만성 EAE와 마우스의 신경 줄기 / 전구 세포의 전신 주입

요약

신경 줄기 / 전구 세포 (NPC가)의 이식은 재생 신경의 큰 약속을 보유하고 있습니다. 의 NPC의 전신 배달은 뇌와 중추 신경계의 실험 만성 염증성 손상에 의해 영향을 설치류 및 영장류의 척수에 줄기 세포를 제공하는 효과적인 침략 낮은 및 치료 매우 효과적인 프로토콜로 설정되어 있습니다.

초록

신경 줄기 / 전구 세포 (NPC들)은 재생 신경과 뇌의 수리 또는 복원을 목표로 이식 방법에 대한 유망한 줄기 세포의 원천입니다. 이 지시문은 뇌 수리가 신경 질환의 여러 전임상 모델에서 초점 또는 전신 NPC 이식 후 달성하는 광범위한 증거에서 생겨났다.

이러한 실험 결과는 긴급 평가를 필요로 뇌 질환에 대한 회복 줄기 세포 치료의 주요 장애물 중 하나로서 세포 전달 경로를 발견했습니다. 뇌실질 내 줄기 세포 이식은 척수 손상과 파킨슨 병으로 격리와 접근 뇌 병변을 특징으로하는 병리에 대한 논리적 인 접근 방식을 나타냅니다. 불행하게도,이 원칙은 다발성 경화증 (MS)를 포함, 다 초점 염증 및 (시간과 공간 모두) 전파 특성에 의해 특징 조건에 제대로 적용 할 수있다. 예, 뇌 SYST에 의해 대상으로EMIC NPC 전달은 뇌 및 중추 신경계 (CNS)의 실험 만성 염증성 손상에 의해 영향을 설치류 및 영장류의 척수 세포를 제공하는 저 침습 치료 효과가 프로토콜이되고있다.

세포 전달이 대안적인 방법은, NPC의 pathotropism에 (ⅰ) 기능성 세포 부착 분자 및 염증성 사이토 카인 및 케모카인 수용체를 통해 환경을 감지하도록 특별히 타고난 용량 의존; (II) 누출 해부학 정맥 주사 후 장벽 (. IV) 또는 뇌 실내 (ICV) 주사를 건너; (III) 염증성 뇌와 척수 손상의 여러 혈관 주위 사이트 (들)의 수준에 축적; 및 (iv) 생체 내에서 다른 호스트 표적 세포 상 현저한 조직 영양 및 면역 조절 효과를 발휘한다.

여기에서 우리는 우리가 IV에 대한 개발 방법을 설명합니다. 및 <EM> ICV의 만성 CNS 염증성 탈수 초화의 모델로 실험자가 면역 뇌척수염 (EAE)와 생쥐의 동계의 NPC의 전달, 그리고 재생 신경의 염증이 뇌의 선택적 타겟팅에 대한 가치있는 기술과 조직의 줄기 세포 전달을 직시하다.

서문

강력한 증거 CNS 장애 ^1-8의 동물 모델에서 체세포 신경 줄기 / 전구 세포 (NPC가)의 이식의 치료 효능을 입증 생체 내 연구에서 생겨났다. 이러한 실험 결과는 임상 응용 프로그램으로 변환하기 전에 그럼에도 불구하고, 호스트에 줄기 세포의 전달과 관련된 문제의 수는 신중한 검토가 필요합니다. 다 초점, 만성 염증성 뇌 질환 (nonhematopoietic) 원기를 회복시키는 줄기 세포 치료의 발전으로 특히 상당한 장애물은 NPC 주입의 최적 경로를 식별합니다. 대상 질병의 병태 생리의 확고한 이해 (초점 또는 다 초점, 기본 염증 또는 기본 퇴행성) 및 전달 기술과 관련된 가능성과 위험 문제의 신중한 분석은 줄기 세포 전달을위한 최적의 프로토콜을 식별합니다.

동안 초점 ( 예. 신경계의 실질에) 줄기 세포 이식 손상의 공간적으로 밀폐 된 공간을 특징으로 중추 신경계 질환의 치료에 대한 논리적 인 접근 방식 (예를 들면 파킨슨 병과 헌팅턴의 질병, 뇌와 척수 외상성 손상, 뇌졸중), 바로 그 방법을 증명할 수 예, 다 초점 만성, 공간적으로 전파 CNS 손상은 시간이 지남에 축적 MS, 같은 조건에서 실질적으로 가능하지합니다. 후자의 경우, 각각의 병변에 초점 세포 주사를 대상으로는 따라서 적게 침략 NPC 이식 타겟팅 CNS의 대안, 더 적절한 방법의 식별을 자극 CNS 실질 내 긴 거리를 통해 마이그레이션하는 이식의 NPC의 제한된 용량에 의해 방해된다 .

