JoVE Logo
저자
연락처

로그인

JoVE 비디오를 활용하시려면 도서관을 통한 기관 구독이 필요합니다. 전체 비디오를 보시려면 로그인하거나 무료 트라이얼을 시작하세요.

기사 소개

  • 요약
  • 초록
  • 서문
  • 프로토콜
  • 결과
  • 토론
  • 공개
  • 감사의 말
  • 자료
  • 참고문헌
  • 재인쇄 및 허가

요약

고해상도 용융 분석 (르마)와 함께 PCR은 제브라 피쉬의 유전자형에 신속하고 효율적인 방법으로 보여줍니다.

초록

제브라 피쉬는, 개발을 공부하는 질병을 모델링하고, 약물 검사를 수행하기위한 강력한 척추 동물 모델 시스템입니다. 최근 유전 도구의 다양한 돌연변이를 유도하고 유전자 변형 라인을 생성하기위한 여러 전략을 포함하여, 도입되었습니다. 그러나, 대규모 스크리닝은 시간 소모적이고 노동 집약적이다 전통적인 유전자형 방법에 의해 제한된다. 여기에서 우리는 고해상도 융점 분석 (르마)와 결합 PCR 기준 지브라 피쉬 유전자형을 분석하는 기술을 설명한다. 이 방법은 오염 유물의 낮은 위험과 함께, 빠른 민감하고 저렴합니다. 르마와 PCR에 의한 유전자형 높은 처리량 검사 프로토콜에 포함, 배아 또는 성인 물고기에 사용할 수 있습니다.

서문

제브라 피쉬 (다니오 rerio)는 널리 개발 및 질병 모델링 연구에 사용되는 척추 동물 모델 시스템입니다. 최근 다수의 형질 전환 및 돌연변이 기술은 제브라 피쉬 위해 개발되었습니다. 일반적 Tol2 트랜스포존 시스템 (1)에 기초하여 피드 형질 전환 기술은, 다 DNA 단편 조립체이 향상된 복제 옵션과 결합되었다. 아연 핑거 뉴 클레아 제 (ZFNs) 및 전사 활성제와 같은 이펙터 클레아 제 (TALENs)는 제브라 피쉬 3,4 모두 체세포와 생식 세포의 유전자 좌를 대상으로 사용되어왔다. 이 기술은 효율적으로 고주파 돌연변이 생성 및 세균 선 전송 3,4로, 유전자 변형 동물을 생성 할 수 있습니다.

이러한 발전에도 불구하고, 제브라 피쉬의 전통 유전자형 기술은 돌연변이 유발 및 형질 전환 도구의 모든 기능을 제한합니다. PCR은 때때로 restrictio 결합, 전기 영동 한 다음N 효소 소화가 널리 유전체 변형을 검출하기 위해 사용되지만, 시간 소모 및 작은 삽입 또는 삭제를 식별에 덜 민감하다. 의 TaqMan 프로브 분석은 높은 초기 비용을 가지고주의 최적화를 필요로합니다. PCR 제품의 시퀀싱은 며칠이 걸릴 대규모 검열을위한 실용적되지 않습니다 수 있습니다. 제한 단편 길이 다형성 (RFLP) 분석에만 제한 효소 인식 부위의 제한된 범위에 영향을주지의 SNP를 구별 할 수있다.

