 전기화^8-10에 다음 공간 및 측두해상도 모두 생체 내에서 축삭 유도 수용체 역학을 따를 수 있도록 극저온 섹션의 현미경 분석.

프로토콜

1. pHluorin와 플렉스A1 수용체를 태그하는 복제 전략

1. 백본으로서 적절한 발현 벡터를 선택한다(예를들어 마우스 수용체 plexinA1 발현 벡터, 안드레아스 푸스헬 박사의 종류 선물^11).
   참고: 이 플렉스A1 벡터는 플라즈마 멤브레인에서 효율적인 HA-또는 VSV 태그 수용체 삽입을 달성하기 위해 설계되었습니다.
2. PCR에 의해 증폭되는 이클립성 pHluorin 코딩 서열은 적절한 플라스미드를 템플릿으로 사용한다(예를들어 pHluorin-태그 된 GABA 수용체, 닥터 제이콥^2의종류 선물). 필요한 경우 백본의 복제 단계를 용이하게하기 위해 프라이머의 5'끝에 제한 사이트를 추가합니다.
3. 제한 부위(예를 들어, 도 1B에기재된 바와 같이 NruI/Kpn2I 제한부위)를 사용하여 신호 펩타이드와 수용체 코딩 서열 사이에 pHluorin 서열을 프레임에 삽입한다.
   참고: 수용체의 올바른 표적을 보장하는 신호 펩티드가 갈라져 있기 때문에, pHluorin은 그 후에 배치되어야 합니다. 이것은 신호 펩티드의 인식을 보증하고 관심의 수용체에서 pHluorin의 분열을 방지할 수 있습니다.
4. PCR에 의해 돌연변이가 도입되지 않았는지 확인하기 위해 얻은 구조서를 서열한다.

2. COS7 세포에서 pHluorin 태그 수용체 체외의 특성화

pH가 낮아짐에 따라 혈장 막에 도달하는 융합 단백질의 능력과 형광의 가역적 손실은 다음 절차를 사용하여 확인할 수 있다.