CNS9 외부 혈관 내 주입했을 때 큰 약속은 생쥐의 NPC가 두개 내 종양 (예를 들면. 신경 교종)을 대상으로 관찰에서 나왔다. 이 정액 다음줄기 세포 pathotrophism ^10의 생체 증거, 광범위한 데이터는 실험자가 면역 뇌척수염 (EAE)와 동물 실험의 가능성과의 NPC의 조직 이식의 치료 효과에 관한 축적 된 정맥 중 하나를 통해 염증 CNS 손상의 모델로 (IV) 또는 뇌 실내 (ICV). NPC 주입 ^{1,2,5,6,8 ..} 우리는 먼저이 대상을 입력 염증 CNS를, 이후 여러 세포 간 결합에 이식의 NPC의 능력에 의존하는 것으로 나타났습니다 생체 ^(11)의 특정 미세 환경 내에서 통신 프로그램. 특히 CNS를 대상으로하기 위해,의 NPC는 뇌척수액 (CSF) ICV 주입에 의한 순환, 또는 정맥 주사를 통해 혈류로 직접 전달됩니다. 일단 혈류 또는 CSF 중 하나를 입력, 이식의 NPC가 적극적으로 상호 작용혈액 뇌 (BBB)​​ 또는 혈액 뇌척수액 (BCSFB) 장애 및 중추 신경계의 실질을 입력합니다. NPC 이식하고 BBB (또는 BCSFB) 사이의 상호 작용은 NPC의 표면에 세포 부착 분자 (CAM들)의 특정 설정에 의해 규제 및 활성화 내피 / 뇌실막 세포 ^12-14에 CAM 카운터 - 리간드의 높은 수준의 발현에 의해 촉진된다. 이러한 캠 예는 히알루 론산에 대한 수용체, CD44, 및 세포 간 접착 분자 (ICAM) -1 리간드 늦게 항원 (VLA) -4 ^5,15,16 (즉, 백혈구의 활성화 뇌실막과의 상호 작용의 책임을 포함 내피 세포), 그리고 훨씬 낮은 정도의 림프구 기능 관련 항원 (LFA) -1 P-셀렉틴 당 단백질의 리간드 (PSGL) -1. NPC들도 CCR1, CCR2, CCR5, CXCR3 및 CXCR4 등의 케모카인 수용체의 넓은 범위를 표현하는 (그러나 CCR3 및 CCR7을 표명하지 아니합니다) 시험 관내 및 생체 ^5,16 모두 기능적으로 활성화되어있는. 따라서, systemica베드로 주입의 NPC는 염증 CNS의 수준에 축적, G-단백질 결합 수용체 (GPCR에)와 함께,이 캠 사용합니다. 반대로, NPC의 혈관이나 뇌척수액 공간 루트 ^2를 통해 CNS를 입력하지 않은 건강한 생쥐에 체계적으로 주입했다. 화학적으로 유도 된 뇌염의 모델로 조직의 사이토 카인 또는 lypopolisaccharide (LPS) 주입 다음 CNS의 염증, 또는 내피 / 뇌실막 세포 활성화는 뇌와 척수 ^2에 체계적으로 주입의 NPC의 축적을위한 필요가있다. 따라서, 조직 NPC 치료와 CNS의 성공 타겟팅은 뇌와 척수 환경이 축적의 NPC의 내피 마이그레이션에 도움이되는 기회 (우)의 질병 특정 윈도우의 식별에 따라 달라집니다. 이러한 조건은 일반적으로 급성 및 아 급성 염증 ^(17)의 상황에서 발생한다. 일단 미분화의 NPC를 이식, CNS를 입력 한마우스의 clinico 병리학 기능뿐만 아니라 EAE와 큰, 인간이 아닌 영장류를 개선하는 것으로 나타났다. 이 질문에 답변 최소한의 세포 교체 ² 및 비 CNS 염증 영역 ^{(19, 20)} (예를 들어, 림프절) 대 혈관 주위 CNS ^2,5,6,18 내 면역 조절 및 신경 주변 분비 인자의 놀라운 분비에서 의존하는 기술되었다 염증 세포의 신호는 면역 세포에게 ^{5 침투에} 의해 유발.

여기에서 우리는 만성 EAE의 마우스 모델에 체세포의 NPC의 전신 주사의 주요 방법 론적 측면을 설명합니다. 보다 구체적으로, 우리는 확장 및 성인 C57BL / 6 마​​우스의 subventricular 영역 (SVZ)에서 이식 체세포의 NPC를 준비, 우리는 (I)로 설정 한 프로토콜을 도출 정의; (II)는 마우스의 만성 EAE를 유도 그리고 (iii) 치료 효과가 전신 (IV 또는 ICV) NPC 이식을 수행하는 전n을 EAE 마우스.

프로토콜

동물과 관련된 모든 절차는 1986 년 (SP에 PPL 번호 2천4백57분의 80)의 역할은 동물 (과학적 절차)에 따라 영국 본사의 승인을 실험실 동물 관리의 원칙에 따라 수행된다.

성인 쥐의 뇌의 Subventricular 지대 (SVZ)에서 체세포 신경 줄기 / 전구 세포 (NPC가) 1. 유도

1. 절개 악기와 미디어의 준비
   NB : 해부 악기 사용하기 전에 (이 파파인을 희석하는 데 도움이 효소의 활성을 최적화) 준비 및 37 º C에서 적어도 20 ~ 30 분에 데워진되기 전에이 두 솔루션은 1-2 시간을 준비해야합니다.
   
