Nanopodia - 세포 이동 및 세포 간 상호 작용의 역할로 얇고 깨지기 쉬운 막 계획

요약

Nanopodia 셀의 전면을 선행 또는 후행 후면에서 100 μM까지 확장하고 세포 환경을 감지 얇고 깨지기 쉬운 막 채널입니다. 37 ° C에서, 부드러운 세정, 에탄올, 메탄올, 아세톤과 같은 유기 용매의 방지에 높은 트리톤 X-100 농도의 직접 고정 이러한 세포 구조를 관찰해야합니다.

초록

문화에 부착 세포 이동 및 세포 간 상호 작용을 지원하기 위해 편광 상태를 유지한다. Nanopodia는, 얇은 긴, TM4SF1 (횡단-4-L-여섯 가족 1) 면역 형광 염색을 통해 시각화 할 수있는 내피 세포와 암 세포에서 주로 F-액틴 음성 막 전망이다. 100 ~ 300 μm의 직경 TMED에서 TM4SF1 클러스터 많은 14 개별 TM4SF1 분자에 3을 포함 (TM 4SF1 전자가 마이크로 D omains을 nriched). TMED는 1 μ의 m 당 TMED 3 단단히 행렬에 nanopodia 앵커의 일정한 간격으로 nanopodia 따라 간헐적으로 배치되어있다. 이 편광 내피 또는 종양 세포의 전면을 선행 또는 후행 후면에서 100 개 이상의 μ m를 확장 할 nanopodia을 가능하게하고, MATR에 남아 수 막 잔류의 원인이IX 세포가 멀리 이동하면. TMED 및 nanopodia 때문에 자신의 극단적 인 취약성 및 온도에 대한 민감도 간과되었다. 일상적인 세척 및 고정이 구조를 방해. Nanopodia는 염색 전에 0.01 % 트리톤 X-100에 대한 간단한 노출 한 후, 37 ° C에서 파​​라 포름 알데히드 (PFA)에 직접 고정하여 유지됩니다. 세포 생물학의 새로운 풍경을 열어 Nanopodia : 그들은 감지하고 거리에서 다른 세포를 식별, 가까운 접촉에서 세포 간 상호 작용을 시작하고, 운동 확산에 관련된 신호 전달 메커니즘, 세포가 자신의 환경을 감지하는 방법에 대한 우리의 이해를 바꿀, 세포 약속 세포 통신. TM4SF1 파생 nanopodia을 연구 개발하는 방법은 고전적인 tetraspanins, 특히 재하 표현 CD9, CD81, 및 CD151의 기관을 통해 다른 세포 유형에 형성 nanopodia의 연구에 유용 할 수 있습니다.

서문

운동을위한 편광 동안, 동물 세포는 filopodia, lamellipodia는 후퇴 섬유, 프릴 ¹ 포함한 표면에서 동적, 막 돌기의 다양한 확장합니다. 최근이 목록에 추가 nanopodia, 얇은의 새로 인식 형 (직경 100 ~ 300 μm의), 같은 filopodia 같은 F-액틴 구조의 확장을위한 막 채널을 제공 연장 (최대 50 ~ 100 μm의 길이) 막 투영했다 과 후퇴 섬유, 그리고 얼룩 긍정적 TM4SF1 (횡단-4-L-여섯 가족 1) 배양 된 내피 세포와 종양 세포 ^2,3에와.

TM4SF1 원래 분자가 내피 세포의 증식과 이주 ^2,3에서 필수적인 역할을 내피 세포 바이오 마커이다 발견하기 전에 종양 세포 항원 ⁴ 알려진 tetraspanin 같은 토폴로지 단백질이다. 면역 형광 염색 TM4SF1가 perinuc하는 지역화 된 것으로 나타났다리어 소포와 세포막에, 그리고는 TM 4SF1 전자 nriched 마이크로 D omains (TMED)에 충실. TMED 앵커 매트릭스 nanopodia 및 nanopodia 1-3 TMED / μm의 길이의 정기적 간격 줄무늬 패턴에 존재. Nanopodia는 일반적으로 세포의 주요 전방에서 연장 운동을위한 세포 편광 동안 뒤 후행. 때문에 TMED의 회사 부착 특성으로 nanopodia는 멀리 이동할 때 셀에 다시 철회 할 수 없습니다; 버려진 nanopodia 잔기 따라서 셀룰러 이동 경로를 추적. F-액틴 확장과 후퇴 막 채널을 제공하고, 세포 간 상호 작용 및 통신 ^2,3의 사이트는 Nanopodia. 이러한 특성은 세포의 양극화, 환경의 휴대 감지, 세포 운동의 경로와 방향을 결정하고, 세포 간 상호 작용을하는 동안 F-액틴 어셈블리를 기본 메커니즘을 연구 할 수있는 독특한 기회를 제공 nanopodia 의미차 통신.

