광열 편향 빔에 의해 해결 단백질의 밀리 초 이하의 구조적 변화

요약

여기에서 우리는 마이크로 및 밀리 역학 및 신경원 칼슘 센서 하류 조절 요소 길항제 변조기 칼슘 연관과 관련된 구조적 변경의 지학을 모니터링 갇힌 칼슘 화합물, DM-nitrophen과 조합 광열 빔 편향 기술의 응용을보고 .

초록

함께 사진 음향 열량 및 열 격자와 광열 빔 편향은 기존의 정지를 사용하여 액세스 할 수없는 시간 규모를 밀리 초 단위로 마이크로에 단백질의 구조적 변화를 유도 빛의 시간 프로파일 볼륨과 엔탈피 변화를 모니터링 광열 방법의 가족에 속한다 흐름 악기. 양 및 / 또는 전체적인 엔탈피 변화가 프로빙 때문에 또한, 이들 기술은 형광 물질과 또는 발색단 라벨 부족한 단백질 및 다른 생체 고분자에 적용 할 수있다. ^칼슘과 관련된 구조적인 변화의 역학과 에너지 부문을 모니터링하려면 ⁺ 칼슘 트랜스 듀서, 이러한 신경 세포의 칼슘 센서, 갇힌 칼슘 화합물, DM-nitrophen, 사진 트리거에게 무료로 칼슘의 빠른 (τ <20 마이크로 초) 증가 채용에 바인딩 농도와 연관된 부피 및 엔탈피 변화는 광열 편향 빔 기술을 이용하여 조사됩니다.

서문

이러한 광 음향 열량, 광열 빔 편향 (PDB) 및 나노초 레이저 여기와 결합 과도 격자로 광열 방법은 일시적인 중간체 ^1,2의 시간 분해 연구를위한 광학 분광기를 과도 할 수있는 강력한 대안을 나타냅니다. 이러한 과도 흡수 및 IR 분광법 등의 광학 기법과 대조적으로, 그 주위의 발색단의 흡수 변화의 시간 프로파일을 모니터링; 광열 기술은 광학적으로의 시간 프로파일을 조사 할 가치있는 도구를 히트 / 부피 변화의 시간 의존성을 감지하고, 따라서 아르 "침묵"처리합니다. 지금까지, 광 음향 열량 과도 격자가 성공적으로 글로빈 ^3,4, 산소 센서 단백질과 리간드의 상호 작용에 이원자 리간드의 마이그레이션을 포함하여 사진에 의한 프로세스의 구조적 역학을 연구하기 위해 적용되었습니다 FixL ^{5, 6} 산화 효소 전자와 헴 - 구리의 양자 전송차 광계 II뿐만 아니라 로돕신 ⁷ 크립토 ⁸ 구조적 역학의 광 이성화.

내부 발색단 및 / 또는 형광 물질이 결여되어 생물학적 시스템에 광열 기술의 애플리케이션을 확장, PBD 기법 따라 광 트리거 갇힌 화합물의 용도 몇 마이크로 초 내에 리간드 / 기질 농도의 증가와 함께 또는 빠른 결합시켰다 갇힌 화합물에. 이 방법은 수있는 리간드 / 기판 내부 형광 또는 발색단 부족한 단백질 및 상업 정지 흐름 악기로 액세스 할 수없는 시간 규모에 바인딩과 관련된 구조적인 변화의 역학과 에너지 부문의 모니터링. 여기 케이지 화합물, 칼슘의 열역학 ^{2 +} DM-nitrophen, 사진 - 분열뿐만 아니라 신경 세포의 칼슘 센서의 C-말단 도메인에 칼슘 ^{2 +} 협회에 대한 반응 속도 아래로 모니터링 할 PBD의 응용 프로그램스트림 규제 요소 길항제 변조기 (DREAM)가 제공됩니다. CA는 ^{2 +는} 10 마이크로 초 이내에 사진 출시 된 CA로부터 ^{2 +} DM-nitrophen하고 ~ 300 마이크로 초의 시간 상수 unphotolysed 케이지에 다시 바인딩합니다. 한편, apoDREAM의 존재 밀리 초의 시간 단위로 발생하는 추가적인 운동은 관찰하고 단백질에 결합하는 리간드를 반영한​​다. 생물학적 시스템의 구조적 전환을 조사하는 PBD의 응용 프로그램은 어떻게 든 수단의 어려움으로 인해 제한되었습니다; 강력하고 재현 PBD 신호를 달성하기 위해 프로브와 펌프 빔의 예를 들어 힘든 정렬. 그러나, 계측 셋업의 세심한 디자인, 온도의 정확한 제어, 및 프로브 및 펌프 광의 조심 배향 광범위에 시분 볼륨 및 엔탈피 변화의 모니터링을 허용 일관되고 견고한 PBD 신호를 제공 10 마이크로 초 약 200 밀리 초까지 시간 규모. 또한, modific에서등 동일한 온도, 버퍼 구성, 광 셀 방향, 레이저 파워, 아래 샘플과 참조 흔적의 검출을 보장하기 위해 실험 절차의 관리 포인트는 크게 측정 반응 볼륨과 열량의 실험 오차를 줄일 수 있습니다.

