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Erratum Notice

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요약

동적 길이 이미징 및 기자 형질 전환 생쥐의 신경 종말의 선택적 레이저 병변에 대한 프로토콜은 제공됩니다.

초록

피부, 신경과 같은 신경 병증 성 통증은이 같은 일을 센싱뿐만 아니라 병리 생리적 과정의 프로세스에 관여된다. 그들의 근접에 표면의 위치는 그대로 동​​물을 생활에서 피부 신경 말단의 미세한 영상을 용이하게한다. 다 광자 현미경을 사용하면, 피부 조직의 강한 광 산란 문제를 극복 미세 영상을 얻을 수있다. (주변 감각 신경 포함) 뉴런 네-1 프로모터의 조절하에 EYFP을 표현 기자 형질 전환 마우스는 최대 몇 개월 또는 평생 오랜 기간 동안 개별 신경 종말의 종 연구에 적합하다. 또한, 촬상 용으로 동일한 펨토초 레이저를 이용하여, 이는 신경 섬유의 재구성 연구에 신경 섬유의 매우 선택적 병변을 제조 할 수있다. 여기서, 우리는 생체 내에서 촬상 종 다 광자위한 간단하고 신뢰성있는 프로토콜을 제시마우스 피부의 신경 말단에 레이저 기반 미세.

서문

피부 신경 말단 다른 병태 생리 학적 상태에 따라 동적 인 변화를 겪는다. 신경 섬유는 말초 신경 병증이 모톤 신경종 또는 3과 같은 질병의 과정에서 변성 및 재생 또는 재구성의 프로세스를 수행 할 수있다. 외상 후 피부의 신경 말단 역학의 중요한 부분은 손상된 영역의 reinnervation이다. 그러나, 신경 종말의 조사를위한 일반적인 방법은 진행중인 프로세스 4에 실시간 정보를 결여 생체의 조직 학적 절편이다. 유 전적으로 인코딩 된 형광 마커를 사용하여, 따라서 구조적 변화에 훨씬 더 풍부하고 관련 정보를 획득하는, 살아있는 동물의 피부에있는 신경 말단을 추적 할 수있다. 피부 신경 종말의 조사는 종래의 형광 현미경이 있지만, 피부 조직의 강한 광산란 강하게 품질을 저해하여 가능하다데이터 5를 인수했다. 다 광자 현미경에 의한 유일한 목적의 초점으로부터의 형광 발광을 초래 여기 광의 광자의 에너지의 비 - 선형 합에 강하게 산란 조직의 고해상도의 영상을 획득하는 것을 허용한다. 이 효과는 피부 조직 (6)에서의 측정 결과에 대한 강력한 침투 깊이의 증가와 신호 대 잡음 비의 향상을 이끈다. 이미징을위한 동일한 레이저를 사용하면, 신경 섬유 (7)의 선택적인 박리를 제조 할 수있다. 다음의 프로토콜에서는 선택적 레이저 병변 시판 다 광자 현미경 시스템을 사용하여 결합 된 리포터 유전자 변형 마우스에서 생체 내 피부 신경 종말의 길이의 촬상 방법을 보여준다.

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프로토콜

동물 과목을 포함하는 절차는 국립 동물 실험위원회, 핀란드에 의해 승인되었습니다.

이미징을위한 1 동물 준비

  1. intraperitional 케타민 (IP) 주입 (체중 당 0.08 mg)의과 자일 라진 (체중 당 0.01 ㎎)을하여 마우스를 마취. 후면 발가락 핀치 반사와 마취를 확인합니다.
  2. 눈 탈수으로부터 눈을 보호하기 위해 (Viscotears를) 삭제에 동물의 눈을 담근다.
  3. 저체온증을 방지하기 위해 37 ° C에서 가열 패드 (SUPERTECH)에 마우스를 넣습니다.
  4. 70 % 에탄올로 영상에 대해 지정된 발 패드를 청소합니다.
  5. 피부와 커버 글라스 사이에 침지 커플 링 풋 패드의 피부에 물 방울을 추가한다.
  6. 커버 클래스와 금속 링 아래 위치되는 뒷발 하에서 플라스틱 포장재를 넣어.
  7. 피부를 평탄화 플라스틱 포장 재료의 두께를 조정한다.
  8. 커버 GLAS에 물 방울을 넣어커버 유리와 대물 사이 침지들.