때문에 TMED의 소수성이 강한 성격과 nanopodia의 얇고 깨지기 쉬운 막 자연에 특별한주의는 TMED 및 nanopodia을 유지하기 위해 수행해야합니다. nanopodia 및 일반 실험실 방법으로 TMED 제거의 파괴는 예순셋 출판물은 ¹⁹⁸⁶ 년에 처음 발견 이후와에 100 ~ 300 μm의 마이크로 도메인에서 TM4SF1 농축 지식의 완전한 부족 TM4SF1에 출연 한 이유 가능한 이유 세포 표면 ^{2009/05/02에있는} 내피 세포에서 TM4SF1의 보고서까지.

기존의 면역 염색 방법은 일반적으로 세포를 고정하고 세포에게 ⁵ 투과 0.1 % 이상 트리톤 X-100의 농도를 사용하는 에탄올, 메탄올, 아세톤과 같은 유기 용매를 사용합니다. (내가) 37 ° C 4 % PFA를 사용하고 37 세포를 수정 : 여기에 설명 된 연구는 TMED 및 nanopodia가 공개하는 종래의 방법으로 세 가지 주요 변경 사항을 구현76, C 인큐베이터, (II) 부드러운 실내 온도 PBS 세척을 적용, 그리고 (iii) 트리톤 X-100은 트리톤 X-100 0.03 %보다 높은 추출하므로, 일차 항체를 첨가하기 전에 세포를 투과하기 위해 잠깐 동안 만 0.03 % 이하를 사용 TM4SF1.

모든 tetraspanins는 세포막 ⁰⁶ 마이크로 도메인을 형성하고 일부는 내피 세포 및 종양 세포에서 ^2,3 TMED로 colocalize. CD9, CD81, CD151과 같은 tetraspanins이 재하 표현되는 바와 같이, 여기에 기재된 염색 프로토콜 nanopodia 기능 연구에 TM4SF1 부족 많은 다른 세포 유형으로 확장 될 수있다.

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프로토콜

1. 콜라겐 코팅 유리 디스크에 세포 배양

1. 유리 항아리 (4온스) 및 디스크를 살균하는 오토 클레이브에 넣고 유리 디스크 (직경 12mm).
2. 50 ML 팔콘 튜브에 25 ㎖의 70 % 에탄올을 넣고 세포 배양 후드에 배치합니다. 용액의 레벨이 20 ㎖로 떨어질 때까지이 솔루션은 여러 번 재사용 될 수있다.
3. 유리 디스크를 처리 할 수​​ 있도록 사용하기 전에 5 분 동안 70 % 에탄올에 엑스트라 파인 지점과 날카로운 집게를 놓습니다.
4. 조심스럽게 튜브의 집게를 제거하고 뚜껑을 부드럽게 2 분 동안 건조한 공기 튜브의 상단에 에탄올 처리 집게를 배치합니다. 집게의 끝이 후드에 아무것도 만지지 않도록하십시오.
5. 유리 항아리 하나 멸균 유리 디스크를 잡아 24 웰 세포 배양 접시의 우물에 배치하는 멸균 집게를 사용합니다. 우물의 원하는 번호가 디스크로 채워 될 때까지 반복합니다.
6. 소 콜라겐 용액 500 μl를 (넣어50 NG / ML) 유리 디스크를 포함하고 적어도 30 분 동안 37 ° C, 5 % CO ₂ 세포 배양 인큐베이터에 배치 각 웰에. 더 이상 배양에 해가 없습니다.
7. 수확 HUVEC (사람의 제대 정맥 내피 세포) 또는 PC3 이미 트립신 통해 150mm 세포 배양 접시에서 성장 및 그 완전 배지를 사용하여 트립신 활성을 차단 하였다 (전립선 종양 세포). 15 ML 팔콘 튜브에 세포를 수집합니다.
8. 세포 수를 계산하고 생존 능력이 90 % 이상 있는지 확인합니다.
9. 4 ℃에서 10 분 동안 200 XG에서 원심 분리하여 세포 펠렛 뜨는을 제거합니다.
10. 10 ¹⁰⁵ 세포 / ㎖로 희석하여 세포 배양 배지를 사용한다. 얼음에 세포를 놓습니다.
11. 세포 배양 후드에 콜라겐을 대기음 부드럽게 유리 디스크가 콜라겐 예비 코팅 된 잘 각각의 세포 현탁액 500 μl를 놓습니다. 24 - 웰 플레이트에 5 × ¹⁰⁴ 세포 / 웰의 60 %에게 컨퍼런스을 줄 것이다HUVEC과 PC3 세포에 대한 30 %의 포화 상태에 대한 luency. 참고 : 높은 세포 밀도에 대한 더 많은 세포 현탁액을 추가합니다.
12. 문화 37 ° C, 1 시간, 2 시간, 4 시간, 6 시간, 또는 nanopodia 활동과 세포 통로를 추적하는 24 시간 동안 5 % CO ₂ 배양기에서 세포. 전형적으로, 세포는 처음 30 분에 유리 디스크에 부착하고, 그 후에 편광 및 제 시간에 마이그레이션 시작하고, 다음 시간에 세포 간 상호 작용 및 세포 분열을 수행한다.

