마우스 망막을 사용하여 중추 신경계의 혈관 재생의 평가

요약

쥐의 망막은 오랫동안 뇌에 접근 창으로 인정을 받고있다. 이 기술 문서에서 우리는 허혈성 손상 후 중추 신경계 내에서 혈관 재생의 실패로 이어질 메커니즘을 연구하는 산소에 의한 망막 병증의 마우스 모델을 사용하는 프로토콜을 제공합니다. 기술 시스템은 망막과 중추 신경계 내에서 기능 혈관의 재성장을 촉진하는 전략을 탐구하는 무력화 할 수 있습니다.

초록

설치류 망막 아마도 중추 신경계 (CNS) 신경 혈관 내 상호 작용을 조사 할 수있는 가장 접근 포유류 시스템이다. 그것은 점점 인식되고 그 알츠하이머, 다발성 경화증, 혈관 손상의 근 위축성 측삭 경화증 본 요소 등 여러 가지 신경 퇴행성 질환. 또한, 소아 및 가능 연령 인구 (각각 미숙아 및 당뇨 망막 병증,)에서 실명의 가장 눈에 띄는 원인은 생리적 혈관 재성장의 혈관 변성과 실패에 의해 특징입니다. 이 기술 문서의 목적은 망막에 CNS의 혈관 재생을 연구하기 위해 상세한 프로토콜을 제공하는 것입니다. 방법은 허혈 손상 후에 혈관 성장의 실패로 이어질 분자 메커니즘을 규명하기 위해 사용될 수있다. 또한, 잠재적 인 치료 양식 건강한 혈관 plexuses을 가속화하고 복원하는 탐험 할 수있다. 연구 결과는 obtaineD 설명한 방법을 사용하여 당뇨병이나 미숙아 것과 허혈성 망막 병증에 대한 치료 적 수단을 제공 할 가능성이 CNS의 다른 혈관 질환에 유익있다.

서문

CNS의 발달, 신경, 면역 세포 및 혈관에 걸쳐 적절한 조직 관류를 보장하고 감각 정보 ^1-5의 송신을 허용하도록 현저 결합 네트워크를 확립한다. 부족한 조직의 산소 및 손상 대사 공급하고있는 혈관 시스템의 결과의 분석은 점점 더 신경 퇴행성 질환 ^(6)의 발병 기전에 중요한 기여로 인식되고 있습니다. 혈관 강하 및 뇌 내의 신경 혈관 기기의 열화는, 예를 들어, 혈관성 치매, 뇌 ^7의 흰색 물질의 혈관 병변과 동맥 및 소형 선박 ⁸ 협착 알츠하이머 질환과 관련이 있습니다. 또, 손상된 혈관 장벽 기능은 다발성 경화증 ⁽⁹⁾ 및 근 위축성 측삭 경화증 ^(10)을 올릴 것으로 생각된다.