고해상도 녹는 분석 (르마), 폐 튜브 후 PCR 분석 방법은, 빠른 민감한, 저렴하고, 다수의 샘플을 심사하는 의무가 최근에 개발 된 방법이다. 르마는 SNP를, 돌연변이, 및 5-7 전이 유전자를 검출하는데 사용될 수있다. 르마는 이중 가닥의 DNA의 열 변성을 기준으로, 각각의 PCR 증폭 물이 특징 독특한 해리 (용융) 5을 가지고 있습니다. 샘플로 인해 T를 구별 할 수 있습니다O 서로 다른 염기 조성, GC 함량, 또는 길이는 일반적으로 형광 염료와 함께 만 이중 가닥 DNA (8)를 결합하는. 따라서, 르마는 다른 용융 곡선의 특성에 따라 서로 다른 유전자형을 구별 할 수 있습니다. 르마 저가의 시약을 사용하여 단일 단계 후 PCR 과정이므로, 높은 처리 전략을 위해 사용될 수있다. 르마 그래서 분석 다음 PCR 증폭 산물이 다른 애플리케이션에 사용될 수 있고, 비파괴이다. 르마 세포주, 마우스 및 인간 9-11 포함하여 많은 유기체 및 시스템에 적용되어왔다. 그것의 사용은 최근 징크 핑거 클레아 (ZFNs) 및 TALENs 6,12,13 의해 유도 돌연변이를 검출하기 위해 제브라 피쉬 설명되었다.

이 논문에서, 우리는 (그림 1) 배아와 성인 제브라 피쉬의 PCR 기반 르마을 수행하는 방법에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은시를 포함하여, SNP를, 도입 유전자, 돌연변이를 검출하기에 적합하다ngle 기본 쌍 변경, 삽입, 또는 삭제.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

프로토콜

1. DNA 준비

  1. 50 mM의 KCl을 10 mM 트리스 - 염산 pH를 8.3, 0.3 % 트윈 20, 0.3 % NP40 : DNA의 용해 버퍼를 준비한다. 사용 12 일에 1 ㎎ / ㎖의 최종 농도로 신선한 테 K 추가.
  2. 조직 컬렉션 :
    1. 성인 물고기 지느러미 클립 :
      1. 물고기를 마취 : 0.004 % MS-222 (tricaine) 솔루션의 물고기를 놓습니다. 아가미의 움직임이 둔화 될 때까지 기다립니다.
      2. 5-10 킴 와이프의 스택에 물고기를 넣고 멸균 면도날와 꼬리 지느러미, 2 ~ 3 mm의 작은 조각을 잘라.
      3. 신속하게 복구를 위해 신선한 물을 표시 탱크에 물고기를 배치, 조심스럽게 핀 클립을 포함 할 탱크와 해당 관을 모두 레이블을 붙입니다. 물을 변경하고 매일 물고기를 먹이.
      4. 멸균 피펫 팁과 핀 클립을 선택하고 100 ㎕의 DNA 용해 버퍼로 채워진 튜브로 전송할 수 있습니다.
      5. 피펫 팁을 폐기하고, 날카로운 물건 용기에 면도날을 버린다.
    2. 배아의 꼬리 클립 :
      1. 0.004 % MS-222 (tricaine) 솔루션으로 배아를 놓습니다. 2 분을 기다립니다.
      2. 해부 현미경 집게로 꼬리의 조각을 잘라.
      3. 30 μL의 DNA 용해 버퍼 가득 레이블 튜브에 꼬리를 넣습니다.
      4. 신속하게 100 ㎕의 4 % 파라 포름 알데히드를 포함하는 튜브에 배아를 넣어.
      5. 배아 및 해당 꼬리 튜브 라벨 튜브.
      6. 고정 용 4 ° C에서 하룻밤에 배아와 튜브를 저장합니다.
      7. 오염을 최소화하기 위해 각 배아 사이에 밀리 Q 물과 킴 와이프를 사용하여 집게를 청소합니다.
    3. 전체 배아의 경우 :
      1. 0.004 % MS-222 (tricaine) 솔루션으로 배아를 놓습니다. 2 분을 기다립니다.
      2. 100 ㎕의 DNA 용해 버퍼로 채워진 튜브에 1-5 배아를 넣어. Dechorionation 필요가 없습니다.
  3. DNA 소화
    55 ° C에서 조직 (지느러미 또는 꼬리 클립 또는 태아)와 튜브를 품어밤새 12 4 시간 최대를위한.
  4. 테 K에게 비활성화
    15 분 12 ~ 95 ° C의 열 관. DNA는 바로 PCR에 사용, 또는 최대 3 개월 동안 -20 ° C에서 보관해야합니다.