2 금속 고정 장치 반지 준비

  1. 피부의 안정화 금속 고정 장치를 이용한다. 우리는 금속 링 (Neurotar (주), 핀란드의 제공) 커뮤니티 디자인 보호 두 날개 고정 장치를 사용합니다. , superglue과 주사기를 채우기 링에 바늘을 통해 superglue의 작은 방울을 넣어 조심스럽게 링 표면의 균일 한 커버리지 접착제를 확산. 접착제의 양이 과대 시야를 감소시키고 후속 이미징을 방해 할 수 있기 때문에, 단지 균일 따르면에 필요한 접착제의 최소량을 넣어 중요하다.
    NOTE : (아래에서)과 금속 바아 (커버)을 표준 현미경 유리 슬라이드의 선택적 조합은 피부를 평평하게하고 적절한 어셈블리 (14)의 광 결합을 보장하기 위해 사용될 수있다. 두 종이 클립 유리 및 금속 바아 표면 사이의 발을 고정하는 데 사용될 수있다 (도 4 ).
  2. 현미경 커버 슬라이드 (5mm 직경, 전자 현미경 과학)와 함께 반지를 커버.
  3. 전동 현미경 무대에 montaged되는 단단한 금속 막대에 링 고정 장치에 나사.

3 이미징 절차

  1. thy1-YFP-H 마우스를 이용하는 경우, 신경 섬유를 시각화하는 형광 램프 스펙트럼의 청색 부분을 선택한다. 표면 형광 모드에 대한 관심의 신경을 찾아 초점을 맞 춥니 다.
  2. 길이 이미징을위한 장소의 좌표를 기록합니다. 기준점으로 손목 패드를 사용한다. 다음 촬상 세션 중에 제 손목 패드를 감지하고 동일한 상류 큰 신경 섬유를 찾아 저장된 좌표를 사용 돌아가서. 그것은 참조 동일한 시스템을 유지하는 금속 바아에 직교하는 동일 방향으로 다리 패드를 배치하는 것이 필수적이다.
  3. 두 광자 모드를 켭니다. thy1-YFP-H 마우스의 경우, 레이저 방사의 950 nm 파장을 사용하는 것이 적합신경 섬유를 시각화합니다.
  4. (450부터 520에서 YFP 표지 된 신경의 촬상 550 ㎚에 대한 580에서 YFP 형광 및 모발의 자기 형광의 검출을 위해 630 ㎚에 제 고조파 발생 검출을위한 480 nm의, 행) 선택 레이저 파장 및 배출 채널, 시작 표백 광 손상을 방지하기 위해 낮은 레이저 파워 (~ 5 %). 광전자 증 배관 튜브의 전형적인 전압은 이미징 이런 종류의 600-700 V이다.
  5. (1-10 원하는 해상도 (512 X 512 또는 빨리 이벤트 측정 640 × 640, × 800 또는 형태학 이미징 1024 1024 X 800), 축 방향의 공정 (1-3 μM), 시료의 두께와 시간 간격을 설정할 분). 노출 시간은 하나의 화소 당 1 밀리 초 정도이다.
  6. 먼저 소프트웨어 촬상 공간의 상부 및 하부 경계를 표시한다.
  7. 병변 전에 참조 용 참조 화상 스택을 획득. 필요하면, 수 분 동안 기준을 기록 할 수있다.
    8. 반복 (적어도 매일 10 ~ 15 분) 동물의 호흡 속도와 반사 신경을 확인 마취제의 추가 금액을 적용합니다.
  8. 티슈로 패드를 깨끗한 영상과 완전히 깨어 때까지 36 ° C에서 복구 상자에 마우스를 넣어 후.
    참고 : 일반적으로, 레이저 유도 병변과 함께 한 영상 세션의 지속 시간 (아래 참조) 1 시간을 초과하지 않는다. 우리는 동물이 깊이마다 10 ~ 15 분 마취되어 있는지 확인하는 것이 좋습니다; 이 자체 이미징을 방해하지 않아야하지만, 실험 절차가 계획되는 동안 고려되어야한다. 단일 케타민​​ / xylazyne 투여의 효과의 지속 시간은 따라서 우리가 25 ~ 30 분 후 복용량을 1/2 ¼ 추가로 적용하는 것이 좋습니다, 40 분에 30이다.
    NOTE : 실험은 각각의 동물에 대한 촬상 세션 주파수 재사용의 악영향을 방지하기 위해 하나의 세션 당 2 일을 초과하지 않도록 계획 될 때뿐만 아니라 고려되어야petitive 마취.

