종 MRI에 이어 유방암 뇌 전이 마우스 모델을 개발하기 위해 초음파 영상 유도 심장 내 주입

요약

유방암 뇌 전이의 마우스 모델은 MDA-MB231/Br-GFP 세포의 초음파 영상 유도 심장 내 주입으로 설정됩니다. 다 초점 두개 내 전이의 개발은 고해상도 9.4 T MRI를 사용하여 세로 방향으로 모니터링하고있다.

초록

유방암 뇌 전이가 단계 IV에서 유방암 환자의 30 %에서 발생하는 높은 사망률과 연관된다. 중앙 생존 기간은 단지 6 개월입니다. 그것은 임상 시나리오에서 전이성 세포의 혈역학 적 확산을 모방하기 위해 적절한 동물 모델을 가지고하는 것이 중요합니다. 여기서, 우리는 흉선 누드 마우스의 좌심실로 뇌 열 유방암 세포의 정확한 주입을 안내하는 작은 동물 초음파 영상의 사용을 도입하고있다. 세로 MRI는 두개 개시 및 뇌 전이의 성장을 평가하는 데 사용됩니다. 초음파 유도 심장 내 주입은 정확한 주입 및 이에 높은 성공률뿐만 아니라 보장뿐만 아니라 우리의 이전의 수동 절차에 비해 크게 사망률 감소했다. 생체 고해상도 MRI는 한 작게, hyperintense 다발성 병변의 시각화 수 310 μm의 T에 직경 삼주 후 분사에 이미지를 ₂ - 가중. FOLLOW 업 MRI는 두개 내 종양의 성장과 뇌 전체에 걸쳐 배포 전이의 증가 수를 보여준다.

서문

뇌 전이는 성인에서 가장 흔한 두개 내 악성 종양이다. 예후도 적극적인 치료 4-6 개월의 평균 생존에 매우 좋지 않습니다. 유방암 뇌 전이 ^1-3의 높은 사망률을 가진 세 가지 주요 암 중 하나입니다. 여러 뇌 열대 유방암 라인은 심장 내 또는 intracarotid 주입 ⁴ 후 뇌 전이를 개발 할 수있다. 좌심실로 종양 세포의 직접적인 주입은 폐 모세 혈관 베드를 우회함으로써 내장 전이를 최소화하면서 두뇌 전이 형성의 발생을 증가시킬 수있다. MDA-MB231Br 라인은 설치류 모델 ^5,6에서 뇌 전이를 개발하기 위해 가장 널리 사용되는 인간 유방암 라인 중 하나이다.

다른 많은 연구 ^4,7와 마찬가지로, 우리는 우리의 이전 연구에서 심장 내 주입의 수동 절차를 수행했습니다. 그러나, 50 %의 성공 속도는 매뉴얼을 얻었다이전의 실험이 실패한 경우 주사와 마우스의 일부가 반복으로서 절차에서 사망했다. 여기서, 우리는 무 흉선 마우스의 좌심실로 뇌 추구 유방암 세포의 주입을 확보 촬상 유도 절차의 사용을 도입하고있다. 종 고해상도 MRI는 뇌 전이의 두개 내 개발을 따라 적용됩니다.

프로토콜

모든 동물의 절차는 텍사스 대학 남서 의료 센터의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.