   1. 하나의 직선 날카로운 가위, 하나의 작은 수술 가위로 두 개의 작은 곡선 톱니 모양의 집게를 압력솥.
   2. '소화'솔루션 : 두 개의 별도의 50 ML 튜브를 준비합니다 :
      해결책 # 1 : 25 ml의 얼의 균형 소금 솔루션 (EBSS) + 10 ㎎ 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) + 10 ㎎의 L-시스테인;과
      솔루션 # 2 : 25 ML EBSS + 50 mg의 파파인.
   3. , 표피 성장 인자 (EGF; 20 NG / ㎖), 및 항생제; 0.002 %, 염기성 섬유 아세포 성장 인자 (10 NG / ㎖의 bFGF)을 헤파린 마우스 증식 보충제 완전한 쥐 기초 배지 : '완전 성장 배지'(CGM)를 준비 (펜 / Strep의).
2. 뇌 해부
   NB : 시간적 뼈의 제거가 용이하기 때문에 자신의 선명도의 조직을 손상시킬 수 있습니다. 이를 방지하기 위해 단단히 포셉과 뼈를 보호하고 전체 뼈가 제거 될 때까지 잡아 당깁니다.
   
   1. 자궁 경부 전위 N = 5-7 4-8 주령 C57BL / 6 마​​우스로의 NPC, 도태의 모든 준비를하십시오.
   2. 70 % 에탄올 (물) 학살 마우스의 머리와 머리를 제거하기 위해 직선 날카로운 가위로 귀 뒤에 잘라 정화;
   3. 두개골을 통해 피부를 잘라 작은 수술 가위를 사용하여 중간 선 절개를합니다. 집게를 사용하여, 박람회에 피부의 두 가지 패치를 접두개골을 전자.
   4. 작은 수술 가위로 두개골의 바닥에 두 개의 작은 상처를 수행하고 뇌교 / 수질 (복부 두개골)에서 뼈를 제거합니다. 시간적 뼈를 잡아 당겨 넘어갑니다. 같은 가위로 뇌의 표면을 손상시키지 않고, 전구에 기본에서 시작, 모든 두개골을 따라 절단을 수행합니다. 또한, 정수리 뼈의 제거를 용이하게하기 위해, 정면 뼈와 눈 사이 절단을 수행한다. 두 집게 바깥쪽으로 정수리 뼈의 각을 잡아 당겨 두개골 제거를 시작으로. 당기면서 뼈가 제거 될 때 뇌에 손상을 줄 수있는 수막에주의를 기울이십시오.
   5. 두개골이 제거되면, 완전히 수막 왼쪽 분리 뇌와 두개골 사이의 집게를 밀어 넣습니다. 부드럽게 두개골에서 뇌를 올립니다. 뇌를 해제하고 마지막으로 차가운 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)와 튜브에 뇌를 수집하는 시신경을 잘라.
   6. 얼음에 튜브를 유지모든 마우스에 대해 동일한 절차를 반복 ㄹ.
3. SVZ의 해부, neurosphere 형성 및 유지 보수 분석
   셀 x의 평균 수 희석 계수 × ¹⁰⁴
   
   10 ^4는 헤 마토 챔버 (-> 10~4cm ³ -> 10-4 ml의 총 부피 = 0.1 mm ^3)의 총 부피의 변환을 나타낸다. 희석 배수, CGM으로 수행 하나 필수적인 얼룩을 모두 고려할 때 고려되어야한다. 160 세포는 네 모서리 사각형 카운트 된 경우 예를 들어, 세포 현탁액의 최종 농도 (세포 / ㎖)이 될 것이다 :
   