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프로토콜

1. 샘플 준비

1. 샘플 준비하고 원하지 않는 uncaging을 방지하기 위해 어두운 방에있는 모든 샘플 조작을 수행하십시오.
2. 50 mM의 HEPES에 N, N, N ', N'- 테트라 키스 [(옥시 카르 보닐) 메틸] -1,2 - 에탄 디아민) - (2 - 니트로 -4,5 - 디메 톡시 페닐) - DM-nitrophen ((1 가용화 버퍼, 100 ㎜의 KCl, 400 μM의 최종 농도로 pH를 7.0 (= _{350 ㎚} ε 4,330 M ^-1 cm ^{-1 9).}
3. [DM-nitrophen] : [칼슘 ^{2 +]의} 바람직한 비율을 달성하기 위해 0.1 M 주식 솔루션에서 _{염화칼슘을} 추가합니다. 10 μM보다 큰 칼슘 ^{2 +} 협회 K _d의 단백질, [칼슘 ^{2 +]의} 비율 : 1:1 [DM-nitrophen는] uncaged DM-nitrophen에 사진 출시 칼슘 ^{2 +의} 바인딩을 방지하는 것이 바람직하다 . 사실, 칼슘의 90 %는 결합 단백질 ~ 10 ㎚ 및 400 ㎜로 DM-nitrophen 및 CA ^{2 +의} 총 농도로 DM-nitrophen의 K의 _{D 값을} 고려K _{d (으)로} = 10 μM은 apoform에있을 것입니다. 한편, K의 _D <10 μM과 단백질에 결합하는 칼슘 ^{2 +의} 연구를 위해, 그것은 [칼슘 ^{2 +]} 감소하는 것이 바람직의 :과 칼슘 ^{2 +} 착물을 방지하기 위해 0.95 [DM-nitrophen] 비를 APO- 단백질 케이지 사진 해리 사전.
4. 기준 화합물 K ₃ 가용화 [철 (III) (CN)를 _6] 또는 샘플과 동일한 버퍼 나 ₂ CRO _4.

2. 실험 설정하기

1. 기본적인 실험 구성은도 2에 도시된다.
2. 1mm로 프로브 빔의 직경 (HE-Ne 레이저의 632 nm의 출력, ~ 5 mW의 레이저 파워)를 조정하고 온도에 배치 셀의 중심을 통해 프로브 빔을 전파하는 핀홀 (P _2)를 사용 M ₁ 거울을 사용하여 셀 홀더를 통제했다.
3. 프로브 빔의 중심을 샘플 뒤에 거울 (M _2)를 사용하여위치에 민감한 검출기의 중심에.
4. 베스트 개의 다이오드와 바닥이 다이오드뿐만 아니라 감지기의 좌측 및 우측에서 두 개의 다이오드 사이의 전압 차 사이의 전압의 차이가 있음을 이러한 방식으로, 검출기의 중심에서 프로브 빔을 초점 제로.
5. YAG 레이저, FWHM 5 NSEC)이 355 nm의 레이저 거울 사이에 3mm의 핀홀 (P _1)를 사용 :이어서, 펌프 빔의 직경, Q-스위치의 Nd 355 nm의 출력을 형성.
6. 도 2에서와 같이 큐벳의 중심을 통해 펌프 빔 Copropagate. 그것은 두 개의 레이저 빔이 측정 가능한 편향 각 및 PBD 신호 따라서 높은 진폭을 구하는 것이 거의 동일 직선 방식으로 광학 셀의 중심을 통해 전파되는 것이 중요하다. 실험 조건 하에서, 프로브 및 펌프 빔의 교차 각도가 15 ° 미만이다.
7. 프로브 및 펌프를 정렬 기준 화합물을 사용하여더 긴 시간 척도 (~ 100 밀리 초)에서 양호한 S / N 비와 안정 PBD 진폭, 즉 만족 PBD 신호를 달성하기 위해 빔.
8. 355 nm의 레이저 미러의 증분 조정하여 프로브 빔에 대하여 펌프 빔의 위치를​​ 조정한다.
9. 위치 검출기에 민감한이 상하 포토 다이오드 사이의 차이로서 PBD 기준 신호의 진폭을 측정한다. PBD 신호는 빠른 시간 규모 (<10 마이크로 초)에 진폭의 급격한 증가를 나타내고 그림 3에서와 같이 100 밀리 초 척도에서 안정적으로 유지해야합니다. PDB 진폭의 총 변동성에 슛은 신호 진폭의 5 % 내에서하고 신호 재현성는 주로 진동에 의해 영향을받습니다.
10. 흡수 된 여기 레이저 파워 온 아인슈타인의 개수에 PBD 신호의 선형 의존성, E의 _측정에 의해 방출 열 에너지에 대하여 PBD 신호 진폭의 선형성을 확인= A는 여기 파장에서의 흡광도 기준에 대응한다 ^(1-10-A).
11. 레이저 아래 전력 약 1,000 μJ 및 다 광자 흡수와 각각 펌프 빔 전력의 감소를 방지하기 위해 여기 파장 0.5 미만에서 샘플 / 기준 화합물의 흡광도를 유지하고, PBD 신호의 선형성을 보장한다.