2. PCR

  1. 디자인 프라이머 수동 또는 프라이머 설계 소프트웨어 (예 : Lightscanner 뇌관 디자인 소프트웨어 Biofire)에 의해. 르마위한 PCR 제품은 일반적으로 50-200 염기쌍이며 SNP 검출을위한 PCR 제품은 작고, 50-80 염기쌍이어야한다.
  2. PCR
    1. 96도 또는 384 - 웰 플레이트에서 PCR 반응을 수행합니다.
    2. 10 ㎕의 전체 볼륨을 사용하여 4 μL의 LightScanner 마스터 믹스 (0.1 U 핫 시작의 Taq-AB 중합 효소, 버퍼, 0.2 밀리미터의 dNTPs, 2 mM의 염화 마그네슘 및 1X 형광 이중 가닥 DNA 결합 염료), 5 pmol의 각 프라이머, 성인 꼬리 지느러미 또는 배아의 꼬리 (13)로부터 3 ㎕의 게놈 DNA 추출 1 ㎕의 게놈 DNA 템플릿.
    3. 30 ㎕의 미네랄 오일을 커버 샘플.
    4. 광학적으로 투명 접착 씰 플레이트를 커버.
    5. PCR 순환 상태 전형적인 조건은 95 ° C에서 5 분 10 초 30주기를 95 ° C이다 최적화, 60 ° C에서 25 초, 72 ° C에서 30 초, 30 초 동안 95 ° C로 끝나는로 냉각 15 ° C.
    6. 스토어 PCR의 4 ° C에서 접시 또는 르마로 직접 진행합니다.
    7. PCR의 초기 최적화 동안 아가 로스 겔 전기 영동을 사용하여 크기를 분석하여 우리의 PCR 생성물을 확인하고, 상기 PCR 생성물의 서열 분석에 의해, 표시하는 경우.

3. 르마

  1. 열 플레이트
    1. 용융 분석 시스템에서 접시를 놓습니다.
    2. (LightScanner 소프트웨어는 전화-IT 2.0) 소프트웨어를 엽니 다.
    3. 60 ~ 95 ° C.의 열 플레이트
    4. 새 데이터 저장소 파일을 만듭니다.
  2. 르마 데이터를 분석 (그림 2).
    분석의 여러 단계가 가능합니다. 우리는 데이터 m의 가장 일반적으로 사용되는 세트를 보여anipulations.
    1. 부분적인 설정
      부분의 탭을 클릭합니다. 샘플 우물을 선택합니다.
    2. 표준화
      1. 왼쪽 패널의 표준화 탭을 선택합니다. 형광 분산을 제거하려면 수동으로 사전 (초기)의 병렬 더블 라인을 배치하고 후 (최종) - 용융 영역 (그림 2C, 화살촉) 그림과 같이 1과 0으로 모든 샘플의 premelt 및 사후 용융 형광 신호를 정상화 각각 14.
      2. 용융 영역 전후 멜트 라인 사이의 영역에 있지만, 선택되지 않도록 라인의 위치를​​ 조정한다. 일반적으로, 낮은 최소 및 낮은 최대 (어퍼 최소 어퍼 최대) 온도 선이 떨어져 약 1 ° C를 배치해야합니다.
      3. 정상화 온도 위치를 선택 모든 샘플 (premelt 지역 및 최소 또는 후 용융 지역 없음 (0 %) 형광의 최대 또는 전체 (100 %)의 형광을 갖도록 POS 최선으로sible). 정규화는 융점과 0의 최소 형광의 융점부터 다음 수평에 가까운 라인까지 연장되어 하나의 형광 극대에서 거의 수평 라인 초래한다 상기 1 또는 0 아래 형광 수준이 없어야 . 예를 들어,도 2c에, 79-80 ° C.의 온도 범위를 사용 premelting 곡선을 정상화
    3. 그룹화 / 클러스터링
      녹는 온도 (그림 2C, 녹색 상자)을 기반으로 유전자형을 구분합니다. 그룹화를 선택합니다.
      1. 그룹화 섹션의 표준 선택 목록에서 Autogroup을 선택합니다.
      2. 그룹화 섹션에서 감도 선택 목록에서 각각 하나의 전환 또는 다수의 전환과 프로필을 용융 보통 또는 높음을 선택합니다.
      3. 선택 계산그룹화 섹션에서 그룹.
      4. 파일 메뉴로 이동하고 결과를 저장하려면 저장을 클릭합니다.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