2. 셀 고정

1. 각 웰은 세포를 해결하기 위해 500 ㎕의 4 % PFA (파라 포름 알데히드)가 필요합니다. 상업적으로 제조 또는 갓 4 % PFA 사용할 수 있습니다 만든 하나. 제조 웰의 수에 기초하여 필요한 PFA의 양을 계산하고, 15 ㎖의 팔콘 튜브에 PFA를 배치. 주의 : 파라 포름 알데히드는 발암 물질로 의심입니다.
2. 37 ° C의 배양기에서 장소에 이미 스티로폼 스탠드 팔콘 튜브를 넣어. 전쟁 30 분 동안 인큐베이터에서 튜브 남기기37 ° C.에 PFA를 해요
3. 문화 후드에 전기 패드를 배치하고 전원을 켜십시오.
4. 24 웰 세포 배양 플레이트와 인큐베이터 밖으로 데워진 PFA를 꺼내 가열 패드에 올려 놓습니다.
5. 우물에서 매체를 대기음 한 손을 사용 후 즉시 부드럽게 잘 가장자리를 통해 우물에 500 ㎕의 PFA를 슬라이드에 다른 손을 사용합니다. 쉽게 흡입의 경우, 그 각도에서 안정되도록 스티로폼 스탠드에 기대어, 약 45 ℃에서 배양 접시를 기울이십시오. 이는 흡입 및 배양 세포를 방해하지 않고, 우물 PFA 용액을 첨가를 촉진 할 것이다. 이것은 세포 활동의 일본어 셀룰러 구조를 보존하기 위해 가장 중요한 단계이다.
6. 유리 디스크를 모두 우물 PFA를받을 때까지이 과정을 반복합니다. 참고 : 우물에서 기존 솔루션을 변경하는 데 필요한 모든 단계를 같은 포부 절차를 적용합니다.
7. 5 분 동안 37 ° C에서 접시를 놓습니다.
8. 다시 문화 후드에 접시를 가지고 단계 2.5에 설명 된대로 스티로폼에 기울이십시오. 부드럽게 수집 관으로 우물에서 PFA를 전송 한 손을 사용하여; 이후에 즉시 잘 적어도 500 ㎕의 방 온도 PBS를 배치 할 다른 손을 사용합니다. 모든 우물 세척 한 후, 돌아가서 잘 때마다 한 번 더 PBS 세척을 반복합니다. 유해 폐기물 용기에 수집 된 PFA를 비 웁니다.
9. PBS로 2 % 소 태아 혈청을 추가하여 ICC 차단 버퍼를 준비합니다. 0.04 % 소듐 아 지드 (20 % 원액으로부터 희석) 방부제로서 첨가된다. 주의 : 아 지드 화 나트륨은 독성 화합물이다. 버퍼는 세균 오염없이 장기간 동안 39 ° C에서 저장 될 수있다.
10. 여전히 서로 잘 PBS를 제거하는 흡입하고 그 후 즉시 ICC 차단 버퍼 500 μl를 추가하는 순환 다시 한 번, 스탠드를 기울이면 배양 접시. 세포는 이제 면역 형광 염색을위한 준비가되어 있습니다. 필요한 경우,고정 된 세포는 TM4SF1 단백질의 상당한 손실없이 일주일 동안 4 ° C의 냉장고에 저장 될 수 있습니다.