3. PBD 측정

1. 참조를 위해 PBD 추적의 측정으로 시작합니다. × 1.0 cm 1.0 cm 또는 1.0 cm × 0.5 cm 석영 셀에 참조 화합물의 솔루션을 배치하고 온도 조절 홀더에 셀을 배치합니다. 두 경로의 길이는 비교 PBD의 진폭을 제공한다.
2. 3 ° C.의 온도 증가와 함께 16-35 ° C의 온도 범위에서 온도의 함수로서 상기 기준 PBD 신호를 검출
3. 각 온도 변화에 따라, 위치에 민감한 검출기에 프로브 빔의 위치를​​ 확인하고 다시필요한 경우, 검출기의 중심 위치를 조정한다.
4. 식 2에 따른 함수로 [(DN / DT) / C의 _P의 ρ] 용어를 PBD 신호의 선형성을 확인합니다.
5. 참고 측량 등의 광학 셀의 동일한 방향을 유지하는 기준 화합물과 동일한 광학 셀에 시료 용액을 배치.
6. 참고 용으로 동일한 온도 범위 내에서 샘플 PBD 트레이스를 감지하고 [(DN / DT) / C의 _P의 ρ] 용어에 대하여 샘플 PBD 진폭의 선형성을 확인.

4. 데이터 분석

편향의 크기 때문에 수학 식 1에 따라 샘플 가열 (ΔV _번째) 및 비열 적 부피 변화 (ΔV의 _nonth)에 체적 변화에 정비례한다 :

샘플 _(S의 진폭) 및 기준 _(r)로 PBD 신호는 각각 수학 식 2 및 3을 사용하여 설명 될 수있다.

PBD 신호 장비 응답 매개 변수 (K)에 비례하고 아인슈타인의 수는 흡수 된 (E). 식 2의 첫 번째 항은, (DN / DT) (1/ρC의 _P) Q 인해 용매에 공개 열에 신호 변화에 해당한다. DN / DT 용어 굴절률의 온도 의존성의 변화를 나타내고, ρ는 용매의 밀도이며, _{C는 P의} 열용량이다. 모든 파라미터 증류수 알려져있다 증류수 및 적절한 버퍼 기준 화합물에 대한 PBD 신호를 비교하여 완충액에 대해 결정될 수있다. Q 열 returne의 양용매 D. ρ (DN / D ρ) 기간은 10 ~ 40 °의 C ^{(10)로부터의} 온도 범위에서 온도에 독립적 인 단위가없는 상수이다. Δn _{ABS 용어} 인해 용액의 흡수 종의 존재에 굴절율의 변화에 대응하고, 프로브 광의 파장이 용액 중의 어떤 종의 흡수 스펙트럼에 상대적으로 시프트 된 경우에는 무시할 수이다. 기준 화합물 _(R)에서 발생하는 신호는 E _{H는 ν는} 여기 파장에서 광자 에너지 식 3으로 표현된다 E _{H는 ν} = 80.5 만 kcal / 몰 355 nm의 여기를위한.

