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요약

우리는 생쥐의 내측 반월 상 연골 (DMM) 모델, 골관절염 (OA) 연구를위한 효과적인 도구의 불안정에 대한 프로토콜을 설명합니다. 또한, 우리는 progranulin가 OA의 병인에 보호 역할을한다는 것을 나타내는,이 모델을 사용하여 progranulincan 과장 OA 개발 및 진행의​​ 부족을 증명하고있다.

초록

내측 반월 상 연골의 불안정은 (DMM) 모델은 생체 내에서 골관절염 (OA)의 병인에 많은 관절염 관련 분자의 병태 생리 학적 역할을 연구하기위한 중요한 도구입니다. 그러나, 세부, 특히 쥐에이 복잡한 모델을 구축하기위한 시각화 한 프로토콜은 사용할 수 없습니다. 여기에서 우리는 야생형 및 progranulin (PGRN) 이용했다 - / - 예 생쥐의 DMM의 모델을 유도하기위한 프로토콜,이 수술 유도 모델의 설립 다음 OA의 비교 발병을 소개하는대로 마우스. 생쥐에서 수행 된 작업은 menisco 경골 인대를 잘라 내측 반월 상 연골의 불안정을 야기 관절낭, 또는 DMM 작업을 개설 가짜 운전, 하나 있었다. 관절염의 심각도는 조직 학적 분석 (예 : Safranin O 염색), OA 관련 유전자의 표현, 연골 세포 외 기질 분자의 분해 및 골극 양식을 사용하여 평가 하였다ATION. 마우스,이 수술 유발 모델에서 더 심한 OA 표현형을 주도 PGNR 성장 인자의 손실 - DMM 작업이 성공적으로 야생형 및 PGRN - / 모두 OA의 개시 및 진행을 유도.

서문

또한 퇴행성 관절염으로 알려진 골관절염 (OA)는, 세계 인구의 15 %에 영향을 미치는 미국 내에서 46 만 명 이상, 그리고 윤 활막염, 연골의 변성 및 골극 형성 한 것을 특징으로한다. 그것은 유전 대사, 생체 역학, 생화학 적 요인의 복잡한 상호 작용의 결과 일 수있다. OA의 기본 메커니즘은 사회 과학을 회피하는 것을 계속한다. OA 2,3의 병인을 모방 수있는 수많은 동물 모델은 현재이 있습니다. 그것 때문에 다양한 유전자 변형 마우스의 유용성과 실험의 비용 효율성 양쪽의 생쥐 동물 모델을 확립하는 것이 중요하다. 실험 OA 모델의 여러 종류의 사이에, 내측 반월 상 연골 (DMM) 모델의 수술 유도 불안정 때문에 그것의 좋은 재현성 및 OA를 개발하는 동안 상대적으로 느린 진행의 잘 받아 OA 모델입니다. 이러한 특성은 모두가다른 처리 또는 형질 전환 유전자 3-8 OA 진행의 평가를위한 핵심이었다. 그러나, 수술 OA 모델의 일관성은 수술하는 동안 그 결과 다양한 요인에 의해 영향을받는, 외과 마우스 모델의 적용은 제한된다.

Progranulin (PGRN)는 각종 세포에서 발현 다기능 성장 인자이다. 그것은 PGRN 같은 상처 치유 09 종양 10, 11-15 및 염증 등의 각종 생리적 질병 과정에 중요한 역할을하는 것으로 알려져있다. 연구는 또한 PGRN의 부족이 인간과 생쥐 16-18 모두 신경계의 퇴행성 질환을 일으킬 수있는 것으로 나타났습니다. 그것은 PGRN 인간 관절 연골에서 발현되는 것으로 알려져 있으며, 그 수준은 상당히 OA 및 류마티스 관절염 (19)을 가진 환자의 연골 조직에서 증가된다. 또, PGRN 또한 연골 세포 증식 20, 분화 및 연골 내에서 중요한 역할을 담당개발 (21, 22) 중 성장판의 골화. 최근에, 우리는 PGRN가 TNF 수용체에 결합을 통해 TNF-α를 반감과 염증성 관절염 모델 13,14,23,24의 항 염증 기능을 전시하고 있다고 보도했다. 그러나, OA에 PGRN의 역할은, 특히 생체 내에서, 수수께끼로 남아있다. 생쥐 - 여기서, 우리는 수술 DMM 모델을 유도하고, 및 WT-PGRN / DMM 소재 모델을 확립 통해 OA 개발 PGRN의 역할을 조사하는 과정을 제시한다.