   4분의 160 × 5 (CGM 희석) × 2 (중요 얼룩 희석) × 10 ⁴
   
   1. 해부 현미경을 갖춘 해부 후드의 전원을 켭니다.
   2. 70 % 에탄올 (물에) 모든 표면을 청소하고, 오염의 위험을 낮추는 항 마이코 플라즈마 솔루션을 스프레이.
   3. 덮개멸균 거즈와 비커의 바닥 (예리한 도구를 유지하기 위해) 및 70 % 에탄올 (물)로 채 웁니다. 비커에 집게 두 쌍의 하나 마이크로 가위 한 쌍의 수술 날을 적시십시오.
   4. 뇌 슬라이서 행렬에 뇌 전체를 놓습니다.
   5. 두 개의 면도날 광학 책자 제외하고, 뇌의 앞쪽에 극에서 관상 절편 2mm를 수행하고, 이전 컷에 3mm 후방 사용; 깨끗한 페트리 접시에 조직을 배치합니다.
   6. 해부 현미경 SVZ 조직을 분리하여 가위를 사용하여 홍채 절제술 1mm ³ 조각으로 잘라. 모든 뇌에 대해 반복합니다.
      1. 물론 위의 두 가지 솔루션 (섹션 1.1.2)를 혼합하고, 두뇌가 해부하고 SVZs 소화 할 준비가 된 직후 0.22 μm의 필터를 통해 필터링합니다.
   7. '소화'용액 30 ㎖로 섹션을 이동, 부드럽게 A10 ML 피펫으로 재현 탁하고 3시 30 분을 품다5 % CO _2에서 7 ° C에서. 매 15 분 부드럽게 튜브 2 - 3 배를 흔들.
   8. 10 분 300 XG에 원심 분리기.
   9. 뜨는을 제거하고 단일 세포 현탁액을 얻을 때까지, P200 피펫 (10-20X 각) 우선 P1000과 함께 다음 피펫으로 CGM의 200 μL에 펠렛을 재현 탁.
   10. CGM과 5 ㎖에 현탁액을 가지고 T25의 cm ² 플라스크에 옮긴다.
   11. 체외 5-7 일 후 (DIV)을 neurospheres가 형성됩니다. 150 × g에서 15 ML 튜브와 원심 분리기 10 분에 정지를 수집합니다.
   12. 뜨는을 제거하고 CGM의 200 μL로 펠렛을 재현 탁.
       단일 세포 현탁액을 얻을 때까지, P200 피펫으로 세포 100-150X를 계대에 의해 기계적을 neurospheres 해리와 CGM과 함께 1 ㎖에 걸릴.
   13. 1:5 희석을 얻기 위해 CGM의 40 μL의 세포 현탁액, 예를 들어, 세포 현탁액의 10 μl를 희석, 잘 섞는다. dilut의 10 μl를 혼합전자 셀 중요한 얼룩의 10 μL와 서스펜션과 잘 섞는다.
   14. 중요한 얼룩 솔루션 : 1:1의 세포 현탁액의 10 μL와 혈구 계산 챔버를 입력합니다. 별도로 4 모서리 사각형 라이브 (흰색)과 죽은 (파란색) 세포의 수를 계산합니다. 세포 / ml의 수를 결정하기 위해, 다음과 같은 계산을 적용
   15. 5 CGM ㎖ 및 T25의 cm ² 플라스크로 전송에 재현 탁 2 × 10 ⁵ 세포;
   16. 섹션 1.3.11-1.3.12마다 4-5 DIV를 반복합니다. 이후 확장의 제 2 통로에서 중요한 얼룩 배제함으로써 세포 생존 능력을 평가하고 ²¹ 설명한 바와 같이, 클론 밀도 (8,000 cells/cm2)에서의 NPC를 도금하여 지속적인 성장 곡선을 구축 시작합니다. 세포 수를 유지하고 절차마다 4-5 DIV를 반복합니다. 다음과 같이 지속적인 성장 곡선을 생성하려면 다음을 수행하십시오
       NB : 4-5 DIV 분야가 150 ~ 200 ㎛의 직경에 도달해야 후, 좋은 세포의 준비를하십시오. T의 좋은 평가를하려면그 밀도 세포는 헤 마토 걸쳐 잘 분산 겹치지 않는 셀을 위하여 최적의 희석 비율을 찾는 것이 중요하다. 이상적으로, 50 ~ 200 총 세포 사이에 있어야한다. 카운팅하면 테두리를 건드리지 않고 사각형 내에 포함 셀만이 고려되어야한다. 또한, 세포의 생존력은 건강한 제제를받는 중요한 요소이다. 중요한 것은 큰 90 %이어야한다. 선형 성장 곡선은 건강한 세포 준비의 또 다른 지표이다.
       
       1. 살아있는 및 죽은 세포의 수 (예를 들면 1.3 × ^106)을 계산.
       2. 도금 셀의 수 (예를 들면 1.3 × 10 ⁶ / 2 × ⁵ = 6.5)에 의해 생균 수를 나눈 성장률을 정의한다.
       3. (= 2 × 10 ⁵ 초에서) 이전의 시점에서 본 셀의 전체 개수에 대한 성장 속도를 곱하여 세포의 총 수를 계산한다.
       4. 평균 신고7; 선형 추세 라인을 구축하는 표준 편차.
   17. 통로 (6)에서 시작, 기계적 분리는 효소 분해에 의해 대체된다. 10 분 150 XG에 원심 분리 한 후, 상층 액을 제거 세포 집계 해리 용액 200 μL에 펠렛을 재현 탁, P200과 7-8 배를 재현 탁, 37 ° C, 5 % CO _2에서 10 분을 _품어.
   18. 단일 세포 현탁액을 얻고 CGM의 800 μl를 추가 P200 7 - 8 배에 resuspend. (라이브와 죽은자를) 세포를 계산하고 자신의 생존을 설정합니다. 5 CGM ㎖ 및 T25의 cm ² 플라스크로 전송에 재현 탁 2 × 10 ⁵ 세포.
4. 생체 내 세포 추적의 NPC의 바이러스 전달
   NB : 바이러스 전달의 효율성을 확인 형질 도입 및 nontransduced NPC들과 함께 동반 성장 곡선을 구축 할 수 있습니다. 또한, 그 neurosphere 형성 세포의 절대 수는 세포 제제 내에 존재하는 클론 효율이며기 또는 (요오드화 프로피 듐, PI)와 DNA의 함량으로 세포주기 분석은, 셀 상태의 상기 표시로서 사용될 수있다. 감염된 세포의 백분율이 좋은하지 않아야하는 경우, 바이러스 형질 도입의 프로토콜은 세포의 동일한 인구 번 반복 될 수있다. 감염의 수준이 양호하고 성장 곡선은 야생형 세포로 수득 된 것과 유사하다되면 형질 NPC의 확장 및 / 또는 이식 될 수있다.
   