3. Nanopodia의 TM4SF1 면역 형광 염색법

1. 각 웰에서 트리톤 X-100, 0.01 %를 함유하는 새로운 블로킹 완충액 500 μL의 ICC 블로킹 버퍼를 교체하고 실온에서 1 시간 동안 앉아 보자. 이 세포막에서 TM4SF1가 제거됩니다로 0.03 % 트리톤 X-100보다 더 높은 사용하지 마십시오. 염색은 바로 시작할 준비 경우 PBS 단계 2.10에서 세포를 세정 직접 트리톤을 함유하는 블로킹 버퍼에 이동 될 수있다.
2. ICC 차단 버퍼에 0.5 ㎍ / ㎖의 1 차 항 TM4SF1 (또는 항-CD9) 항체를 희석.
3. 각 웰에 ICC/0.01 % 트리톤 버퍼를 제거하고 방지 TM4SF1 - 항체 용액 300 μL로 교체합니다. 실온에서 2 시간을 품어 또는 4 ℃에서 하룻밤 남겨
4. 더 적은 500보다 μL PBS로 각 잘 씻으십시오. 3 회 반복; 마다 르에 제공배양 시간의 AST 5 분.
5. 에있는 이차 항체와 phalloidin도 솔루션을 준비 ICC 알렉사 488 표지 당나귀 항 마우스 이차 항체 (2 ㎍ / ㎖의 최종 농도)의 1000 배 희석 및 phalloidin도 1000 X 희석 (50 NG / ML 최종 농도)를 사용하여 버퍼를 차단.
6. PBS를 제거하고 각 웰에 차 항체 및 phalloidin도 용액 300 μl를 추가하고 2 시간 동안 배양 또는 4 ℃에서 하룻밤 남겨
7. 세척 당 적어도 5 분의 배양과 PBS 세척 단계를 반복합니다. 마지막 세척에서 1 시간 동안 PBS에서 잘 각을 둡니다.
8. 유리 슬라이드에 방지 페이드 설치 미디어의 한 방울 (~ 10 μl를) 삭제합니다.
9. 벤드 하드 표면에 부드럽게 눌러 주사기 바늘 90 °에서 19 G 1 ½의 끝. 굽​​은 바늘을 잡고 조심스럽게 우물에서 유리 디스크를 들어 올린 날카로운 집게를 사용하여 디스크를 파악하기 위해 다른 손을 사용하여 한 손을 사용합니다.
10. 유리 디스크 및 회전# 160; 유리 슬라이드에 세포 측 콘택트 설치 미디어를주는 얼굴을 아래로. 부드럽게 유리 디스크를 배치하고 상온에서 어두운 곳에서 하룻밤 건조 할 수 있습니다.
11. 이미지에 대한 면역 형광 염색 nanopodia를 진행, 또는 -20 ℃에서 슬라이드 상자에 슬라이드를 저장 슬라이드는 -20 ° C에서 몇 달 동안 볼 수 유지됩니다

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결과

1 단계의 경우 :

(예 : HUVEC과 본 연구에서 사용 된 PC3 등) 세포가 정상적으로 성장 할 수있는 경우, 세포가 씨를 뿌린 후 30 분 안에 콜라겐 코팅 된 디스크에 부착 편광 곧 이후에 이동되고, 앞으로의 경로 nanopodia을 확장 할 것입니다 운동.도 1a 및도 1b는 각각 편광 및 증식 HUVEC.도 2a는 이동 상태에서 편광 PC3 세포를 도시 나타낸다.

2 단...