1. 도 3에서와 같이 사전 트리거 및 포스트 트리거 PBD 신호 간의 차이로서 PBD 기준 신호의 진폭을 가지고 간다. 유사한 방식으로, 고속 (A _발 ^{빠르게)의} 진폭을 결정하고 느린 단계 (A _발 ^느린) 샘플 PBD 신호.
2. 악기 응답 매개 변수, K를 제거 기준에 대한 PBD 신호의 진폭에 의해 샘플 PBD 신호의 진폭을 확장하십시오. 기준 신호에 대한 샘플 신호의 비율은 수학 식 4를 부여하고 같이 쓸 수있다 :
   
   
3. 이 방정식을 사용하여 솔루션 (Q)과 비열 부피 변화 [의 플롯의 각각 기울기와 절편,에서 사진 개시 반응과 관련된 (ΔV의 _{nonth) (S} / _R) E에 출시 된 열을 결정 _{H의 ν]} 온도에 따라 기간 [(DN / DT) (1/ρCp)] 대 용어.
4. 반응 볼륨과 빠르고 느린 과정에 대한 엔탈피의 변화를 결정하는 식 5-7에 따라 적절한 양자 수율에 관찰 된 볼륨과 엔탈피 변화를 확장하려면.
   
   
   
   
   
   
   동력학은 10 마이크로 초 ~ 200 밀리 초 사이의 시간 스케일로 발생으로 다단계 공정의 경우, 양 및 반응의 각 단계와 관련된 엔탈피 변화가 결정될 수있다. 각 단계에 대한 진폭 및 수명은 볼륨 및 엔탈피 변화의 시간 프로파일을 설명하는 함수 F (t)에 데이터를 피팅에 의해 분석된다.
   
   α _0의 ^빠른에 해당하고 _난의 ^느린 각각의 프로세스에 해당하는 α와 _{τ는 어디에서} 각 반응 단계의 수명입니다. FO 속도 상수의 온도 의존성 가입일R 개별 프로세스가 활성화 엔탈피 및 엔트로피 매개 변수를 쉽게 아 이어링 플롯을 사용하여 측정 할 수있다 _(내가 = 1 / τ K).

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결과

PBD의 대표적인 예는 칼슘 ^{2 +의} DM-nitrophen에서 칼슘 ^{2 +} 사진 방출에 대한 추적은 그림 3에서 볼 수 있습니다. 느린 단계는 칼슘 ^{2 +} nonphotolysed 케이지에 바인딩을 반영하는 반면, 빠른 단계는 칼슘 ^{2 +의} DM-nitrophen 및 CA ^{2 +} 해방의 사진 - 분열에 해당합니다. 온도 의존 인자 [C의 _P의 ρ / (DN / DT)]의 함수로서 기준 화합물의 진폭을 확장 빠르고...

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토론

광열 방법 뒤에 물리적 원리는 광 여기 분자 주위 용매 ^1,12 열적 가열의 결과, 바닥 상태로 이완 진동을 통해 과량의 에너지를 소산이다. 물과 같은 용매, 이것은 급격한 체적 팽창 (ΔV _번째)를 생성한다. 여기 상태의 분자 인해 결합 벽개 / 형성 및 / 또는 분자 (들) (반 데르 소재 즉 변화의 분자 크기를 변경할 수있는 분자 구조의 변화에 비열 부피 변화 (ΔV의 _nonth) 발...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-(4,5-Dimethoxy-2-Nitrophenyl)-1,2-Diaminoethane-N,N,N',N'-Tetraacetic Acid	Life Technologies	D-6814	DM-nitrophen, cage calcium compound, keep stock solutions in dark to prevent photodissociation
4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid)	Sigma Adrich	0909C	HEPES buffer
Potassium ferricyanide (III)	Sigma Aldrich	702587	reference compound for PBD measurements
Sodium chromate	Sigma Aldrich	307831	reference compound for PBD measurements
He-Ne Laser Diode 5 mW 635 nm	Edmund Optics	54-179	use as a probe beam for PBD measurements
Oscilloscope,	LeCroy	Wave Surfer 42Xs	400 MHz bandwith
Nd:YAG laser	Continuum	ML II	pump beam for PBD measurements
M355; Nd:YAG laser mirror	Edmund Optics	47-324	laser mirror for 355 nm laser line
M1 and M2; Laser diode mirror	Edmund Optics	43-532	visilbe laser flat mirror, wavelength range 300-700 nm
P1 and P2; Iris Diaphragm	Edmund Optics	62-649	pin hole to shape the probe and pum beams
L1; bi-convex lens	Thorlabs	LB1844	a lens to focus the probe beam at the detector, EFL 50 mm, wavelength range 350-2,000 nm
DM, dichroic mirror	Thorlabs	DMLP505	a longpass dichroic mirror with a cutoff wavelength of 505 nm
F1; Edge filter	Andower	500FH90-25	a long pass filter with a cutoff wavelength of 500 nm
Temperature-controlled cuvette holder	Quantum Northwest	FLASH 300