(4) 레이저 병변

  1. 참조 화상 스택을 획득 한 후, 마이크로 병변을 만드는 표백 프로토콜을 사용한다.
  2. 100 %로 레이저 파워를 높입니다.
  3. 이자 (100-1,000x 표준 이미징 가지 경우에 비해 이상)의 지역 당 100 ~ 1000 밀리 초에 노출 시간을 늘립니다.
  4. 병변의 영역을 설명합니다.
  5. 표백에 전환하여 병변을 확인합니다.
  6. 으로 보통의 영상 모드로 전환하고 시간 경과 녹화를 계속합니다.

(5) 데이터 처리 및 분석

  1. ImageJ에 8 스펙트럼 Unmixing 플러그인을 사용하여 unmixing와 (요아킴 월터 진행 http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/spectral-unmixing.html을 ).
  2. 이미지 스택을 열고 채널을 분할합니다.
  3. 배경 측정을위한 신경 또는 머리카락이없는 지역을 찾아보십시오. 지역 O를 넣어그 지역에서 F 관심.
  4. 신중하게 신경 분명히 구별 될 모발의 부분 윤곽.
  5. 이 머리 별개 이미지 부분에서 신경 개요.
  6. 행렬을 unmixing 저장합니다.
  7. 전체 스택에 대한 측정 unmixing 행렬을 적용합니다.
  8. *의이 .tif 형식의 새로운 이미지 처리 스택을 저장합니다.

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결과

그것이 가능 기재된 기술을 사용하여 병변 후 동일한 광섬유를 추적하고 손상된 신경 종말 (도 1)의 분해를 연구. 120-150 μm의 두께의 적층 체의 취득은 시야에 전체의 섬유를 유지하기 위해 수 일 동안 반복 이미징 대개 적절하다.

플라스틱 포장재가 피부를 평평하게 조정되면 병변은 일반적으로 간결하게 제조 될 수 있으므로, 콜라겐 층에 균일 한 강도의 화상

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토론

이 동영상 프로토콜에서는 단일 신경 말단의 비 침습적 종 이광자 촬상 방법을 보여준다.

피부 신경 밀도의 역학 건선 및 말초 신경 병증이, 등의 질환과 외상 구에 영향을받습니다. 두 광자 이미징은 콜라겐 매트릭스에있는 신경 섬유 구조의 상세한 분석을 할 수 있습니다. 리포터 유전자 변형 마우스의 사용은 신경 섬유의 염색에 관한 문제를 방지하는 데 ?...

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공개

저자는 그들이 더 경쟁 금전적 이해 관계가 없다고 선언합니다.

