JoVE Logo
저자
연락처

로그인

JoVE 비디오를 활용하시려면 도서관을 통한 기관 구독이 필요합니다. 전체 비디오를 보시려면 로그인하거나 무료 트라이얼을 시작하세요.

기사 소개

  • 요약
  • 초록
  • 서문
  • 프로토콜
  • 결과
  • 토론
  • 공개
  • 감사의 말
  • 자료
  • 참고문헌
  • 재인쇄 및 허가

요약

세균성 세포벽은 펩티드에 의해 교차된 당가닥의 거대 분자 네트워크인 펩티도글리칸으로 구성됩니다. 울트라 퍼포먼스 액체 크로마토그래피는 펩티도글리칸 조성물의 새로운 발견을 위한 고해상도 및 처리량을 제공합니다. 우리는 세포벽 (sacculi)의 격리와 UPLC를 통해 분석을위한 후속 준비를위한 절차를 제시합니다.

초록

세균성 세포벽은 성장과 분열 시 세포 모양의 결정에 중요하며, 강압에 직면하여 세포의 기계적 무결성을 유지합니다. 세균 왕국의 다양한 모양과 크기에 걸쳐, 세포 벽은 펩티도글리칸, 짧은 펩티드에 의해 교차 설탕 가닥의 매크로 분자 네트워크로 구성되어 있습니다. 세균 생리학에 대한 Peptidoglycan의 중앙 중요성은 항생제 표적으로 그것의 사용을 기초하고 성장과 분열 도중 강하게 조립되는 방법의 유전, 구조 및 세포 생물학 연구 결과를 동기를 부여했습니다. 그럼에도 불구 하 고, 광범위 한 조사 는 여전히 완전히 펩 티도 글리칸 합성및 세균 성 세포 벽의 화학 구성에 주요 효소 활동을 특성화 하는 데 필요한. 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)는 다양한 환경 및 유전적 조건하에서 자란 박테리아의 벽의 화학적 조성에 대한 차이를 정량화하는 강력한 분석 방법이지만, 처리량은 종종 제한적이다. 여기서, 우리는 HPLC및 울트라 퍼포먼스 액체 크로마토그래피 (UPLC)를 통해 펩티도글리칸의 생물학적 분석을 위한 세균성 세포벽의 격리 및 준비를 위한 간단한 절차를 제시합니다, HPLC에 대한 6,000 psi에 비해 최대 15,000 psi의 초고압을 제공하기 위하여 펌프를 이용하는 HPLC의 확장. 여기에 제시 된 세균성 세포벽의 준비와 함께, 낮은 볼륨 샘플 인젝터, 높은 샘플링 비율을 가진 검출기, 더 작은 샘플 볼륨, UPLC의 짧은 실행 시간은 초음파 심분리기 및 UPLC에 대한 액세스 와 대부분의 생물학적 실험실에서 펩티도글리칸 조성 및 기본 세균 세포 생물학의 새로운 발견을위한 고해상도 및 처리량을 가능하게 할 것이다.

서문

본 명세서에 기재된 방법의 목적은 그대로 세균세포벽(sacculi)을 분리하고, 울트라 퍼포먼스 액체 크로마토그래피(UPLC)가 점혈구 성분의 정체성과 농도, 글리칸 가닥의 평균 길이 및 가닥 사이의 교차링크와 관련된 물질의 분획과 같은 정보를 제공하는 데 사용될 수 있도록 펩티도글리칸(PG)을 소화하는 것이다. PG 생화학 및 무로프타이드 종에 대한 상세한 논의를 위해, PG 구조와 감염, 저항, 형태 발생 및 성장1-6의역할을 설명하는 몇 가지 우수한 리뷰가 있습니다. PG 분석을 위한 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)는 1980년대에 글라우너와 슈바르츠에 의해 처음 개발되었으며, 최근에는 미겔 드 페드로와 발데마르 볼머의 실험실에서 광범위하게 강화되고 적용되었습니다. 이전 방법은 아미노산 분석 또는 종이 크로마토그래피, 세포벽 성분의 정확하거나 완전한 평가를 산출하지 않는 시간 소모적이고 지루한 기술을 활용했습니다.