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토론

Nanopodia 단단히 TMED을 통해 매트릭스에 부착 환경을 감지하고 세포 간 상호 작용 ^2,3을 중재 할 수있는 편광 모바일 휴대에서 100 개 이상의 μM을 확장 할 수 있습니다 얇은 세포막 채널입니다. 그래서 제대로 잔기가 멀리 이동함에 따라 셀 남아 있는지 매트릭 밀착 Nanopodia (도 1 및 2). Nanopodia 따라서 우리는 세포가 자신의 환경을 감지하는 방법을 연구하고 세포의 이...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glass disks	Fisher Scientific	12-545-82	12 mm diameter
Glass jar	Fisher Scientific	02-912-310	Certified Clean Clear Glass Straight-Sided Jars, 4 oz
Glass slide	Fisher Scientific	12-544-1	Fisherfinest Premium Plain Glass Microscope Slides
50 ml Falcon tube	BD Falcon	352070	50 ml high-clarity polypropylene conical centrifuge tube, 16,000 rcf rating. Sterile.
15 ml Falcon tube with Styrofoam rack	Corning	430790	Corning 15 ml PP Centrifuge Tubes
Sharp forceps	Fisher Scientific	13-812-42	Dissecting Extra Fine Pointed Splinter Forceps
24-well Cell culture plate	BD Bioscience	353047	24-well Cell Culture Plate
150 mm Cell culture plate	BD Bioscience	353025	150 mm cell culture plate
19 G 1 ½ Syringe needle	BD Bioscience	309635	19 G 1 ½
Ethanol	Decon Laboratories, Inc.	2701	Decon's Pure Ethanol 200 Proof
Collagen solution	BD Bioscience	354249	Collagen I, High Concentration, rat tail, 100 mg
Trypsin/EDTA	Cellgro	25-053-CI	0.25% Trypsin-EDTA 1x
DMEM	Life Technologies	11965-092	DMEM high glucose (1x), liquid, with L-glutamine, without sodium pyruvate
10x PBS	Affymetrix	75889 5 LT	PBS, 10x Solution, pH 7.4
PFA (paraformaldehyde)	Affymetrix	19943 1 LT	4% in PBS
FBS	Sigma-Aldrich	F4135-500ML	Fetal Bovine Serum
EGM2-MV	Lonza	CC-3162	EGM-2 BulletKit, EBM-2 Basal Medium 500 ml and EGM-2 SingleQuot Kit Supplement & Growth Factors
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Triton X-100
NaN3	Sigma-Aldrich	S2002-25G	Solubilized in water. 4% stock solution and working concentration is 0.4%.
Mouse anti-human TM4SF1 antibody	Millipore	MAB3127	Epitope is located in extracellular domain
Mouse anti-human CD9 antibody	BD Bioscience	555370	Epitope is located in extracellular domain
Alexa Fluor 488 Donkey anti-mouse 2nd antibody	Life Technologies	A-21202	Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)
Phalloidin	Chemicon	90324	Rhodamine-conjugated Phalloidin
Anti-fade mounting media	Life Technologies	P-36931	ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI
70% Ethanol			17.5 ml of ethanol (200 proof) 7.5 ml of double-deionized water
10x PBS (make 200 ml)			20 ml of 10x PBS 180 ml of double-deionized water
20% Triton X-100 (make 20 ml)			4 ml Triton X-100 16 ml double-deionized water
4% NaN3 (make 25 ml)			1 g of NaN3 25 ml of double-deionized water
50 ng/ml Bovine collagen solution in PBS (make 5 ml)			Stock solution of 50 μg/ml (50 ml) 830 μl of Collagen I (3 mg) 50 ml PBS
ICC Blocking Buffer (50 ml)			49 ml PBS 2% FBS (add 1 ml) 0.04% NaN3 (add 100 μl of 4% NaN3)
ICC Blocking Buffer/0.01% Triton X-100 (make 50 ml)			50 ml of ICC Blocking Buffer 25 μl of 20% Triton X-100
HUVEC	Lonza	C2517A	www.lonza.com
PC3	ATCC	CRL-1435	www.atcc.org
Cell culture hood	NuAIRE	Nu-425-600	NU-425 (Series 60) Biological Safety Cabinet
37 °C, 5% CO2 Cell culture incubator	CellStar	QWJ300DABA	Cellstar CO2 Water Jacketed Incubator
Heating pad	K&H Manufacturing	1020	K&H Lectro Kennel Heated Pad with Free Fleece Cover (www.amazon.com)
Centrifuge	Sorvall	T6000B	Sorvall T6000 (B) Benchtop Centrifuge
Hemocytometer	Sigma-Aldrich	Z359629	Bright-Line Hemocytometer