1. 1일차. 플레이트 1.5 x 105 COS7 세포는 Dulbecco의 수정 된 독수리 매체 2 ml에서 유리 바닥 35mm 접시 (DMEM - 10 % 태아 소 혈청 - 1 mM 나트륨 피루바테 - 25 U / ml 페니실린 / 스트라토마이신 - 2.5 μg / ml 앰프 BH).
2. 2일차. 트랜스펙트 세포:
   참고: 셀은 70-80% 컨할 수 있어야 합니다.
   1. 200 μl NaCl 150 mM을 준비하고 3 μg DNA 즉, pHluorin 태그 수용체를 코딩하는 벡터를 추가합니다. 부드럽게 소용돌이와 잠시 아래로 회전.
      참고: 이러한 실험에 사용되는 pHluorin-plexinA1 벡터의 맵은 도 1B에도시된다.
   2. 10 μl의 형질 전환 시약(또는 사용된 시약의 적당량)을 추가합니다. 즉시 소용돌이.
   3. RT에서 10분 동안 배양하십시오.
   4. 세포에 트랜스펙트 시약/DNA 믹스의 200 μl을 추가합니다.
   5. 접시를 부드럽게 이동하여 혼합물의 재분할을 달성하고 세포를 37°C 인큐베이터로 다시 배치합니다.
3. 3일차. 트랜스펙트 매체를 제거하고 2 ml의 신선한 완전 DMEM으로 교체하십시오.
4. 4일차. COS7 pHluorin-plexinA1 전염된 세포의 살아있는 세포 화상 진찰을 수행하십시오:
   1. DMEM 의 두 개의 알리쿼트 완성 매체를 준비하고 pH를 각각 3.5 및 9.5로 조정합니다.
      참고: 35mm 플레이트 1개의 경우 실험을 수행하기 위해 각 솔루션 1.5ml가 필요합니다.
   2. 세포 매체를 제거하고 DMEM 완전 배지 pH 7.4 1 ml로 교체하십시오.
   3. 현미경 챔버를 열지 않고 세포 배양 배지에 직접 다양한 성분을 주입하기 위해 적절한 유형의 튜브로 5ml 주사기를 준비합니다.
   4. 37°C, 5%_CO2 습한 작업 대기의 유지 보수를 허용하는 모듈을 사용합니다.
      참고: CO₂ 챔버의 사용에 대한 대체 접근법은 HEPES 버퍼링 된 매체 (일반적으로 셀 유형에 따라 10-25 mMM범위)를 사용하는 것입니다.
   5. 챔버에 세포를 배치하고 튜브와 주사기를 조정합니다.
      참고: 현미경은 기록 하는 동안 기계적 드리프트를 피하기 시작 하기 전에 평형 해야.
   6. 이미징 소프트웨어를 열고 다차원 획득 프로그램을 선택합니다.
   7. 40X 목표와 함께 감염된 COS7 셀을 찾아 소프트웨어의 위치를 표시합니다.
   8. 15 μm 깊이 획득을 위해 Z 스택을 구성합니다(플레이트에 미디어를 추가할 때 초점이 변경될 수 있음).
   9. GFP 필터 및 위상에 대한 노출설정입니다.
   10. 획득 타이밍을 구성합니다.
       참고: 5가지 관심 분야의 전체 실험의 경우 10분 동안 20초마다 획득하는 것으로 충분합니다.
   11. DMEM pH 7.4 배지에서 5개의 제어 이미지를 획득하고 수집합니다.
   12. 일시 정지 획득, pH 3.5 완전 DMEM 1.25 ml를 주입하여 배양 배지에서 5.5의 pH를 달성하고, 소프트웨어에서 이벤트를 표시하고 5시간 더 획득을 재개한다.
       참고: 녹색 형광은 점진적으로 사라져야 합니다.
   13. 일시 정지 획득, pH 9.5 완전 DMEM 1.2 ml을 주입하여 배양 배지에서 pH 7.4를 달성하고, 소프트웨어에서 이벤트를 표시하고 5시간 더 획득을 재개한다.
       참고: 플라즈마 멤브레인에 녹색 형광이 다시 나타납니다.
   14. 이미지를 분석합니다.
       도 2는 pHluorin-plexinA1 구조와 이러한 프로토콜을 얻은 대표적인 이미지를 나타낸다.