   1. neurosphere를 수확 단일 세포 현탁액을 얻을 수 있습니다. 10 ㎖ CGM에 고밀도 (T75의 cm ² 플라스크에 1.5 × 10 ⁶ 세포)에서 세포를 접시.
   2. 12 시간은 3 세대 렌티 바이러스 벡터 pRRLsin의 3 × 10 ⁶ TU / ㎖를 추가 한 후. PPT-HCMV E.으로 설계 β-갈 락토시다 아제 (lacZ의) 또는 녹색 형광 단백질 (GFP)와 대장균 유래.
   3. 48 시간 후, 10 분 동안 300 XG에서 세포를 원심 분리기를 수확 해 1:1의 비율로 세포를 replate.
   4. 후체외에서 3 통로는 감염 효율을 확인. 유동 세포 계측법은 일반적으로 감염 효능을 테스트하기 위해 사용되며, 감염의 만족스러운 수준은 일반적으로 양성 세포 75~95%의 범위로 허용된다. 마커의 발현의 유지를 확인하기 위해 확장 3 추가 통로 후 다시 감염의 효율성을 확인합니다.
5. Neurosphere 동결
   1. 10 분 300 XG에 T25의 cm ² 플라스크, 원심 분리기에서 neurosphere를 수확하고, 상층 액을 버린다.
   2. 10 % 디메틸 술폭 시드 (DMSO)와 매체 (CGM 동결 1 ㎖로 펠렛을 재현 탁.
   3. 냉동 컨테이너 내에서 -80 ° C에서 cryovials를 놓습니다.
   4. 최소 24 시간 후 개월 -80 ° C에서 cryobox 및 저장에 세포를 이동하거나 더 이상 저장을 위해 액체 질소 (N _2)를 가져옵니다.
6. Neurosphere 해동
   NB : 장기간의 접촉 오의 독성을 방지하려면DMSO와 F의 NPC는 해동 과정은 가능한 한 빨리해야합니다.
   
   1. 에서 cryovial을 제거 -80 C / N ₂ °와 드라이 아이스에 보관하십시오.
   2. 거의 모든 세포 현탁액 제상 및 아이스 현탁액의 작은 조각 만이 유지 될 때까지 신속, 수욕에서 바이알을 해동.
   3. 데워진 신선한 CGM 5 ㎖와 세포 현탁액을 재현 탁.
   4. 10 분 300 XG에 원심 분리기.
   5. 신선한 CGM의 5 ㎖로 조심스럽게 상층 액에 resuspend를 제거하고 깨끗하고 치료 T25의 cm ² 플라스크에 세포 현탁액을 도금.
7. 1.7) NPC 특성
   NB : 마지막 세척 PBS는 곰팡이 성장이나 오염을 방지하기 위해 0.05 % 아 지드 화 나트륨-PBS로 대체 할 수 있으며, coverslides 2 ~ 3 주 동안 4 ° C에 저장됩니다.
   
   NB : 세포 마커 얼룩하려면 차단 솔루션 PBS에 permeabilizing 에이전트를 추가합니다. 일차 항체의 소스는 염소, 소 혈청 albumi 경우N (BSA) 또는 염소 이외의 혈청을 사용해야합니다.
   
   주의 : 세포 마커 차 항체 용액에 permeabilizing 에이전트를 사용에 얼룩이.
   
   1. 24 웰 플레이트의 하단에 13mm 유리 coverslide를 놓습니다. 작은 방울을 만들 수있는 각 coverslide의 상단에 코팅 용액 150 μl를 추가합니다. 37 ° C에서 적어도 30 분 동안 품어, 5 % CO _2.
   2. neurosphere를 수확 한 세포 현탁액을 구하는 해리.
   3. 살아있는 세포를 세어 80,000 cells/35 μl를 얻기 위해 희석. 부드러운 흡인 coverslide에서 코팅 용액의 과잉을 제거하고, 세포 현탁액의 35 μl를 접시.
   4. 37 ° C에서 25 분 알을 품다, 5 % CO _2. 세포가 부착하기 시작했습니다 경우 신속하게 대비 위상 현미경으로 확인합니다.
   5. 적합한 보조제 (표 1 참조) 및 항생제 (PE와 기저 마우스 매체를 혼합함으로써 분화 배지를 준비N / 연쇄상 구균).
   6. 차별화 매체 400 μl를 추가하고 37 품어 ° C, 5 % CO _2.
   7. 3 DIV 후, 신선한 차별화 매체와 매체의 변화의 절반.
   8. 6 DIV 후, 배지를 제거하고 PBS로 한번 세척 하였다. 화학 후드에서 PBS를 제거하고 데워진 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA) 4 % 자당의 300 μl를 추가합니다. 실온 (RT)에서 5 분 알을 품다. PFA를 제거하고 PBS로 3 회 세척한다.
   9. 면역 세포하려면 PBS를 제거하고 PBS 10 % 정상 염소 혈청 (NGS) (차단 솔루션)으로 차단하고, 실온에서 1 시간을 품어.
   10. 차단 솔루션을 제거하고 PBS 1 % NGS로 희석하여 원하는 차 항체를 추가합니다. 또한, 120 분 RT에서 4 ° CO / N이나, 알을 품다.
   11. 배양 후, PBS로 2 배 씻는다. PBS, 1 %로 희석 NGS 적절한 이차 항체와 함께 배양한다. 실온에서 60 분 알을 품다.
   12. 세척 PBS로 2 배 및 4와 핵을 반대 얼룩 '-1,6 - diamidino -2 - 페닐 인돌 (DAPI)는 PBS가 어둠 속에서 실온에서 3 분 동안 에이전트를 permeabilizing으로 1:20,000 희석. PBS와 증류수를 한 번 두 번 씻으십시오.
   13. 유리 조직 슬라이드에 장착 매체의 방울을 넣고 집게로 설치 매체가 직면하고있는 세포와 coverslide를 탑재합니다. 부드럽게 장착 매체의 과잉을 짜내 coverslide를 누릅니다. 설치 매체가 건조 될 때까지 실온에서 어둠 속에서 coverslide을두고 4 ℃에서 저장