결과

프로토콜 (작업의 흐름도는도 1에 도시 됨) 며칠 동안 하루 동안 수행 또는 단계로 분리 될 수있다. DNA 추출은 PCR 증폭 산물의 용해 및 분석을 따른다. 앰플 리콘의 용융의 온도는 크기와 GC-내용에 따라 다르지만 일반적으로 시작하고 50 ˚ C ~ 95 ˚ C의 최종 온도 (그림 2A와 2B)에 적합합니다. 용융물이 수행되면, 형광 용융 곡선의 분석은 일반적으로 사용 전후의 용융 영역을 ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

토론

르마와 함께 PCR은 제브라 피쉬의 유전자형을위한 강력한 기술입니다. 이 방법의 장점은 그것의 속도, 신뢰성, 및 심지어 점 돌연변이를 검출 감도이다. 전체 프로토콜은, 지느러미 클립에 용융 곡선 분석에서, 한 개인에 의해 8 시간 이내에서 수행 할 수 있습니다. 또한, 기술은 높은 처리량 스크리닝 의무이다 티듐 브로마이드의 사용을 필요로하지 않으며, 오염 문제를 최소화 할 수있는 모든 PCR ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

공개

저자가 공개하는 게 없다.

감사의 말

우리는 조언과 기술 지원에 대한 Blaschke, Grunwald가, 그리고 비트 버 실험실의 구성원을 감사드립니다. 이 작품은 JLB에 PCMC 재단, NIH R01 MH092256와 DP2 MH100008, 그리고 천 재단 연구 보조금 # 1 - 2013 년 - 425 년 3 월에 의해 지원된다.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
100 Reaction LightScanner Master MixBioFireHRLS-ASY-0002www.biofiredx.com
Hard-Shell PCR 96-well BLK/WHT PlatesBio-Rad LaboratoriesHSP9665www.bio-rad.com
Microseal 'B' Adhesive SealsBio-Rad LaboratoriesMSB1001www.bio-rad.com
96-well LightScanner InstrumentBioFireLSCN-ASY-0040www.biofiredx.com
LightScanner Software with Call-IT 2.0BioFirewww.biofiredx.com
High-resolution Melting Analysis 2.0BioFirewww.biofiredx.com
LightScanner Primer Design SoftwareBioFirewww.biofiredx.com
Vector NTI SoftwareInvitrogenwww.invitrogen.com
Tricaine
Paraformaldehyde