3. pHluorin-plexinA1 구조의 오보 전기포이션

1. 전기 화 전에 계란의 처리:
   1. 잠복하기 1주일 전까지 14°C의 냉장고에 수정된 계란을 보관하십시오.
   2. 배아가 단계 HH14^12에도달할 때까지 50-52 시간 동안 포화 습도가 있는 인큐베이터에서 38.5°C(101.3°F)에서 계란을 배양한다.
      참고: 배아가 노른자 위에 떠 있는 전기기공을 위해 제대로 배치되도록 계란은 잠복하는 동안 수평으로 배치되어야 합니다. HH14 단계는 척수및 적절한 생존율로 등쪽 뿌리 신경절에서 분화된 뉴런에서 플라스미드의 발현을 얻는 데 적합하다.
2. 전극성 배아^8-10:
   1. 전기 기공 준비:
      1. 2 μg/μl보다 우수한 농도로 내독소가 없는 DNA 플라스미드를 준비하여 원하는 농도로 희석할 수 있도록 한다.
      2. 다른 DNA 솔루션을 주입하기에 충분한 유리 모세 혈관을 당깁니다.
      3. 멸균 PBS (-Ca^{2 +}; -Mg^{2 +)}- 100 U / ml 페니실린 / 연쇄 절제술을 준비하고 38.5 ° C에서 평형.
      4. 후드, 곡선 가위 및 미세 한 집게를 살균.
      5. 전극 간격을 제어합니다.
         참고: 전극 사이의 4mm 공간이 일반적으로 사용됩니다.
   2. 창 계란¹³ (그림 3A):
      1. 곡선 가위를 사용하여 달걀의 무딘 면에 껍질을 관통하십시오.
      2. 0.9mm x 25mm 바늘과 5ml 주사기를 사용하여 알부민 2 ml를 제거하십시오. 노른자 주머니를 손상시키지 않도록 바늘을 수직으로 방향을 지정합니다.
      3. 껍질의 무결성을 유지하기 위해 테이프로 달걀 의 상단을 덮습니다.
      4. 곡선 가위를 사용하여 테이프 중앙에 껍질을 관통하여 달걀에서 알부민 2ml를 제거할 때 압력을 균등화합니다. 그런 다음 배아를 시각화하고 작업 할 수있을만큼 큰 창을 잘라냅니다.
      5. ~2ml 멸균 따뜻한 PBS (-Ca²⁺; -Mg²⁺⁾- 100 U /ml 페니실린 / 연쇄 절제술을 추가하여 배아의 탈수를 피하고 조작기에 더 쉽게 접근 할 수 있습니다.
   3. DNA를 주입하고 배아를 전기화
      1. PBS(-Ca²⁺; -Mg^2+)의플라스미드를 0.5-2 μg/μl 사이의 농도로 희석하고 빠른 녹색 염료를 추가하여 최종 0.025% 농도에 도달합니다. 모세관에 DNA 믹스를 적재합니다. 인젝터를 사용하는 것이 좋습니다.
         참고: 모세관 저항이 너무 크지도 않는다는 것을 확인하십시오 (배아를 주입할 때 어려움이 있을 수 있다는 것을 의미함) 또는 너무 작습니다 (모세혈관이 너무 크고 배아를 손상시킬 수 있다는 것을 의미함). 또한, 2 μg/μl보다 높은 핵산의 농도는 특이하지 않은 효과를 유발할 수 있으며 조절될 필요가 있다.
      2. 노른자-주머니와 코달 측의 신경관에 장전된 모세관을 뚫는다. 얕은 각도로 신경관을 입력하고 DNA믹스(도 3B)로꼬리에서 머리까지 루멘을 채웁니다.
         참고: 빠른 녹색을 사용하면 주입의 정확도를 제어할 수 있습니다.
      3. 신경관 양쪽에 4mm 백금 전극을 빠르게 배치하여 전극을 31V에서 500msec간격(그림 3C)으로500msec에 3펄스를 적용합니다.
         참고: 발전 하는 배아를 손상 하지 않도록 심장 또는 큰 여분의 배아 혈관에 전극을 배치 하지 마십시오. 기포는 전극에 형성되어야 합니다.
      4. 바늘로, 쉘의 수준을 감소시키기 위해 알부민 2 ml를 제거합니다.
      5. 테이프로 창과 무딘 면을 밀폐적으로 밀봉합니다.
      6. 계란을 원하는 단계에 도달할 때까지 인큐베이터에 38.5°C로 다시 넣습니다.