C57BL / 6 마​​우스의 2. 미엘린 희소 돌기 아교 세포 당 단백질 (MOG) 유발 실험자가 면역

1. 에멀젼의 제조
   1. 유리 비이커에 [달리 완전 프로 인트 아쥬 반트 (CFA)로 정의]와 MOG (펩티드 35-55) 200 μg 고려 결핵균의 4 ㎎ / ㎖를 함유하는 불완전 프로 인트 아쥬 반트로 이루어진 에멀젼을 제조하는 에멀젼의 총량 당 마우스는 300 μL 될 것입니다.
      NB : AppropriaCFA의 MOG - 예방 접종을 생쥐의 테 컨트롤은 CFA와 함께 예방 접종을 마우스입니다. MOG - 예방 접종을 생쥐의 질병 발병의 예상 편차는 11.3 (± 1.8) dpi입니다.
      
      NB : 필요한 에멀젼의 총 부피를 계산할 때, 면역 생쥐의 수를 두 배의 볼륨을 고려하십시오. 유리는 에멀젼의 부분의 낭비를 최소화 할 plasticware에 바람직해야한다.
      
      1. 유리 주사기는 항상 얼음에 에멀젼을 유지하고, 약 30 분 동안 19 G 바늘의 조화를 들고.
      2. 에멀젼을 준비하는 경우, 확인 물에 에멀젼의 소량을 드롭. 그것은이고 분산되지 않는 방울은 남아있는 경우에만 유액을 주입 할 준비.
      3. 단 CFA와 마우스의 대조군 면역. 실험 쥐를 치료​​ CFA에 MOG와 (MOG는 예방 접종). MOG 질병 발병의 예상되는 변화는 마우스가 11.3 (± 1.8) dpi로입니다 예방 접종.
   2. 1 ㎖ 플라스틱 주사기에 19 G 바늘로 이동차 에멀젼을 대기음. 거품을 피 25 G와 바늘을 변경하고 얼음에 주사기를 둡니다. 유화 가득 주사기 사용 준비하고 시간의 몇 얼음에 보관해야합니다.
2. 면제
   1. 온난화 상자에 (여성 6~8주 오래) 마우스를 놓고 약 10 분의 꼬리 정맥이 팽창 할 수 있도록 기다립니다.
   2. 마우스 제한 수단에 온난화 상자에서 하나의 마우스를 전송합니다. 마우스의 움직임을 방지하기 위해 제한 수단을 닫습니다.
   3. 거품을 만드는 피 백일해 독소 (5 ㎍ / ㎖)을 100 ㎕ 씩 1 ㎖ 인슐린 주사기를 채우십시오. 천천히 꼬리 정맥에 솔루션을 주입. 출혈을 연결하는 종이 조각으로 몇 초 동안 바늘을 눌러 제거합니다.
   4. 다시 새장에 마우스를 놓고 모든 마우스에 대해 동일한 절차를 반복합니다.
   5. 연속 이소 플루 란 흡입 (1 ~ 2 %, 2 L / 분)와 마우스를 마취하고 수준에서 에멀젼 피하의 100 μl를 주입두 플랭크와 테일 (300 μL 에멀젼 / 마우스)의베이스. 천천히 에멀젼의 누설을 방지 주사기를 제거합니다.
   6. , 귀 구멍을 뚫는와 마우스를 표시 새장에 마우스를 배치하고 전체 복구 될 때까지 확인합니다. 모든 마우스에 대해 반복합니다.
   7. 48 시간 후 (2 일 후 예방 접종, dpi로) 구간 반복 2.2.3.
3. EAE 마우스의 행동 분석
   1. 5 dpi로부터 출발 매일 마우스의 무게를 표 1에 기재된 치수 점수 시스템을 사용하여 자신의 전위 추이를 모니터링.

꼬리 정맥에 신경 줄기 / 전구 세포의 3. 주사 (IV)

1. 휴대 준비
   1. 10 분 300 XG에 원심 분리하여 수확을 neurospheres.
   2. 뜨는을 제거하고 세포 집계 해리 용액 200 μl를 추가합니다. 37 ° C에서 10 분 알을 품다, 5 % CO _2.
   3. 조심스럽게 10 - 12 배 (avoidin을 재현 탁G의 단일 세포 현탁액을 얻기까지 P200 거품)과 칼슘 ^{2 +} 및 Mg를 ^{2 +없이} 기초 배지 800 μL에 걸릴.
   4. 세포 생존율을 분석 실험 및 ¹⁰⁶ cells/150 μl의 최종 농도를 얻기 위해 칼슘 ^{2 +} 및 Mg를 ^{2 +없이} 기본 배지와 현탁액을 희석시키는 중요한 얼룩을 사용하여 세포를 카운트. 사용할 때까지 얼음에 세포 현탁액을 유지합니다.
2. NPC의 IV 주입
   주의 : 하나의 세포 현탁액에 이상적인 해리 기포의 부재는 정맥 폐쇄와 그에 따른 사망을 초래할 수있는 색전 형성 대 수풀 / 집계 하나의 위험을 줄이기 위해 고려해야 할 두 가지 중요한 측면입니다.
   
