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요약

우리는 최소한의 비용 또는 전문 지식을 갖춘 ECM 단백질의 직접적인 결합을 허용 히드 록시 PAAm라는 새로운 폴리 아크릴 아미드 하이드로 겔을 제시한다. 마이크로 콘택트 프린팅 휴대 mechanostransduction을 연구 천연 세포 미세 환경의 많은 큐들의 독립적 제어를 용이하게하여 히드 록시 PAAm의 조합은 하이드로 겔.

초록

그것은 지금 잘 많은 세포 기능은 자신의 세포 외 기질 (ECM) 환경의 물리 화학적 및 기계적 신호와 세포의 상호 작용에 의해 조절되는 것으로 설정됩니다. 진핵 세포는 지속적으로 생화학 적 신호로 ECM의 물리적 변화를 형질 도입하기 위해 표면 mechanosensors 통해 로컬 미세 환경을 감지하고, 유전자 발현의 특정 변화를 달성하기 위해 이러한 신호를 통합. 흥미롭게도, 서로 ECM 캔 부부의 물리 화학적 및 기계적 매개 변수는 세포의 운명을 조절합니다. 따라서, mechanotransduction의를 이해하는 열쇠는 세포 기능에 ECM 큐의 상대적 기여도를 분리하는 것입니다.

여기에서 우리는 신속하고 쉽게 체외에서 mechanotransduction의 큐의 독립적 인 튜닝을위한 생물학적으로 관련 하이드로 겔을 생성하는 자세한 실험 프로토콜을 제시한다. 우리는 화학적으로 변성 폴리 아크릴 아마이드 하이드로 겔 (PAAm)는 자신의 본질적 비 ADHES을 극복하기중합시 히드 기능화 아크릴 모노머를 포함함으로써 속성 필자. 우리는 ECM 단백질의 원하는 성질의 고정화를 허용 록시-PAAm 불리는 신규 PAAm 하이드로 겔을시켰다. 마이크로 콘택트 프린팅은 독립적으로 단일 세포의 형태학, 매트릭스 강성 및 자연 ECM 단백질의 농도를 제어 할 수 있도록하여 하이드 록시 PAAm의 조합은 하이드로 겔. 우리는 시험 관내 세포 mechanotransduction의 과정에서 공부하는 모든 생물학 실험실에서 설정할 수있는 간단하고 빠른 방법을 제공한다. 우리는 ECM의 강성과 핵 사이의 기계적 커플 링을 보여 내피 세포에 대한 실험을 실시하여이 소설 두 차원 플랫폼을 검증합니다.

서문

지방 세포의 미세 환경의 많은 부분 (예를 들면, 강도, 기공 크기, 단백질의 성질, 또는 세포 리간드 밀도)가 이러한 운동성, 세포 증식, 분화 및 유전자 발현과 같은 세포 과정을 조절 규제 큐들의 좌표를 제공한다. 세포 외 환경의 물리 화학적 특성의 수정은 세포에 의해 감지 및 세포 편광, 마이그레이션 및 분화의 변형 등 다양한 생리 학적 결과를 야기 할 수 있습니다. 그것은 세포가 세포 생화학 적 신호로 ECM 수정을 번역하는 방법을, 그러나 확실하지 않다. 따라서 주요 중요성 mechanotransduction의 경로를 공부 셀과 미세 환경 사이의 상호 작용을 재현 할 수있는 시험 관내 미세 환경 제어 엔지니어이다. 이 문제를 해결하기 위해, 우리는 최근에 쉽게 두 푼을 생성하기 위해, 히드 록시 PAAm 하이드로 겔이라는 새로운 방법 하나를 소개했다nsional 소프트 독립적으로 중요한 mechanotransduction의 단서를 제어 할 수 있도록 매트릭스 : 매트릭스 강성, 셀 형상과 감금, 단백질 및 세포 리간드 밀도의 자연입니다.