1. MDA-MB231/Br-GFP 세포의 준비

1. 10 % FBS, 1 % 글루타민 및 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신을 함유하는 DMEM 배지 (친절의 Drs. 팔미 및 스티, NCI에 의해 제공) MDA-MB231/Br-GFP 셀을 검색하여 배양.
2. 세포와 매체의 색상의 상태를 관찰하고, 2-3 일마다 중간 교체합니다.
3. 를 Trypsinize 및 단계에 설명 된대로 80 %의 합류가 1.3.1-1.3.5에 도달하면 세포를 수집
   1. 완전히 오래된 매체를 제거하고 부드럽게 세포를 씻어 5 ㎖의 PBS (1X)를 추가합니다. 접시에서 PBS를 제거합니다.
   2. 접시에 1.5 ㎖의 트립신을 추가, 모든 세포는 트립신에 의해 보호됩니다 확인하기 위해 부드럽게 요리를 기울이십시오. 다시 세포 배양기에 접시를 넣고 1 분 동안 37 ° C에서 보관.
   3. 인큐베이터 밖으로 접시를 타고 관찰세포를 확인하기 위해 광학 현미경으로 세포를 접시에서 분리.
   4. 트립신의 효력을 정지 3 ㎖ 매체를 추가합니다. 원심 관에서 세포 혼합액을 모은다. 5 분 동안 2,000 rpm에서 혼합물을 원심 분리기.
   5. 신중하게 매체를 제거하고 균일 할 때까지 5 ㎖ 혈청 배지에서 세포를 재현 탁.
4. 세포의 적절한 수를 계산하고 100 μL 부피의 1.75 × ¹⁰⁵ 세포의 최종 농도로 무 혈청 DMEM 배지에이를 재현 탁.
   1. 50 ㎕의 세포 혼합물을 50 ㎕의 트리 판 블루를 추가합니다. 혼합 한 후, 10 ㎕의 혼합물을 조심스럽게 세포 계수 슬라이드에 추가 할 수 있습니다. 정확한 세포 수의 추정을 보장하기 위해 여러 개의 샘플을 사용합니다.
   2. 셀 카운팅 슬라이드, 한번에 하나의 단부와 셀 카운터 자동 카운트 시작의 막대기. 모든 계산 결과의 평균을 가지고 총 세포 수를 계산합니다.
   3. 다시 세포를 원심 분리기와 그들을 재현 탁볼륨 μL 1.75 ^× 105 cells/100의 최종 농도 초래할 무 혈청 배지의 적절한 볼륨.
5. 이전에 심장 내 주입에 얼음 장소 세포.

2. 초음파 이미징 안내 심장 내 주입

1. 이전 6-8주 사이 여성 누드 마우스 (BALB / C 뉴 / 뉴)를 사용합니다.
2. 영상 시스템에 로그인합니다. 트랜스 듀서 (704) (40 메가 헤르츠)를 초기화합니다.
3. 새로운 연구를 시작하고 정보를 입력합니다.
4. 마취 (유도 챔버에서 3 % isoflurane/100 %의 O _2)와 코 콘을 통해 모든 절차를 수행하는 동안 100 % O ₂ (1 DM ³ / 분)에 이소 플루 란 (2 %)와 동물을 유지한다. 금단 반사가 발가락 핀치 관찰되지 않은 경우 마취가 확인됩니다.
5. 37 ° C로 영상 테이블의 온도를 설정 앙와위에서 가열 된 영상 테이블에 마취 된 마우스를 테이프.
6. 메신저에 앞서 37 ° C에서 초음파 젤을 유지노화. 마우스의 가슴에 젤을 적용합니다.
7. 홀더에 트랜스 듀서를 장착합니다. 원하는 영상의 깊이에 도달 할 때까지 트랜스 듀서를 낮 춥니 다. 좌심실이 랜드 마크로서 상행 대동맥 (그림 1A)로 확인 될 때까지 단계를 이동합니다. 좌심실의 밝은 전망이 가시화되는 단계를 잠급니다.
8. 22 G 바늘로 1 ML의 주사기로 세포 혼합물의 100 μl를 그립니다. 놓고 마운트 주사기 주사기를 고정합니다.
9. 마우스의 가슴을 향해 앞으로 주사기를 이동하고 바늘 끝이 (마우스를 입력하기 전에)보기의 이미지 필드가 될 때까지 조심스럽게 좌우로 그것을 옆으로 이동합니다.
10. 좌심실을 목표로 바늘의 높이와 각도를 조절합니다.
11. 초음파 영상의지도하에 좌심실로 즉시 피부와 근육 층을 통해 인터 공간에 주사기 바늘을 침투.
    왼쪽 ventri에 바늘을 성공적으로 삽입 표시CLE는 주사기에 신선한 동맥혈 (진한 빨강 정맥혈 달리 핑크 색상)의 환류입니다
12. 세포 혼합물을 천천히 (그림 1B)를 주입한다.
13. 완료되면, 바늘을 철회 트랜스 듀서를 들어, 적신 거즈와 초음파 젤을 청소하고 테이프를 제거합니다.
14. 예열 패드 깨끗한 케이지를 준비합니다.
15. 패드에 동물을 배치하고 전체 복구까지 동물을 관찰합니다.
16. 동물의 행동 이틀 동안 매 24 시간을 모니터링합니다.
17. 일반 조건 및 실험 생쥐의 합병증의 신경 학적 징후는 정기적으로 모니터링된다.