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프로토콜

동물에 관련된 수술의 모든 통증과 수술로 인한 불편을 최소화하기위한 노력으로 지역 기관의 동물 관리 및 윤리위원회의 승인을 받아야한다.

1. 준비하기

  1. 수술 약 25 g의 체중과 8-12주 세 남성 C57BL / 6 마​​우스를 선택합니다.
  2. 자일 라진 (5 ㎎ / kg)과 케타민 (40 ㎎ / kg)을 모두 함유하는 칵테일을 복강 내 주사를 통해 동물을 마취.
  3. 면도칼로 무릎을 면도 후 수술 동물을 드레이프와 베타 딘, 알코올 (3x)로 수술 부위를 소독하고 연고와 마우스의 눈을 포함한다.

2. 수술 과정

  1. 무릎 관절을 노출 1cm 길이 중간 파라 슬개골 절개를합니다.
  2. 슬개골 및 슬개 인대의 측면 전위를 부드럽게 무릎 관절을 엽니 다.
    1. 길이 방향으로 무릎 관절 캡슐을 잘라2.1 단계에서 중간 파라 슬개골 절개를 통해.
    2. 집게와 무릎 관절 캡슐을 해부하다.
    3. 왼손으로 뒷발의 말단 부분을 쥐고, 집게로 슬개골 및 슬개 인대의 측면 전위를 수행합니다. 부드럽게 뒷다리를 잡고 발에 외상을 방지해야합니다. 공동 캡슐 해부 더 나은, 더 적은 힘은 전위를 만들기 위해 필요합니다.
  3. 연골 표면의 건조를 방지하기 위해 작업 중 관절 연골의 표면에 멸균 식염수 드립.
  4. 경골 고원에 내측 반월 상 연골을 고정하는 중간 meniscotibial 인대를 잘라. 내측 반월 상 연골 아래에있는 연골을 손상하지 마십시오.
    1. 대퇴골 내측 관절 융기 및 경골의 내측 고원 사이에 위치한다 내측 반월 상 연골을 확인합니다.
    2. 경골 과간 융기와 내측 반월 상 연골의 측면을 연결하는 meniscotibial 인대를 확인합니다.
    3. 하이를 잡고ND 손으로 부드럽게 포, 및 제 10 외과 블레이드를 사용하여 조심스럽게 중간 meniscotibial 인대를 잘라. 연골 및 다른 인대 관절에 해치다가 발생하지 않도록하십시오. 많은 경우에, 커버 지방 패드쪽으로 당길 수 있지만 인대를 식별하기 위해 제거되어야 할 필요는 없다.
  5. 6-0 흡수성 봉합사와 무릎 관절 캡슐을 닫습니다.
  6. 6-0 실크 봉합사로 피부를 닫습니다.

3. 수술 후 관리

  1. 수술 후 통증을 최소화하기 위해 각 마우스의 수술 부위에 0.25 %의 부피 바카 인의 한 방울을 적용합니다.
  2. 물과 음식을 무료로 운영 쥐를 둡니다.