UPLC 분석은 초원심분리기 및 UPLC에 접근할 수 있는 모든 기본 실험실에서 쉽게 구현될 수 있습니다. 우리가 아래에 존재하는 UPLC 방법은 완전한 사쿠리를 분리하여 그 안에있는 모든 화학 종에 대한 포괄적이고 정량적 인 정보를 제공합니다. 이 방법은 박테리아의 인구에 걸쳐 모든 muropeptides의 정확한 정량화를 산출, 모두 20 분 UPLC 실행 내에서. 이 방법의 구현은 재료에 상당한 재정적 투자없이, 기본적인 실험실 기술을 포함한다. 이 방법의 단계를 실행하기 위해, 연구원은 파이펫팅, 완충제 및 효소를 준비하고, pH를 조정하는 데만 숙련되어 광범위한 과학적 분야에 접근할 수 있어야 합니다. 이 프로토콜에 사용되는 효소의 선택은 분석되는 박테리아의 종에 따라 달라집니다; 여기에 설명된 프로토콜은 대장균에유용하며 일반적으로 다른 그람 음성 유기체로부터 사쿠리를 분리하기에 적합한 것으로 나타났습니다. 문헌과의 상담은 그램 양성 균에이 방법을 적용 할 때 권장됩니다; 이 종에서, 타분 정화는 전통적으로 더 어려웠다. 특히, 이러한 방법은 그람 양성 균의 테이초크산과 같은 두꺼운 벽 및 부속품 폴리머를 수용하기 위해 효소 선택 및 소화 시간의 길이 측면에서 변경되어야 할 수 있다. 이 프로토콜의 첫 번째 효소는 펩티도글리칸에 부착된 외부 막 지단백(Braun의 지단백질 또는 Lpp)을 갈라서 세포벽으로부터 Lpp의 C-말단 디-(또는 트라이-) 펩타이드를 제외한 모든 것을 방출한다. 이 단계는 Enterobacteria를 검사할 때 필요합니다, 그러나 많은 그밖 그람 음성 박테리아에는 Lpp 등가물이 없습니다, 그러므로 이 단계는 건너뛸 수 있습니다. 두 번째 효소는 특히 펩티도글리칸의 무암산 성분 을 쫓아, 무로프티드 종을 형성하는 불각체 서브유닛을 용해한다. PG의 아키텍처에 대한 정확한 평가를 제공하기 위해, 크로스브릿지 또는 펩티드 줄기의 다른 부분의 분열을 방지하기 위해 사쿠리를 소화하는 데 주의를 기울여야 한다.

100종 이상의 세균성 종의 펩티도글리칸의 화학 조성물은 HPLC에 의해 분석되었지만 UPLC 기술로는 분석이 수행되지 않았습니다. 또한, 이전 작품은 세균 영역의 극히 일부만에서 펩티도글리칸을 특징으로 하며, 일부는 HPLC의 처리량에 의해 제한된다. 따라서, 가능한 한 많은 연구자에 이 방법의 보급, UPLC 플랫폼에 구현, 그의 펩티도글리칸아직 분류되지 않은 세균성 종의 큰 부분의 생리학적 연구를 구동하는 데 중요 할 것이다.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

프로토콜

1. 하룻밤 미디어의 2.5 ml에서 세균 배양을 성장

백 희석 배양 1:100 ~ 250 ml의 신선한 미디어 및 0.7-0.8의 OD600으로 성장합니다. 물에 6 % 나트륨 도데실 황산염 (SDS)의 용액을 준비합니다.

주의: SDS 분말은 위험합니다 - SDS 분말을 흡입하지 마십시오. 코와 입에 마스크를 착용하십시오.