ECM은 morphogens에서 그라디언트를 통해 세포 과정 (화성), 접착 단백질 (haptotaxis), 강성 (durotaxis)을 지시합니다. 지난 몇 년 동안, 시험관 플랫폼에서 첨단 세포 생리 프로세스 2-5로 생화학 및 생물 물리학 적 기능을 변환 할 수있는 방법을 애타게하기 위해 이러한 세포 외 신호를 분리하기 위해 개발되었다. 전자빔 (6), (7), 포토 리소그래피, 광 화학적 고정화 8 또는 플라즈마 - 보조 기술도 9는 기판 상에 미세 패턴 살아있는 세포의 성장을 유도하기 위해 개발되었다. 이러한 기술이 중요한 결과를 산출하고 있지만, 이들 중 대부분은 세포 행동에 상이한 큐들의 개별적인 영향 사이의 차별을 허용하지그들은 몇 가지 실험실이 감당할 수있는 기술 설비를 필요로한다. 이러한 기술 중 미세 접촉 인쇄 (μCP)는 세포 접착 마이크로 섬 열을 만들 수있는 강력하고 접근 가능한 방법으로 떠오르고있다. 최근에, 광범위한 노력 11-14은 생체 조직에서 관찰 강성의 넓은 범위를 재현하기 위해 가변 강성과 하이드로 겔에 μCP을 개발되었습니다. 이들 작업 중, 폴리 아크릴 아미드 (PAAm)는 15 대중적 이미 세포 생체 역학 분석을 위해 가장 일반적으로 사용되는 중합 체계 매트릭스 중 하나입니다.

PAAm 표면은 일반적으로 N-sulfosuccinimidyl -6- [4'-아지도-2'-nitrophenylamido] (술포 SANPAH) 및 ECM 단백질 술포 SANPAH의 니트로의 UV 활성화함으로써 표면으로 연결되어 헤테로 가교제로 작용된다 아 지드 그룹 16. 또 다른 기술은 심한 산화 된 단백질에 결합 히드라진에 이루어져요오드 17. Hynd 및 동료 acroyl - 스트렙 타비 딘 단량체 (18)의 존재 광중합을 필요로 단백질과 펩타이드 생체 모방 하이드로 겔 표면을 패터닝하는 기술을 소개했다. 최근 챙은 외. 일 에틸 3 - [3 - 디메틸 아미노 프로필] 카르 보디이 미드 히드로 클로라이드로 활성화 된 PA 젤을 배양하는 데 필요한 광학 석영 마스크를 통해 PAAm 깊은 UV 노출에 기초한 새로운 미세 가공 방법 19 (EDC)를보고했다 및 N-히드 록시 숙신이 미드 (NHS) 수용액 전에 단백질을 추가한다. 긴 합성 과정 (예, 투석, 동결 건조, 등), 비싼 화학 물질 (예를 들면, 히알루 론산, 술포 SANPAH) 또는 깊은 UV : 균일하고 재현성 단백질 미세 패턴을 생성하기 위해 이러한 기술의 능력에도 불구하고, 대부분의 주요 한계 고통 조사. 또한, 이들 기술은 강성 기판, 미세 패턴의 독립적 인 변조를 허용하지 않는다기하학, ECM 단백질 자연, 그리고 세포 리간드 밀도.

계정에 이러한 한계를 가지고 가서, 우리는 부드러운 하이드로 겔의 단백질 및 생체 분자의 다양한 고정 수 및 세포 기능에 미치는 역할을 해독하기 위해 mechanotransduction의 큐의 독립적 인 튜닝을 허용하는 새롭고 간단한 아크릴 아미드 기반의 접근 방식을 개발했다. 대신에 강한 화학 화합물 PAAm 하이드로 겔을 치료, 우리 PAAm 중합 중에 수산기와 상업용 아크릴 모노머를 도입. 이 간단한 조작으로 다른 기술적 요구 사항없이 PAAm 하이드로 겔의 고유 안티 - 접착 성을 극복한다.

수산기의 존재는 수소 결합 상호 작용을 형성하는 단백질 및 생 분자를위한 히드 록시 PAAm 하이드로 겔의 높은 친화력으로 이끈다. μCP와 함께, 하이드 록시-PAAm 하이드로 겔은 독립 제어와 이차원 배양 플랫폼의 신속한 생성을 가능하게mechanotransduction의 연구를위한 강력한 플랫폼으로 구상하는 매트릭스 강성, ECM 단백질의 종류, 세포 리간드 밀도와 밀폐 된 접착에.