4. 배아 배아 포함 및 냉동 절제

1. 전기 포기 후 48 시간, 신중하게 전기 화 배아 (HH24 단계)를 수확한다. 테이프와 초리오알라토이드 멤브레인의 절반을 잘라냅니다. 배아가 노른자속으로 가라앉는 것을 방지하기 위해 배아 아래에 소쿠리를 배치하고 초리오알라토이드 막의 후반을 잘라냅니다.
2. 얼음 차가운 PBS로 채워진 해부 접시로 배아를 옮춥시다.
3. 형광 스테레오 현미경으로 신경관에서 형광을 찾아서 전기 기형 효율을 확인하십시오.
   참고 : RFP를 인코딩하는 대조 플라스미드의 응전화는 전기화 된 영역을 시각화하는 데 도움이 될 수 있습니다.
4. 척수의 전극 부위를 선택하기 위해 미세 두피를 사용하여 배아를 해부합니다.
5. 해부된 배아를 24웰 플레이트로 옮기고 pH 7.4 4% 파라포름알데히드(PFA) - 포스페이트 버퍼 살린(PBS), O/N에서 4°C로 수정한다.
   참고: 고정 단계는 "살아있는" 형성에서 pHluorin의 안정화를 허용하고 따라서 고정/투과화 된 조직에서 pHluorin을 사용할 수 있도록 하는 것이 중요합니다. 고정은 형광의 pH 의존적 변화를 크게 느리게 하지만, 고정 후에도 형태/프로토네이션 변경이 발생할 수 있다는 점을 고려해야 합니다. 따라서, 다음 프로토콜(포함, 극저전 및 관찰)은 고정 단계 후 3일 이내에 수행되어야 하며, 모든 버퍼는 pH 7에서 수행되어야 한다. 고정이 필요하지 않은 경우 라이브 조직 섹션에서 관찰을 수행하는 것이 좋습니다.
6. PFA 4%를 제거하고 pH 7.4 PBS로 배아를 세척하십시오.
7. PBS-15% 자당에서 배아를 배양하고 배아가 가라앉을 때까지 4°C에서 보관하십시오.
8. pH 7.4 7.5% 젤라틴- 15% 자당에서 고정 배아를 37°C에서 45분 동안 배양하여 배아가 완전히 내장되어 있습니다.
9. 얼음에 내장 금형을 놓고 pH 7.4 7.5 % 젤라틴 - 15 % 자당 400 μl을 추가하여 단단한 2mm 베이스를 달성하십시오.
10. 임베디드 배아를 절단 팁으로 흡인시키고 고체 젤라틴 베이스에 배아를 놓습니다.
11. pH 7.4 7.5% 젤라틴-15% 자당으로 커버하고 젤라틴이 고화되기 전에 배아를 집게로 배치한다.
12. 젤라틴이 고체되면 -40°C 이소프로판올 목욕(드라이 아이스 또는 액체 질소 사용)을 준비하고 젤라틴 블록을 5분 동안 동결시하십시오.
13. 동결 된 블록을 -80 °C로 유지하십시오.
14. 냉동 블록을 -20°C에 1시간 동안 놓습니다.
15. 금형을 제거하고 폴리에틸렌 글리콜 배지로 척의 블록을 고정합니다.
16. 블록이 단단히 고정되면 척을 극저온 시스템에 놓습니다.
    참고: 코팅된 슬라이드를 사용하여 염색 중 조직 손실을 방지하십시오.
17. 직렬 저온 섹션을 수행 (20 μm 극저온 섹션은 일반적으로 수행됩니다).
18. RT에서 15분 동안 냉동섹션을 건조시키십시오.
    참고: 저온섹션은 GFP 형광의 표백을 피하기 위해 불필요한 광 노출로부터 보호되어야 합니다.

5. 극저온 섹션의 현미경 분석

1. 10 분 동안 RT에서 pH 7.4 PBS에서 냉동 고극을 재수화합니다.
   참고: 필요한 경우, 핵은 Hoechst로 얼룩질 수 있습니다.
2. PBS에서 0.5 μg/ml Hoechst 용액을 사용하고 냉동고섹션을 15분 동안 배양하십시오.
3. 5 분 동안 pH 7.4 PBS로 슬라이드 3x를 헹구십시오.
4. 슬라이드 마운팅으로 진행합니다. O/N을 경화시키는 pH 7.4(또는 더 기본적인) 폴리비닐 알코올 마운팅 솔루션은 슬라이드와 커버슬립 사이의 기포 형성을 피하기 위해 커버슬립을 조심스럽게 배치합니다.
5. 마운팅 배지가 어둠 속에서 4 °C에서 O / N을 경화시키십시오.
6. 반전된 공초점 현미경을 사용하여 pHluorin-plexinA1 융합 단백질을 정확하게 시각화합니다: 최적의 핀홀및 광학 해상도에서 z 스택을 수행하고 20X(NA 0.75) 또는 40X(NA 1.3) 렌즈를 사용합니다.
   참고: pHluorin은GFP(즉, 509 nm에서 배출 피크)를 검출하는 데 사용되는 것과 동일한 매개 변수로 검출할 수 있습니다. 파장 흥분 및 감지 필터 설정은 이미징 소프트웨어에 의해 최적으로 정의됩니다. Hoechst는 425-460 nm (여기는 405 nm에서), GFP 또는 pHluorin 485-545 nm (여기는 473 nm에서) 사이에서 검출되고 RFP는 575-675 nm 사이에서 검출됩니다 (암송은 559 nm에서).