2. 1 일 - 세균 배양은 하루 와 하룻밤 동안 수행됩니다

  1. 희석 된 문화가 성장하는 동안, 1 L 비커에 뜨거운 접시에 끓는 물 목욕을 설정합니다. 물이 끓으면 6% SDS6 ml를 50ml 폴리프로필렌 튜브에 넣고, 각 튜브에 작은 교반 바를 추가하고, 튜브 뚜껑을 손가락에 고정하고, 튜브를 수조에 넣고, 뜨거운 접시에 500 rpm으로 저어줍니다.
  2. 실온에서 10분 동안 5,000g의 × 250ml 배양을 수확하고 3ml의 매체 또는 1x 인산완충식식염으로 펠릿을 재보습하십시오. 천천히 파이펫 셀 서스펜션은 6%의 끓는 SDS로 50ml 튜브로 천천히 피펫 을 사용하여 세포를 lyse(최종 농도 4% SDS)하고 튜브는 끓는 물 욕조에 침수되고 뚜껑을 손가락으로 닫습니다. 셀 서스펜션은 다시 중단되면 끓는 SDS로 신속하게 전달되어야 합니다. 이 세포 벽 구조의 잘못된 변경을 일으킬 수 있기 때문에 갑작스런 환경 변화를피해야한다.
  3. 끓는 수조를 덮고 세포가 3 시간 동안 끓여 서 수위를 주기적으로 확인하고 필요한 경우 수조를 다시 채울 수 있습니다. 3 시간 후, 핫 플레이트의 발열체를 끄고 500 rpm에서 밤새 저어계속합니다.

3. 2일차 - 효소 소화는 하루 동안 수행됩니다.

  1. SDS가 하룻밤 사이에 50ml 튜브에 침전된 경우 수조를 1-2시간 더 끓이십시오. 60 °C에 열 블록을 켭니다. 10mM Tris-HCl(pH 7.2) + 0.06% w/v NaCl에서 Pronase E의 1 mg/ml 스톡을 준비하고 최소 30분 동안 60°C에서 Pronase E를 활성화시합니다.
  2. 400,00 ×0 g의 초원심분리기를 사용하여 실온에서 20분 동안 샘플을 회전시켜 큰 PG 폴리머를 펠릿하고 다른 세포 성분으로부터 정화합니다. 주체를 조심스럽게 제거한 다음 각 펠릿을 실온 초순수물로 재보펜합니다. 참고: 재서스펜션 볼륨은 사용되는 초원심분리기 튜브의 부피에 따라 달라집니다. 튜브의 최대 부피를 초과하지 는 않지만 튜브를 절반 이상 채우는 부피를 사용합니다. 물이 재서스펜션 중에 거품을 형성하지 않을 때까지 원심분리/세척을 반복하여 SDS가 완전히 제거되었음을 나타냅니다(일반적으로 세 개의 세척). 이는 사쿠리가 함께 뭉쳐 있음을 나타내므로 백색 침전물 형태가 형성되면 펠릿 세척을 중단합니다. 덩어리는 치명적이지는 않지만 덩어리는 플라스틱과 유리 제품에 매우 강하게 결합하여 큰 시료 손실을 초래합니다. 이 경우, 응집된 사쿨리 샘플을 사용하여 프로토콜을 진행한다.
  3. 마지막 원심분리/세척 단계에서는 10mM Tris-HCl(pH 7.2) + 0.06% w/v NaCl의 900 μl에서 샘플을 재연하고 이전에 작은 바늘로 상판에 구멍을 뚫은 2ml 튜브로 옮긴다. 각 샘플에 1 mg/ml 활성 Pronase E(100 μg/ml 최종 농도)의 100 μl을 넣고 2시간 동안 60°C에서 배양합니다. 다른 열 블록을 100°C로 설정합니다.
  4. 각 샘플에 6% SDS의 200 μl을 추가하여 Pronase E 소화를 중지하고 30 분 동안 100 °C 열 블록에서 샘플을 끓입니다. 다른 열 블록을 37°C로 설정하고 50mM 인산염 버퍼(pH 4.9)에서 무라아마다아제(mutanolysin)의 1 mg/ml 스톡을 만듭니다.
  5. 3.2 단계에서와 마찬가지로, 400,00 ×0 g에서 설정된 초원심분리기를 사용하여 실온에서 20분 동안 시료를 회전시키고 SDS가 완전히 제거될 때까지 실온 초순수수로 세척합니다(일반적으로 3개의 세척). 재서스펜션 부피는 사용되는 초원심분리기 튜브의 부피에 따라 달라집니다. 튜브의 최대 부피를 초과하지 는 않지만 튜브를 절반 이상 채우는 부피를 사용합니다.
  6. 마지막 원심분리/세척 단계에서는 50mM 나트륨 인산염 버퍼(pH 4.9)의 200μl에서 시료를 재중단합니다. 이 부피는 시료에서 펩티도글리칸의 양에 따라 조절될 수 있으며 종 의존적일 수 있다. 관심있는 종에 대한 HPLC 분석의 이전에 발표 된 보고서가있는 경우,이 볼륨은 이러한 수량에 따라 추정 될 수있다 (HPLC PG 연구의 편집은 참조의 보충 정보에서 찾을 수 있습니다7). 다른 종의 경우, 타큘러스 준비는 이 단계까지 실행될 수 있고, PG가 용액에 남아 있을 수 있는 최소 볼륨을 결정하기 위해 샘플을 복제하기 위해 다양한 양의 재서스펜션 볼륨을 추가할 수 있습니다(추가 추정을 위한 토론 참조). 시료에 펩티도글리칸이 더 많이 함유되어 있는 경우, 리서스펜션 부피를 증가시키는 행위; 시료에 펩티도글리칸이 거의 없는 경우, 재서스펜션 부피를 최소 50μl로 줄입니다.
  7. 샘플을 1.5ml 튜브로 옮기고 무라아마다아제 1mg/ml를 추가하여 최종 농도를 40 μg/ml로 제공합니다. 37 °C에서 6-8 시간 또는 하룻밤을 배양하십시오.