이 프로토콜의 목적은 쉽게 재료 과학에서 어떠한 지식없이 록시-PAAm 하이드로 겔을 제조하기위한 필요한 정보를 제공하는 것이다. 연구자 병태 생리 학적 기전에 관여 mechanotransduction의 경로를 더 잘 이해 될 수있는 세포 및 조직 수준에서 생리 관련 질문을위한 궁극적 목적은 수단을 제공하는 것이다.

프로토콜

1 유리 Coverslips는의 표면을 활성화

  1. 페트리 접시 스미어 (권장 화학 흄 후드) 5 분 정도에 0.1 M NaOH 용액에 넣어 유리 원형 커버 슬립 (25mm 직경).
  2. NaOH 용액을 제거하고 부드럽게 멸균 문화 후드에 흔들 접시에 락을하는 동안 완벽하게 20 분 동안 멸균 DDH 2 O로 된 커버를 체험.
  3. 멸균 DDH 2 O를 배출하고 단계 1.2를 반복합니다.
  4. 멸균 핀셋으로 된 커버를 제거하고 활성화 된 얼굴 위로 새로운 배양 접시에 배치합니다.
  5. 고순도 질소 가스의 지속적인 흐름하에 건조 된 커버.
  6. 멸균 배양 후드에서 1 시간 동안 커버 슬립의 활성화 측면에서 3 - (트리 메 톡시 실릴) 프로필 아크릴 레이트 (92 %)의 얇은 층을 얼룩.
  7. 광범위 살균 DDH 2 O 3 세척과 유리 된 커버를 세척하고 새로운 배양 접시에 무균 DDH 2 O에서 그들을 몰입.
  8. 페트리 접시를 누릅니다및 파라 필름으로 10 분 동안 교반과에서 로커 접시에 놓습니다.
  9. 좋은 팁을 멸균 핀셋 DDH 2 O의 커버 슬립을 제거하고 활성화 된 얼굴 위로 새로운 배양 접시에 배치합니다.
  10. 커버 슬립에 달라 붙는 먼지를 방지하기 위해 알루미늄 호일로 건조한 장소에서 실온에서 보관하십시오.

히드 록시 PAAm 히드로 겔의 2 준비

  1. 1.5 ㎖의 에펜 도르프 튜브에 N-하이드 록시 에틸 아크릴 아미드 (HEA) 65 mg의 중량을 준비한다. 이는 신선한 HEA 용액을 제조하는 것이 중요하다.
  2. HEA에 50 mM의 HEPES 버퍼의 1 ML을 추가하고 전체 HEA 용해 할 때까지 vortexer를을 사용하여 혼합한다.
  3. 바람직한 하이드로 겔 강성에 도달 / w HEPES 아크릴 아미드 용액 및 / HEPES 비스 - 아크릴 아미드 용액에 w (표 1 참조) w 2 % w 필요한 부피 40 % 400 μl를 추가. 5 ML의 최종 볼륨에 50 mM의 HEPES로 조정합니다.
  4. vortexer를 탈기하고 그것을 사용 용액을 섞어하이드 록시 PAAm 중합을 방지 용액 내 산소 농도를 감소시키기 위해 20 분 동안 진공 챔버에서.
  5. 무균 후드 하에서, 소독하기 위해 0.2 μm의 세공 크기 필터를 탈기 용액을 필터.
  6. 7 분 동안 UV / 오존 클리너 원형 유리 커버 슬립 (22mm 직경) 활성화.
  7. 10 % 황산 암모늄 (APS) 용액 100 μl를 준비, 즉 100 μL의 DDH 2 O.에서 10 mg의 APS입니다 그것은 새로운 APS 용액을 제조하는 것이 중요하다.
  8. 중합을 개시 테트라 메틸렌 디아민의 2.5 μL (TEMED) 및 살균 히드 록시 PAAm 솔루션 (단계 2.5)에 APS 솔루션의 25 μl를 추가합니다. 멸균 조건 하에서, 거품의 도입없이 3 연속 pipettings 의해 용액을 혼합한다.
  9. 멸균 후드, 22mm의 GL을 배치 즉시 (단계 1.9에서 가능) 및 25mm coverslip에의 히드 록시 PAAm 솔루션의 25 μL 강하를 배치방울의 상단에 엉덩이를 커버 슬립 (단계 2.5에서 준비)는 히드 록시 PAAm 솔루션을 짜내합니다. 멸균 핀셋 22mm 유리 커버 슬립을 중앙에 모든 거품을 부드럽게.
  10. 하이드 록시 PAAm 하이드로 겔은 실온에서 15 분 동안 중합하도록 허용합니다. 중합 공정의 완료를 수행하는 에펜 도르프 튜브에서 직접 잔여 하이드 록시 PAAm 용액을 전환.
  11. 완전히 멸균 DDH 2 O로 커버 슬립을 담그고 신중 22mm 유리 커버 슬립 및 하이드 록시 PAAm 하이드로 겔 층 사이에 면도날의 에지를 도입하여 22mm 유리 커버 슬립을 분리.
  12. 멸균 PBS로 히드 록시 PAAm 하이드로 겔을 씻으 (PBS의 3 교류)와 완벽하게 수분을 유지하기 위해 멸균 PBS에 열중 젤을 할 수 있습니다.
  13. 최대 3 일 동안 4 ° C에서 멸균 PBS에서 히드 록시 PAAm 하이드로 겔을 저장합니다.