4. 외과 DMM 모델의 조직 학적 점수

  1. 지정된 시점에서 쥐를 희생 수술 후 (예를 들어, 사주, 8 주 및 12 주. 여기에 우리가 대표로 팔주의 결과를 보여 주었다).
  2. 전체 무릎 관절은, 탈회, embe에게 고정되어파라핀으로 dded 다음 5 μm의 간격으로 순차적으로 단면.
    1. 10 번 블레이드와 전체 뒷다리를 잘라.
    2. 조심스럽게 두 다리의 피부와 근육을 해부하고, RT에서 3 일 동안 4 % PFA에 샘플을 고정합니다.
    3. PFA를 제거하고 물 샘플을 청소합니다. 그 후 2 주 동안 4 ° C에서 EDTA의 샘플을 석회.
    4. 에탄올 그라데이션의 샘플을 탈수. 구체적으로, 다음 에탄올을 변경 및 O / N. 70 % 에탄올의 새로운 세트에서 샘플을 유지, 1 시간 동안 70 % 에탄올에서 샘플을 계속 그 후, 80 %의 샘플을 넣어 90 %의 에탄올 결과, 및 O / N. 100 % 에탄올 다음에, 각각 1 시간 동안 그들을 유지
    5. 에탄올을 제거하십시오. 1 시간 동안 oxylene에 샘플을 유지하고 oxylene의 새로운 세트로 변경합니다. 이 단계의 3 배를 반복합니다.
    6. 라이카 삽입 센터를 사용하여 파라핀 금형에 샘플을 포함합니다. 그 후, 샘플을 회전 마이크로톰 (Leica의 RM225을 사용하여 5 ㎛의 절편으로 아르5, 독일) 다음 유리 슬라이드에 수집.
    7. 직렬 시상 부분은 내측 관절 돌기의 중심으로 측면 외과의 중심에서 지역에 걸쳐있는 각각의 샘플에 대해 잘립니다.
  3. Safranin O 염색이 수행 이전 25 설명한대로 OARSI 채점 시스템을 통해 채점 및 통계 분석에 의해 이어진다.
    1. 첫째, oxylene에 슬라이드를 deparaffinize, 증류수에 에탄올 구배를 수화. 그 후, 슬라이드는 Weigert의 철은 Hematoxylin 솔루션, 0.05 % 빠른 그린 (FCF) 솔루션, 1 % 아세트산 용액, 0.1 % Safranin O 솔루션을 통해 염색된다. 수지 매체를 사용하여 슬라이드를 장착합니다.
    2. 조직 학적 점수에 대한 통계 분석을 수행, 연골과 연골 구조의 파괴의 비율에 프로테오글리칸 (붉은 색)의 손실에 따라 Safranin O 스테인드 슬라이드를 점수.

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결과

DMM의 모델은 성공적으로 생쥐에서 설립 PGRN의 결핍은 수술에 의한 OA 개발을 과장했다.

쥐 - 가짜와 DMM 작업 (그림 1) WT 및 PGRN - / 수행되었다. 8주 동작 후에, 마우스를 희생시키고, Safranin O 염색은 무릎 관절의 부분에서 수행 된, 조직학에 근거 관절염 점수의 통계적 분석 하였다. 도 2a에 도시 된 바와 같이, 유사한 초기 조건 (상부 패널) ?...

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토론

그것은 마우스의 변형이 DMM 모델 유도를 들어, 마우스의 서로 다른 균주 / 다음 C57BL6, 129/SvInJ 및 FVB 다음, 129/SvEv 균주에서 가장 높은 수준으로, DMM 후 OA의 정도를 변화 한 매우 중요하다고보고 N 26. DMM에 상대적으로 민감하다 우리가 본 연구에 사용 된 마우스 - 형질 전환 유전자의 많은 부분은 이러한 PGRN - /로 C57BL6 마우스에 설정됩니다. 유전자가 같은 FVB / N 마우스로 구분 변형을 기반으?...

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공개

우리는 여기에 우리가 관심의 충돌이 없다는 것을 선언합니다.

감사의 말

이 작품은 NIH 연구 보조금 R01AR062207, R01AR061484, R56AI100901, K01AR053210 및 (CJ 리우에) 류마티스 연구 재단 질환 표적 연구 보조금에 의해 부분적으로 지원되었다.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
No. 10 Surgical bladesFeather25-2976#10
6-0 sutureApplied DentalWG-N53133

참고문헌

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