4. 3 일 - UPLC 샘플 준비는 마지막 날에 수행됩니다.

  1. 열 블록을 100°C로 켭니다. 무라메다아제 소화를 막기 위해 SDS없이 샘플을 5 분 동안 끓입니다. 원심분리기 샘플은 실온에서 16,000 g에서 10분 동안 ×, 수퍼나티(muropeptides는 이제 용해성)에서 13mm x 100mm 유리 튜브로 이송합니다. 가능한 한 많은 상체를 복구하려고, 그것을 방해하지 않고 펠릿에 매우 가까이 점점.
  2. 100mM 붕산염 버퍼의 최종 농도를 위해 500m borate 버퍼(pH 9)를 샘플에 추가하여 pH를 조정한다. 붕산 완충제는 감소제 인 보하이드라이드 나트륨과 호환됩니다. 각 샘플을 줄이고 실온에서 적어도 30 분 동안 반응을 진행할 수 있도록 1-2 알갱이를 보로 하이드라이드 나트륨을 추가하십시오. 주의: 보하이드라이드 나트륨은 반응성이 매우 높고 취급하기에 위험합니다 - 피부와의 접촉을 피하고 (장갑을 착용)하고 눈과의 접촉을 피하십시오 (안전 안경 착용).
  3. pH 표시기 종이로 측정된 바와 같이 pH 6까지 20 μl 증분을 사용하여 pH 3-4(무로프타이드 등산지점은 ~3.5)로 샘플을 조정한 다음 2μl 증분을 사용합니다. 주의: 정형외과는 부식성이며 취급이 위험합니다 - 피부와의 접촉을 피하고 (장갑을 착용)하고 눈과의 접촉을 피하십시오 (안전 안경 착용). 시료는 정형 외과 산의 첨가에 대한 응답으로 거품이 있어야합니다; 샘플이 버블링을 중지하면 일반적으로 6의 pH에 도달했음을 나타냅니다. 시료에서 버블링이 발생하지 않으면, 이것은 추가된 borohydride 나트륨의 양이 너무 작다는 것을 나타낼 수 있습니다. 이 경우 pH 를 낮추는 것을 멈추고, 조심스럽게 1~2개의 알갱이를 추가하여 5-10분 동안 반응한 다음 pH 조정을 재개합니다.
  4. 0.22 μm 주사기 필터를 통해 샘플을 UPLC 바이알로 직접 필터링합니다. 침전소가 형성된 경우 튜브를 여러 번 가열하여 필터를 통과합니다. 샘플이 하루 내에 UPLC 기기에 주입되지 않으면 하룻밤 사이에 -20 °C에서 동결하십시오. 샘플은 -80°C에서 최대 1년 동안 보관할 수 있습니다. 샘플을 여러 번 화염을 통과하여 해동 할 수 있습니다.
  5. C18 1.7 μm 반전 상 열과 202-208 nm를 모니터링하도록 설정된 흡광도 검출기가 장착된 UPLC 기기에 각 샘플의 10 μl을 주입합니다. 샘플은 순차적으로 주입되지만 자동 샘플러 기능을 통해 최대 96개의 샘플을 일괄 처리할 수 있습니다. 50mM 나트륨 인산염(pH 4.35) + 0.4% v/v 나트륨 아지드용매A용, 75mM 나트륨 인산염(pH 4.95) + 15% v/v 메탄올용 용매 B. 참고: 아지드 나트륨을 사용하여 205nm의 나단흡수를 방지한다. 흐름을 0.25 ml/min으로 설정하고 25분 이상 선형 그라데이션을 사용하여 100% 용매 B및 30분 이내에 무로프타이드의 순차적 용출을 달성합니다. 질량 분광법이 UPLC 후 무로프프티드를 특성화하는 데 사용되는 경우, 분수 수집기에 대한 관심피크의 일부를 수집하고 원심 증발기를 사용하여 분수를 건조시.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