병아리 배아 척수에서 pHluorin-plexinA1 및 eGFP 발현의 대표적인 이미지는 도 4에도시된다.

결과

그림 1. A. 세포 컨텍스트에서 pHluorin-plexinA1 형광 특성의 계획. PHluorin은 pH가 인신 매매 vesicules 또는 내분모에서와 같은 산성 (<6)이며 pH가 중성인 세포 외 배지에 노출되면 형광인 세포 내 구획에서 비형성입니다. 이를 통해 pHluorin-plexinA...

토론

이 프로토콜은 세포 배양과 병아리 배아 척수의 발달 맥락에서 축축한 유도 수용체의 역학을 따르는 단계별 절차를 제공합니다.

드 노보 pHluorin 태그 단백질을 설계하려면 복제 전략에 관한 두 점을 고려해야합니다. 먼저, pHluorin 태그는 산성 내종의 루멘에 노출되어야하며, 결과적으로 혈장 막 수용체 풀을 시각화하기 위해 세포외 구획에 노출되어야 한다. 따라서, 수?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
COS7 cells	ATCC	CRL-1651
DMEM GlutaMAX	GIBCO	61965-026
Sodium pyruvate	GIBCO	11360-039
Amphotericin B	Sigma	A2942
Fetal bovine serum	GIBCO	10270-106
Penicillin/Streptomycin	GIBCO	15140-122
Exgen500 reagent	Euromedex Fermentas	ET0250
PBS -Ca2+ -Mg2+	GIBCO	14190-094
Fast green dye	Sigma	F7252
32% Paraformaldehyde aqueous solution	Electron Microscopy	15714-S	Dilute extemporaneously in PBS to achieve a 4% solution
Gelatin from cold water fish skin	Sigma	G7041
Sucrose	Sigma	S0389
Cryomount	Histolab	00890
Hoechst 34580	Invitrogen	H21486
Mowiol 4-88	Fluka	81381
Consumables
Bottom-glass 35 mm dish	MatTek	P35G-1.5-14-C
5 ml Syringe	Terumo	SS-05S
Needles 0.9 mm x 25 mm	Terumo	NN-2025R
Capillaries	CML	PP230PO	capillaries are stretched manually in the flame
Superfrost Plus Slides	Thermo Scientific	4951PLUS
Material
Curved scissors	FST	129-10
Microscalpel	FST	10316-14
Forceps	FST	Dumont #5 REF#11254
Equipment/software
Time lapse microscope	Zeiss	Observer 1
Temp module S	PECON for Zeiss
CO2 module S	PECON for Zeiss
Metamorph software	Metamorph
Eggs incubator	Sanyo	MIR154
Electroporator apparatus	Nepa Gene CO., LTD	CUY21
Electrodes	Nepa Gene CO., LTD	CUY611P7-4	4 mm platinum electrodes
Fluorescence stereomicroscope	LEICA	MZ10F
Cryostat	MICROM	HM550
Confocal microscope	Olympus	FV1000, X81
Fluoview software	Olympus
CLC Main Workbench software	CLC Bio