3. 두개 내 종양 개발의 MRI 모니터링

1. 뇌 전이의 두개 내 개발을 모니터링하는 9.4 테슬라 자석을 사용합니다.
2. 이주 종양 이식 후 MRI를 시작하고 최대 세 주 동안 일주일에 한 번 반복합니다.
3. 3 % 이소 플루 란과 동물을 진정 유전자에서 그들을 유지RAL 마취 (1.5 % 이소 플루 란).
4. 모니터링하고 실험 내내 동물 체온과 호흡 수를 일정하게 유지한다.
5. 고해상도 멀티 나선형 (1 mm의 14 슬라이스 두께, 간격) T ₁ -과 T ₂ 강조 관상 후두에 전두엽의 영역을 포함하는 이미지, 다음과 같은 매개 변수를 취득 : T ₁ 강조 영상을 : 에코 여러 조각 (SEMS)를 스핀, TR / TE = 400 msec/20 밀리 초, 매트릭스 : X 256 256, 평면 해상도 FOV 20 × 20 mm의 : 78 X 78 μm의 ^2. T ₂ 강조 영상 : 256 X 256, FOV 20 × 20 mm의 평면 해상도 : 78 X 78 μm의 빠른 스핀 여러 조각 (FSEMS) 시퀀스, TR / TE = 2500 msec/48 밀리 초, 8 에코 열차, 매트릭스를 에코 ^28.9.
   종양 병변은 T ₂ 강조 영상에서 정상 뇌 조직보다 밝게 나타납니다.
6. 종양의 크기는 수동으로 enhan을 요약하여 T ₂ 강조 영상에서 결정된다우리 ^에이트 작성한 MATLAB 프로그램을 이용하여 각 이미지의 질량 부를의 cing.
   직경이 슬라이스 두께 (1mm)보다 작은 종양의 대부분을 감안할 때, 종양의 크기는 오히려 부피보다 평면 영역으로 표시된다.

4. H & E 염색은 전이 확인

1. 종양 베어링 뇌를 해부, 바로 다음 MR 스캔 후 쥐를 희생의 OCT 매체에 포함와 C -80 ° 동결
2. 제 10 ㎛ 두께의 관상 뇌의 일련의 저온 유지 장치와 표본.
3. 뇌 부분에 H & E 염색을 수행합니다.

결과

MRI (평면 해상도에 78 μm의)의 높은 공간 해상도로, hyperintense 병변 (그림 2) 직경 310 ㎛의 한 작은 식별 할 수 있습니다. 이 연구에서 전이가 매우 작은 괴사와 부종의 개발 때문에 T ₂ 강조 영상에서 hyperintense 병변이 진정으로 종양의 질량을 나타내는 최소이다.

종관 MRI 연구는 종양 성장의 비 침습적 생체 평가에 허용한다. 도 3에 도시 ?...

토론

본 연구에서는이 연구 개발 뇌 전이의 모든 동물과없는 동물의 죽음이 관찰되었다 있도록 초음파 영상 유도 좌심실 분사의 정확성을 보장 것을 증명하고있다. 영상 유도 주사의 아름다움은 피부 그리고 마지막으로 좌심실에 바늘 침투의 경로를 모니터링하고 따라 엄격한 해부학 적 랜드 마크를 필요로하는 수동 절차 구별되는 이미지에 따라 조절 될 수 있다는 것입니다.

뇌...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	HyClone	SH30022.01
Trypsin	Mediatech	25-051-C1
Automatic cell counter	BioRad	TC10
Isoflurane	Baxter International Inc.	1001936060
VisualSonics Vevo 770 High-Resolution Imaging System	Visual Sonics Inc.
9.4 T horizontal bore magnet with a Varian INOVA Unity system	Agilent
O.C.T Compound	Sakura Finetek USA	4583