결과

도 1에설명된 절차를 사용하여 최종 샘플은 UPLC 바이알(Step 4.4)으로 직접 필터링된 명확한 용액의 최소 200μl로 구성되어야 합니다. 세균 샘플에서 다양한 무로프티드의 UPLC 분리는 액체 이동 상과 컬럼의 고정 단계 사이의 상대적 용해도에 의존한다. 반전 단계 C18 컬럼은 소수성 및 크기8에기초하여 무로프타이드 종을 분리하기 위해 강하게 소수성 매트릭스를 제공한다. 극성, ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

토론

이 절차의 중요한 단계는 샘플 준비 둘째 날의 3.1 단계입니다. SDS가 하룻밤 사이에 침전되었거나 실온에서 몇 주 동안 4% SDS에 샘플을 저장한 경우 샘플을 SDS를 재해석하려면 최소 1시간 동안 다시 끓여야 합니다. SDS 강수량의 일반적인 원인은 칼륨 염을 가진 매체의 사용입니다, 그래서 칼륨은 가능하면 매체에서 피해야한다. 대표 결과 섹션에서 언급했듯이, 또한 pH를 점동점(~3.5)의 등전점 내에서...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

공개

이 기사의 생산 비용은 워터스 코퍼레이션이 후원했습니다.

감사의 말

이 작품은 NIH 디렉터의 새로운 혁신상 DP2OD006466(K.C.H.)의 지원을 받았습니다. 저자는 방법의 실질적인 데모와 과학적 토론에 대한 러셀 몬즈 감사.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Pronase EAmrescoE629
Mutanolysin from StreptomycesSigma-AldrichM9901
Sodium borohydride (NaBH4) Sigma-Aldrich452882Sodium borohydride is highly reactive and dangerous to handle
Orthophosphoric acid Sigma-Aldrich79607Orthophosphoric acid is corrosive and dangerous to handle
Boric acidSigma-Aldrich31146
Sodium azideSigma-AldrichS2002Sodium azide is a poison
Sodium tetraborateSigma-Aldrich221732
Millex 0.22 μm syringe filtersFisherSLGVR04NL
pH strips (pH range 0-6)FisherM95863
50 ml polypropylene Falcon tubesVWR21008-951
13 mm x 100 mm glass tubesKimble Chase60CM13
12 mm x 32 mm screw neck glass recovery vialWaters186000327C
Sodium Dodecyl SulfateAmbionAM9820SDS powder is hazardous
Instrumentation
Waters Acquity UPLC H-Class system, including:
Acquity UPLC H-Class Sample Manager FTN
Acquity UPLC H-Class Quaternary Solvent Manager
Acquity UPLC BEH C18 1.7 µm column
Acquity UPLC PDA Detector
Waters Fraction Collector III
Acquity UPLC 30 cm Column Heater/Cooler