   1. 질병 (16-18 dpi로)의 첨단에, 무게와 마우스를 점수. 동질 그룹을 위해 자신의 점수에 따라 쥐를 배포합니다.
   2. 온난화 상자에 마우스를 놓고 약 10 분의 꼬리 정맥이 팽창 할 수 있도록 기다립니다.
   3. 마우스 제한 수단에 온난화 상자에서 하나의 마우스를 전송합니다. 마우스의 움직임을 방지하기 위해 제한 수단을 닫습니다.
   4. 세포 현탁액 150 μL와 1 ㎖ 인슐린 주사기를 입력하고 모든 거품을 제거해야합니다. 천천히 꼬리 정맥에 용액을 주입. 출혈 (그림 6A 및 6B)를 연결하는 종이로 몇 초 동안 바늘을 눌러 제거합니다.
   5. 새장에 마우스를 놓고 복구 될 때까지 확인합니다. 모든 마우스에 대해 동일한 절차를 반복한다.

4. Cisterna의 마그나 (ICV)에 신경 줄기 / 전구 세포의 주입

1. 휴대 준비
   1. 10 분 동안 300 XG에서 원심 분리하여 수확의 NPC.
   2. 뜨는을 제거하고 세포 집계 해리 용액 200 μl를 추가합니다. 37 ° C에서 10 분 알을 품다, 5 % CO _2.
   3. 부드럽게 단일 C를 획득 할 때까지 P200으로 10-12X를 재현 탁엘 서스펜션과 칼슘 ^{2 +} 및 Mg를 ^{2 +없이} 기초 배지 800 μL에 걸릴.
   4. 세포를 계산하고 원하는 세포 밀도를 얻기 위해 칼슘 ^{2 +} 및 Mg를 ^{2 +없이} 기저 매체와 현탁액을 희석. 사용할 때까지 얼음에 세포 현탁액을 유지합니다.
2. 4.2) NPC의 ICV 주입
   1. 질병 (16-18 dpi로)의 첨단에, 무게와 마우스를 점수. 동질 그룹을 위해 자신의 점수에 따라 쥐를 배포합니다.
   2. 연속 이소 플루 란 흡입 (1 ~ 2 %, 2 L / 분)에서 정위 장치에 마우스를 놓습니다. 귀 막대 마우스의 머리를 고정합니다. 그런 다음 입과 코의 조각을 모두 조정합니다. 마우스의 머리는 평평하고 고정되어 있는지 확인하십시오.
   3. 포비돈 - 요오드 (PVP-I)와 마우스의 머리를 면봉 두개골을 노출시키기 위해 헤드의 후방 부에 피부를 잘라 절개.
   4. 미세 조작기를 사용하여, 마이 크롤의 끝을 삽입목 뒤쪽의 중간 선에서 그대로 근육과 인대를 통해 후두와 아틀라스 척추 사이의 갈라진 틈에 ITER 주사기. 바늘의 굽은 부분 ^(22)을 한 바와 같이, 전체 길이에 대한 후두부의 내면에 밀착 유지된다.
   5. 천천히 바늘을 삽입하고 몇 초를 기다립니다. 연산자는 바늘이 셀 준비를 주입 시작하기 전에 마우스 두개골에 "중독"되는 느낌을 인식하는 법을 배워야하는 것을 의미한다. 천천히 (3-5 분 이내) 세포의 양을 주입. 주사 후 추가로 몇 초 동안 자리에 바늘을두고 천천히 주사기를 제거합니다.
   6. 피부를 스티치와 완전히 회복 될 때까지 복구 케이지에 마우스를 놓습니다.