참고문헌

  1. Kawakami, K., Takeda, H., Kawakami, N., Kobayashi, M., Matsuda, N., Mishina, M. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Dev. Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
  2. Kwan, K. M., Fujimoto, E., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Dev. Dyn. 236 (11), 3088-3099 (2007).
  3. Sander, J. D., Cade, L., et al. Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs. Nat. Biotechnol. 29 (8), 697-698 (2011).
  4. Huang, P., Xiao, A., Zhou, M., Zhu, Z., Lin, S., Zhang, B. Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs. Nat. Biotechnol. 29 (8), 699-700 (2011).
  5. Vossen, R. H. A. M., Aten, E., Roos, A., Den Dunnen, J. T. High-resolution melting analysis (HRMA): more than just sequence variant screening. Hum. Mutation. 30 (6), 860-866 (2009).
  6. Dahlem, T. J., Hoshijima, K., et al. Simple methods for generating and detecting locus-specific mutations induced with TALENs in the zebrafish genome. PLoS Genet. 8 (8), (2012).
  7. Liew, M., Pryor, R., et al. Genotyping of single-nucleotide polymorphisms by high-resolution melting of small amplicons. Clin. Chem. 50 (7), 1156-1164 (2004).
  8. Herrmann, M. G., Durtschi, J. D., Bromley, L. K., Wittwer, C. T., Voelkerding, K. V Amplicon DNA melting analysis for mutation scanning and genotyping: cross-platform comparison of instruments and dyes. Clin. Chem. 52 (3), 494-503 (2006).
  9. Carrillo, J., Martínez, P., et al. High resolution melting analysis for the identification of novel mutations in DKC1 and TERT genes in patients with dyskeratosis congenita. Blood Cell. Mol. Dis.. 49 (3-4), 140-146 (2012).
  10. Thomsen, N., Ali, R. G., Ahmed, J. N., Arkell, R. M. High resolution melt analysis (HRMA); a viable alternative to agarose gel electrophoresis for mouse genotyping. PloS one. 7 (9), (2012).
  11. Vorkas, P. A., Poumpouridou, N., Agelaki, S., Kroupis, C., Georgoulias, V., Lianidou, E. S. PIK3CA hotspot mutation scanning by a novel and highly sensitive high-resolution small amplicon melting analysis method. J. Mol. Diagn. 12 (5), 697-704 (2010).
  12. Parant, J. M., George, S. A., Pryor, R., Wittwer, C. T., Yost, H. J. A rapid and efficient method of genotyping zebrafish mutants. Dev. Dyn. 238 (12), 3168-3174 (2009).
  13. Xing, L., Hoshijima, K., et al. Zebrafish foxP2 zinc finger nuclease mutant has normal axon pathfinding. PloS one. 7 (8), (2012).
  14. Raghavendra, A., Siji, A., Sridhar, T. S., Phadke, K., Vasudevan, A. Evaluation of High Resolution Melting analysis as an alternate tool to screen for risk alleles associated with small kidneys in Indian newborns. BMC Nephrol. 12 (1), 60 (2011).
  15. Herrmann, M. G., Durtschi, J. D., Wittwer, C. T., Voelkerding, K. V Expanded instrument comparison of amplicon DNA melting analysis for mutation scanning and genotyping. Clin. Chem. 53 (8), 1544-1548 (2007).
  16. Wittwer, C. T. High-Resolution Genotyping by Amplicon Melting Analysis Using LCGreen. Clin. Chem. 49 (6), 853-860 (2003).
  17. Dimitrakopoulos, L., Vorkas, P. A., Georgoulias, V., Lianidou, E. S. A closed-tube methylation-sensitive high resolution melting assay (MS-HRMA) for the semi-quantitative determination of CST6 promoter methylation in clinical samples. BMC Cancer. 12, 486-48 (2012).
  18. Jeng, K., Gaydos, C. A., et al. Comparative analysis of two broad-range PCR assays for pathogen detection in positive-blood-culture bottles: PCR-high-resolution melting analysis versus PCR-mass spectrometry. J. Clin. Microbiol. 50 (10), 3287-3292 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

재인쇄 및 허가

JoVE'article의 텍스트 или 그림을 다시 사용하시려면 허가 살펴보기

허가 살펴보기

더 많은 기사 탐색

84PCR

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

개인 정보 보호

이용 약관

정책

연락처

사서에게 추천하기

JoVE 뉴스레터

연구

교육

저자

사서

JoVE 소개

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. 판권 소유