감사의 말

저자는 재정 지원에 대한 기술 지원, CIMO 재단과 FGSN에 대한 Neurotar (주)에게 감사의 말씀을 전합니다.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Round cover glass Electron Microscopy Science72296-055 mm diameter #1.5 thickness
Eye drops ViscotearsNovartis2 mg/g
Superglue Loctite 401Henkel135429
KetaminolIntervetKetamine 50 mg/ml, working solution 10 mg/ml (use it 80 µg per gram of animal weight)
RompunBayer HealthcareXylazine 20 mg/ml, working solution 1.25 mg/ml (use it 10 µg per gram of animal weight)
Ethanol 70%
Distilled water or Milli-Q water
Syringes 1 mlBD300013
30 G 1/2" needlesBD304000
Plastic packaging materialCould be purchased from general hardware store
FV-1000MPE microscopeOlympusFV-1000MPEMicroscope with motorized stage and rigid metal bar for fixation
25X XLPlan objectiveOlympusXLPLN 25XWMPWater immersion objective optimized for multiphoton imaging
Mai-Tai DeepSee laser (2 W)SpectraPhysics
Heating padSupertechTMP-5bHeating pad with a temperature controller
Metal ring fixatorNeurotar Ltd.
ImageJNIHOpen source software for image processing and analysis, http://rsbweb.nih.gov/ij/ 
Thy1-YFPH mice strainJaxLab003782

참고문헌

  1. Lumpkin, E. A., Caterina, M. J. Mechanisms of sensory transduction in the skin. Nature. 445, 858-865 (2007).
  2. Kennedy, W. R., Wendelschafer-Crabb, G., Johnson, T. Quantitation of epidermal nerves in diabetic neuropathy. Neurology. 47, 1042-1048 (1996).
  3. Wu, K. K. Morton's interdigital neuroma: a clinical review of its etiology, treatment, and results. J. Foot Ankle Surg. 35, 112-119 (1996).
  4. Lauria, G., Lombardi, R. Skin biopsy: a new tool for diagnosing peripheral neuropathy. BMJ. 334, 1159-1162 (2007).
  5. Cheng, C., Guo, G. F., Martinez, J. A., Singh, V., Zochodne, D. W. Dynamic plasticity of axons within a cutaneous milieu. J. Neurosci. 30, 14735-14744 (2010).
  6. Wang, B., Zinselmeyer, B. H., McDole, J. R., Gieselman, P. A., Miller, M. J. Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo. J Vis Exp. (46), e2062(2010).
  7. Sacconi, L., O'Connor, R. P., Jasaitis, A., Masi, A., Buffelli, M., Pavone, F. S. In vivo multiphoton nanosurgery of cortical neurons. J Biomed Opt. 12, 050502(2007).
  8. Rasband, W.S., ImageJ. , US National Institutes of Health. Bethesda, Maryland, USA. Available from: http://rsb.info.nih.gov/ij (1997).
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  10. Feng, G., Mellor, R. H., Bernstein, M., Keller-Peck, C., Nguyen, Q. T., Wallace, M., Nerbonne, J. M., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
  11. Marinkovic, P., Reuter, M. S., Brill, M. S., Godinho, L., Kerschensteiner, M., Misgeld, T. Axonal transport deficits and degeneration can evolve independently in mouse models of amyotrophic lateral sclerosis. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 109, 4296-4301 (2012).
  12. Amit, S., Yaron, A. Novel systems for in vivo monitoring and microenvironmental investigations of diabetic neuropathy in a murine model. J Neural Transm. 119, 1317-1325 (2012).
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  14. Yuryev, M., Khiroug, L. Dynamic longitudinal investigation of individual nerve endings in the skin of anesthetized mice using in vivo two-photon microscopy. J Biomed Opt. 17, 046007(2012).

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Erratum


Formal Correction: Erratum: In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin
Posted by JoVE Editors on 9/01/2014. Citeable Link.

A correction was made to In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin.

Leonard Khiroug was removed as an author.

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