5. 조직 처리

1. 깊이 0.5 ㎖ 케타민 (100 ㎎ / ㎖), 0.25 ml의 자일 라진 (23.32 ㎎ / ㎖) 및 4.25 ㎖의 멸균 수를 혼합물로 생쥐를 마취시키다 및 transcardically w, perfuse식염수-EDTA로 애싱 4 % PFA로 고정. 4 ℃에서 12 시간 동안 4 % PFA의 척추 열 및 두뇌와 후위를 모두 제거 PBS에서 조직을 씻어 뼈 척수를 제거하고 4 ℃에서 (PBS에) 30 % 자당에 조직에게 적어도 48 시간을 남겨 ² 바와 같이, 최적의 절삭 온도 (10 월) 화합물의 조직을 포함하고 액체 질소로 동결 스냅.
2. 10 ~ 12 μm의 두께 조각의 조직을 잘라 마이크로톰을 사용합니다.
3. 또한, 아가로 오스에 신선한 조직을 포함하고 vibratome 50 ~ 80 μm의 두께 조각을 사용하여 조직을 잘라.
4. 양쪽의 경우에, 5 - 브로 모 -4 - 클로로 -3 - 인돌 릴-β 핵 β-갈 락토시다 제 활성을 검출하는 D-갈 락토 피 라노 사이드 (X-GAL) 용액을 37 ° C에서 O / N을 배양한다.
5. 성상 세포 (50 ㎍ / ㎖), 뉴런 antineuronal 핵 항원 (노이 앤)에 antiglial 섬유 성 산성 단백질 (GFAP)를 사용하여 5 μm의 조각을 두 번 얼룩에 β-갈 + 세포를 포함하는 부분 (1 &를 재 절단# 956; ㎍ / ㎖) 및 미분화 된 신경 세포 (10 ㎍ / ml)에 대한 antiNestin.
6. 섹션 1.7.11 및 1.7.12의 설명대로 진행합니다. 여러 염색에 대해 서로 다른 형광 물질과 복합 보조 항체를 사용해야합니다.
7. GFP 표지 된 세포를 포함하는 조직의 경우와 같은 단계 5.1-5.3에 설명 된대로 진행하고 여러 염색에 진행합니다.
8. 슬라이드에 장착 매체의 몇 방울을 추가하고 조직 커버 슬립 커버.
9. 염색 섹션의 경우 비오틴 결합 된 항체는 (표 2 참조, ABC 솔루션) 아비딘 비오틴 복합체의 솔루션을 준비하고 45 분 동안 교반에 둡니다.
10. 내인성 퍼 옥시 다제의 활성을 차단하기 위해 1 % H ₂ O ₂ 슬라이스 5 분간 배양한다.
11. PBS로 두 번 씻으십시오.
12. 실온에서 1 시간을위한 ABC 솔루션을 품어.
13. PBS로 두 번 씻으십시오.
14. 3,3 '- 디아 미노 벤지딘 용액 및 0.3 % H ₂ O _2와 함께 배양한다. 반응 유엔 모니터현미경 데르 마자 슬라이스가 갈색 (일반적으로 5 ~ 10 분)을 받기 시작으로 PBS로 세척.
15. PBS로 두 번 세척하고 5.7 단계에 설명 된대로 진행합니다.

재료 및 시약의 포괄적 인 목록은 표 2에 나타낸다.

결과

NPC 유도 및 특성
SVZ 해부는 기계 및 효소 분해 (그림 1A)에 의해 6~8주 된 C57BL / 6 마우스의 (N = 5-7 마우스 / 수영장) 풀에서 수행됩니다. CGM에서 배양 몇 일 후, 자유 부동을 neurospheres는 (그림 1A 및 1B)를 형성 시작합니다. 주요 분야는 수집 및 기계적으로 모든 4-5 DIV 계대 있습니다. 계대시, 라이브와 죽은 세포의 수는 확정 누적 세포 수는 성장 곡선 (그...

토론

체세포 줄기 세포 기반 요법은 MS2 ^11과 같은 만성 염증성 CNS 장애 치료를위한 가장 유망한 전략의 하나로 부상하고있다. 자신의 치료 효과를 유지하는 메커니즘은 아직 완전히 규명 될 필요가 있지만, 신경 퇴행성 질환의 다양한 실험 모델에서 NPC 이식의 큰 영향은 세포가 곧 인간의 연구에 적용 할 수있다 줄기 다소 도발적인 믿음에 상승을 부여하고있다. 그러나, 우리는 몇 가지 주요 문?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture
EBSS	Sigma	E2888
L-Cystein	Sigma Aldrich	C7352
Papain	Worthington	30H11965
EDTA	Fisher Scientific	D/0700/50
Mouse NeuroCult basal medium	Stem Cell Technologies	05700
NeuroCult proliferation supplements	Stem Cell Technologies	05701
Heparin	Sigma	H3393
Basic fibroblast growth factor	Peprotech	100-18B-1000
Epidermal growth factor	Peprotech	AF-100-15-1000
Pen/Strep	Invitrogen	1514012
Matrigel (coating solution)	BD Biosciences	354230
NeuroCult® Differentiation Kit (Mouse)	Stem Cell Technologies	05704
Accumax	eBioscience	00-4666-56
Dulbecco's PBS (DPBS) (10x) without Ca and Mg	PAA Laboratories	H15-011
Myco trace	PAA Laboratories	Q052-020
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma	D2650
Immunofluorescence
Normal goat serum	PAA Laboratories	B11-035
Polyethylene glycol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-phenyl ether	Sigma Aldrich	T8787
Mouse anti Nestin	Abcam	ab11306
Rabbit anti GFAP	DAKO	203344
Mouse anti Histone H3 (phospho S10)	Abcam	ab14955
Rabbit anti MAP-2	Abcam	ab32454
Rat anti MBP	AbD SEROTEC	MCA409S
Anti-O4 Antibody, clone 81 | MAB345	Millipore	MAB345
DAPI	Invitrogen	D1306
Mounting solution	DAKO	S3023
EAE
Freund's Adjuvant Incomplete	Sigma Aldrich	F5506
Mycobacterium tuberculosis	DIFCO	H37Ra
MOG(35–55)	Espikem
Pertussis toxin	List Biological Laboratories	181
Tissue processing
Iris scissor straight	Fine Sciences Tools	14060-09
Blunt/bended forceps	Fine Sciences Tools	11080-02
Brain slicer	Zivic Instruments	BSMAS005-1
Surgical blades	Swann-Morton	324
P200, P1000 pipettes
Ketamine (Vetalar)	Boehringer Ingelheim	01LC0030
Xylazine (Rompun)	Bayer	32371
Stereotaxic frame	KOPF	Model 900
Hamilton syringe	Hamilton	7762-04
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma	158127
VECTASTAIN Elite ABC Kit	Vector Laboratories	PK-6100