3 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) Microstamp 제작

NOTE : 실리콘 마스터의 제조는 STA에 앞서 필요PDMS에게 microstamp 제조를 실온. 실리콘 마스터의이 마이크로는 전문 장비와 훈련이 필요 리소그래피 기술에 의해 수행 할 수 있습니다. 나노 제조 시설과 협력은 실리콘 마스터를 제작하는 것이 좋습니다. 또한, 필요에 따라 맞춤형 미세 실리콘 마스터를 제조하고 회사에 문의하십시오. 이것은 실리콘 마스터의 제조에만 필요 한번 수행되어야한다는 것이 중요하다. 실제로, 미세 실리콘 주인은 탄성 중합체 스탬프를 생성하기 위해 무기한 사용할 수 있습니다.

  1. 믹스 및 PDMS (10) 경화제 : 플라스틱 비커 1 비율 10 분간 피펫을 사용하여 충분히 혼합한다.
  2. 3.1 공정 중에 형성된 기포를 제거하기 위해 진공 하에서 PDMS 혼합물을 탈기.
  3. 페트리 접시에서 미세 실리콘 마스터를 놓고 거품을 형성하지 않고 그 위에 가스가 제거 된 PDMS 혼합물의 10-mm 두께의 층을 캐스팅.
  4. 60 ° C에서 2 시간 동안 PDMS를 치료하자오븐.
  5. 메스와 먼지가없는 환경에서, 필 오프 PDMS 층과 소비세 1cm 2 microstamps.
  6. 집게를 사용하여, 장소 PDMS는 페트리 접시에 패턴 업을 microstamps.