참고문헌

  1. den Blaauwen, T., de Pedro, M. A., Nguyen-Disteche, M., Ayala, J. A. Morphogenesis of rod-shaped sacculi. FEMS Microbiol. Rev. 32, 321-344 (2008).
  2. Holtje, J. V. Growth of the stress-bearing and shape-maintaining murein sacculus of Escherichia coli. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62, 181-203 (1998).
  3. Typas, A., Banzhaf, M., Gross, C. A., Vollmer, W. From the regulation of peptidoglycan synthesis to bacterial growth and morphology. Nat. Rev. Microbiol. 10, 123-136 (2011).
  4. Vollmer, W., Blanot, D., de Pedro, M. A. Peptidoglycan structure and architecture. FEMS Microbiol. Rev. 32, 149-167 (2008).
  5. Davis, K. M., Weiser, J. N. Modifications to the peptidoglycan backbone help bacteria to establish infection. Infect. Immun. 79, 562-570 (2011).
  6. Healy, V. L., Lessard, I. A., Roper, D. I., Knox, J. R., Walsh, C. T. Vancomycin resistance in enterococci: reprogramming of the D-ala-D-Ala ligases in bacterial peptidoglycan biosynthesis. Chem. Biol. 7, 109-119 (2000).
  7. Desmarais, S. M., De Pedro, M. A., Cava, F., Huang, K. C. Peptidoglycan at its peaks: how chromatographic analyses can reveal bacterial cell wall structure and assembly. Mol. Microbiol. 89, 1-13 (2013).
  8. Glauner, B., Holtje, J., Schwarz, U. The Composition of the murein of Escherichia coli. J. Biol. Chem. 263, 10088-10095 (1988).
  9. Glauner, B. Separation and quantification of muropeptides with high-performance liquid chromatography. Anal. Biochem. 172 (2), 451-464 (1988).
  10. Joseleau-Petit, D., Liebart, J. C., Ayala, J. A., D'Ari, R. Unstable Escherichia coli L forms revisited: growth requires peptidoglycan synthesis. J. Bacteriol. 189, 6512-6520 (2007).
  11. Hakenbeck, R., Holtje, J. V., Labischinski, H. The target of penicillin: the murein sacculus of bacterial cell walls architecture and growth. , Walter De Gruyter Incorporated. (1983).
  12. Boylen, C. W., Ensign, J. C. Ratio of teichoic acid and peptidoglycan in cell walls of Bacillus subtilis following spire germination and during vegetative growth. J. Bacteriol. 96, 421-427 (1968).
  13. Sutow, A. B., Welker, N. E. Chemical composition of the cell walls of Bacillus stearothermophilus. J. Bacteriol. 93, 1452-1457 (1967).
  14. Wang, W. S., Lundgren, D. G. Peptidoglycan of a chemolithotrophic bacterium, Ferrobacillus ferrooxidans. J. Bacteriol. 95, 1851-1856 (1968).
  15. de la Rosa, E. J., de Pedro, M. A., Vazquez, D. Penicillin binding proteins: role in initiation of murein synthesis in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 5632-5635 (1985).
  16. Kandler, O., Schleifer, K. H., Dandl, R. Differentiation of Streptococcus faecalis Andrewes and Horder and Streptococcus faecium Orla-Jensen based on the amino acid composition of their murein. J. Bacteriol. 96, 1935-1939 (1968).
  17. Kumar, A., Saini, G., Nair, A., Sharma, R. UPLC: a preeminent technique in pharmaceutical analysis. Acta Poloniae Pharmaceutica. 69, 371-380 (2012).
  18. Wilson, I. D., et al. High resolution "ultra performance" liquid chromatography coupled to oa-TOF mass spectrometry as a tool for differential metabolic pathway profiling in functional genomic studies. J. Proteome Res. 4, 591-598 (2005).
  19. Wieser, A., Schneider, L., Jung, J., Schubert, S. MALDI-TOF MS in microbiological diagnostics-identification of microorganisms and beyond (mini review). Appl. Microbiol. Biotechnol. 93, 965-974 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

재인쇄 및 허가

JoVE'article의 텍스트 или 그림을 다시 사용하시려면 허가 살펴보기

허가 살펴보기

더 많은 기사 탐색

83

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

개인 정보 보호

이용 약관

정책

연락처

사서에게 추천하기

JoVE 뉴스레터

연구

교육

저자

사서

JoVE 소개

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. 판권 소유