(4) 미세 히드 록시 PAAm 히드로 겔

  1. 15 분 동안 에탄올 / 물에 장소 PDMS의 microstamps (50 분의 50) 솔루션 및 초음파 처리.
  2. 질소 기류의 흐름과 함께 우표를 건조하고 그들에게 7 분의 UV / 오존 청소기 (λ <200 nm의)의 패턴 업을 배치합니다.
  3. 멸균 후드에서 1 cm 2 PDMS 스탬프의 미세 표면에 원하는 단백질 용액 (예를 들어, 100 μg / ml의 라미닌 PBS 또는 25 μg / ml의 피브로넥틴 PBS에서)의 150 ㎕의 드롭을 배치합니다.
  4. 선택적 : 세포 리간드 밀도를 변조하는 단백질 용액의 농도를 수정한다.
  5. 각각의 모서리를 향해 멸균 피펫 팁으로 이동하여 도장면에 걸쳐 단백질 용액 확산스탬프입니다.
  6. 멸균 후드 아래에 60 분 동안 PDMS 스탬프에 흡착 단백질 용액을 둡니다. 단백질 손상을 방지하기 위해 램프를 끄고.
  7. 멸균 후드, 페트리 접시에 (단계 2.13에서 구입 가능) 히드 록시 PAAm 코팅 된 커버를 전송할 수 있습니다.
  8. 멸균 조건 하에서 낮은 질소 스트림과 하이드 록시 PAAm 기판의 표면으로부터 과량의 PBS를 제거한다. 즉시 겔 표면에 물을 서의 증거가 관찰되지로 절차를 중지. 겔이 단계에서 충분히 건조되어서는 안된다.
  9. 드라이 신중 PDMS의 구조화 된 표면은 고순도 질소 가스의 정상류와 스탬프.
  10. 드레싱 조직 겸자와 단백질 코팅 된 스탬프를 잡고 건조 된 하이드로 겔 표면과 접촉 구조화 된 표면을 배치합니다. 스탬프 마이크로 피처 및 하이드로 겔 표면 사이의 양호한 접촉을 보장하기 위해 PDMS 스탬프의 위에 핀셋의 끝 간단한 압력 점을 적용한다.
  11. 일에 PDMS 스탬프를 남겨실온에서 1 시간 동안 전자 하이드로 겔 표면.
  12. 부드럽게 드레싱 티슈 포셉 히드 록시 PAAm 하이드로 겔에서 PDMS 스탬프를 제거하고 스탬프를 청소하는 단계 4.1을 따릅니다.
  13. 환율 당 10 분 동안 멸균 조건에서 PBS의 3 교류 (산도 = 7.4)에 의해 광범위하게 각인 히드 록시 PAAm 하이드로 겔을 씻으십시오.
  14. 선택적 : 다른 ECM 단백질의 추가의 미세 패턴은 단계 4.5에서 4.11에 따라 하이드 록시 PAAm 표면에 첨가 될 수있다.
  15. 흔들 접시에 부드러운 교반하면서 4 ° C에서 하룻밤 동안 PBS에서 5 ㎎ / ㎖에서 BSA의 무균 용액으로 보호막을 비 인쇄 영역.
  16. 환율 당 10 분 동안 멸균 조건에서 PBS의 3 교류 (산도 = 7.4)에 의해 광범위하게 씻으십시오. 이 단계에서, 스탬프 히드 록시 PAAm 하이드로 겔은 일주까지 4 ° C에 저장할 수 있습니다.

미세 패턴 히드 록시 PAAm 히드로 겔에 5 셀 증착

  1. 이전 도금 C에 30 ~ 45 분 동안 셀 미디어에 커버 슬립을 품어ELL 학생.
  2. 37 ° C에서 멸균 PBS와 75cm 두 문화 플라스크에서 배양 부착 세포를 세척하고 10 분 동안 3 트립신-EDTA의 ML 또는 accutase로 분리.
  3. g 떨어져있는 세포를 포함하는 플라스크로 세포주를 위해 미리 예열 완전 성장 배지에 적절한 원하는 금액을 전송 및 X 650에서 3 분 동안 세포 현탁액을 원심 분리.
  4. 마이크로 피펫으로 상층 액을 제거하고 15,000-20,000 세포 / ml에서 완전 배지에서 세포를 재현 탁.
  5. 1 ~ 2 시간 동안 습도를 (단계 5.1에서 얻은) 미세 패턴 커버 슬립에 셀 솔루션의 4 ML을 추가하고 배치 셀 덮인 커버 슬립을 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 5 %.
  6. 대기음 부드럽게 부착되지 않은 세포와 문화 매체를 교체합니다. 인큐베이터에 부착 된 세포를 반환하고가 (세포 유형에 따라 3-6 시간) 완전히 전파 할 수 있습니다.

결과

도 1a와 아크릴 아미드의 공중합 (AAM) 및 비스 아크릴 아미드 (비스 AAM)를 제시 N-hydroxyethylacrylamide 임베디드 히드록시기로 임의 라디칼 중합에 의해 폴리 아크릴 아미드의 친수성 네트워크를 형성 일차 수산기를 함유하는 (HEA) 모노머 (히드 록시 PAAm) . 이 프로토콜에서, HEA의 중량 65 ㎎을 HEPES 1 ㎖의 부피로 희석해야한다. HEA의 밀도가 한 대략 같다는 것을 알고, 우리는 우리가 1065 μL (HEA...

토론

현대 세포 생물학 체외 관측 많은 종종 ECM 단백질 또는 RGD 서열을 함유하는 합성 펩티드의 얇은 층으로 코팅 된 경질 유리 커버 슬립 상에 수행되었다. 그러나, 이러한 기본 배양 기질 세포 mechanotransduction의 프로세스 연구를위한 정확한 모델을 제공하지 않는, 따라서 ECM의 전체 물리 복잡도 요점을 되풀이하지 않는다. 이 문제를 해결하기 위해, 우리는 원하는 금액과 ECM 단백질의 자?...

공개

No conflicts of interest declared.

감사의 말

This work was supported by the Belgian National Foundation for Scientific Research (F.R.S.-FNRS) through “MIS Confocal Microscopy”, “Crédit aux Chercheurs” grants and the “Nanomotility FRFC project” (no. 2.4622.11). T.G. doctoral fellowship is supported by the Foundation for Training in Industrial and Agricultural Research (FRIA). The authors gratefully acknowledge Sylvain Desprez for mechanical characterization and Géraldine Circelli for confocal imaging.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
UV/Ozone PhotoreactorUltra-Violet ProductsModel PR-100
Rocking plateIKAcWerkeModel KS 130 Basic
VortexerScientific IndustriesModel Vortex Genie2
Vacuum degassing chamberApplied Vacuum EngineeringDP- 8-KIT
ParafilmSigma-AldrichP7793-1EA
Stainless steel forceps with fine tipSigma-AldrichZ225304-1EA
Dressing tissue forcepsSigma-AldrichF4392-1EA
Petri dishes in polystyreneSigma-AldrichP5731-500EA
Aluminium foil, thickness 0.5 mmSigma-Aldrich266574-3.4G
Isopore membrane filter (0.2 µm pore size)MilliporeGTTP Filter code
Round glass coverslip (22 mm diameter)NeuvitroGG-22
Round glass coverslip (25 mm diameter)NeuvitroGG-25
Variable volume micropipetteSigma-AldrichZ114820
Protein microcentrifuge tubesSigma-AldrichZ666505-100EA
Scalpel handlesSigma-AldrichS2896-1EA
Scalpel bladesSigma-AldrichS2771-100EA
Cell culture flasks (75 cm2)Sigma-AldrichCLS430641
Ultrasonic bath tray, solid (stainless steel)Sigma-AldrichZ613983-1EA
Polydimethylsiloxane Dow CorningSylgard 184 silicone elastomer kit
Acrylamide (powder)Sigma-AldrichA3553
N,N’-Methylenebis(acrylamide)Sigma-Aldrich146072
N-HydroxyethylacrylamideSigma-Aldrich697931
N,N,N’,N’-TetramethylethylenediamineSigma-AldrichT9281
Amonium PerSulfate (APS)Sigma-AldrichA3678
3-(Trimetoxysilyl)propyle acrylateSigma-Aldrich1805
Human Plasma FibronectinMilliporeFC010
Laminin from EHSSigma-AldrichL2020
Sodium hydroxydeSigma-Aldrich221465-25G
Double-distilled water (ddH2O)
Endothelial cell growth mediumCells Applications211K-500
Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)InvitrogenC-003-5C
AccutasePAA laboratoriesL11-007
HEPES buffer solution 1 M in H2OSigma-Aldrich83264-500ML-F
Antibiotics-antimycoticsPAA laboratoriesP11-002
Phosphate Buffer Saline solutionPAA laboratoriesH15-002
Alexa Fluor 488 PhaloidinMolecular ProbesA12379
Anti-vinculin antibody produced in mouseSigma-AldrichV9131
Goat anti-mouse antibody-tetramethylrhodamineMolecular ProbesT-2762
Anti-Fibronectin (rabbit)Sigma-AldrichF3648
Streptavidin Sigma-Aldrich41469
Anti-Laminin antibody (rabbit)Sigma-AldrichL9393
Anti-rabbit IgG-FITCSigma-AldrichF7512
Trypsin-EDTA solutionSigma-AldrichT3924-100ML
Absolute ethanolSigma-Aldrich459844-2.5L

참고문헌

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