눈부신,이 프로토콜에 설명 된 망막 모델에 직접 관련이당뇨병 성 망막 병증 ^(11)과 미숙아 망막 병증 ^(12)과 같은 ^{질병은 13} 초 혈관 변성의 위상을 특징으로한다. 신경 혈관 망막에 계속되는 허혈성 스트레스 가능성이 다시 임명하다 산소와 에너지 공급 ^{14 ~ 16에} 대한 보상 반응으로 발생한 과도하고 병적 인 혈관 신생의 두 번째 단계를 트리거합니다. 질병의 진행에 중심 허혈성 스트레스를 극복하는 매력적인 전략은 특별히 신경 망막 (그림 2와 3)의 허혈 영역에서 기능 혈관 네트워크를 복원하는 것입니다. 제어 혈관 반응을 자극하는 직관적 안티 - VEGFs 같은 항 혈관 신생 치료가 적합한 치료로 간주되는 조건으로 건너 올 수 있습니다. 그러나,이 방법의 유효성에 대한 증거가 설치된다. 예를 들어, ischem에서 "생리와 같은"혈관 재성장을 강화IC의 망막 병증은 우아 내피 전구 세포 ^(17),식이 ω-3 고도 불포화 지방산을 증가 다른 혈관 신생 인자 ^(18), 골수 전구 세포 ^(19)의 주입, NADPH 산화 효소에 의한 세포 사멸 ^(20)의 억제의 뮐러 세포 발현 된 VEGF에 의한 하향 조절 억제의 도입을 통해 입증되었습니다 산 입구 ^(21), 트립토판의 tRNA 합성 효소 ^(22)의 카르 복실 말단 단편, 그리고 glial 세포 ^(23)의 보호를위한 VEGF 또는 FGF-2의 직접적인 관리와 치료. 또한, 우리는 허혈성 망막 병증 이러한 Semaphorins 또는 Netrins 같은 고전의 연결을 유도 신호를 변조하는 망막 내에서 건강한 혈관의 혈관 재생을 촉진하고 결과적으로 병적 인 혈관 신생 ^{(24, 25)를} 감소 시킨다는 것을 증명하고있다. 직접 임상 관련성의, 전술 한 동물 연구의 몇 가지 증거를 제공하는 혈관 재 추진망막증의 조기 허혈성 단계 동안 생성 가능성이 상당히 허혈성 부담의 감소를 통해, 시력을 위협 사전 망막 신생 혈관 ^{(19), (23, 24), (26)을} 감소시킬 수있다.

기능 혈관의 재생을 자극하는 치료 전략을 고안하는 것은 혈관 생물학을위한 중요한 과제로 남아. 여기에서 우리는 망막 내 혈​​관의 재성장을 조절하는 전략을 탐구하는 산소에 의한 망막 병증 (OIR)의 마우스 모델을 사용하는 실험 시스템을 설명합니다. 스미스 등에 의해 개발 1994. ^(27),이 모델은 인간의 증식 망막 병증에 대한 프록시 역할을하며 실내 순환 O ₂ 장력 (그림에 P12까지 75 %의 O ₂ P7 마우스 새끼를 노출 이후에 새끼를 다시 도입 구성 1). 이 패러다임은 느슨하게 미숙아는 통풍이 시나리오를 모방O _2. 고농도 산소에 마우스 새끼의 노출은 망막 모세 혈관 및 미세 혈관의 변성을 유발하고, 최대 VO 영역이 후 48 시간 (P9)에 도달하지만, 일반적으로, P12에서 O ₂ 종료에 따라 평가 혈관 폐색의 재현 영역 (VO)를 산출 O ₂ ^28에 노출. 마우스에서 무 혈관의 VO 영역은 자발적으로 실내 공기에 다시 소개 다음 주에 걸쳐 재생 결국 VO 지역은 완전히 (그림 2) 다시 혈관이 있습니다. OIR을 실시 생쥐의 실내 공기에 재 도입은 일반적으로 항 혈관 신생 치료 패러다임의 효능을 결정하기 위해 평가된다 사전 망막 혈관 신생 (NV) (P17에서 최대)을 불러 일으킨다. 그것의 순수한 형태, OIR 모델은 산소 - 유도 된 혈관 변성을 평가하고 파괴 사전 망막 신생 혈관 ^29-31의 범위를 결정하기 위해 높은 재현성 및 정량화 도구를 제공한다.

CNS의 혈관 재생을 조절하는 다양한 답사의 치료 패러다임이 약물 화합물, 유전자 치료, 유전자 삭제 등의 사용을 포함하여 OIR 모델을 사용하여 조사 할 수있다. 혈관 재성장에 영향을 미칠 수있는 특정 방법의 성향은 단계별 P12 (고농도 산소 종료 후 최대 VO)와 P17 (최대 NV) 사이의 창에서 평가된다. 병적 NV의 치료 결과의 평가는 신속하고 용이하게 병렬로 결정될 수있다 철저히 스탈 및 동료 ^{30, 31에} 의해 설명되었다. 여기에서 우리는 약물 화합물, 미래의 치료제, 바이러스 성 벡터에 의해 신경 망막 내에서 생리적 재관류 술의 변조를 조사하거나 유전자 변형 또는 녹아웃 마우스에서 후보 유전자의 영향을 연구하기 위해 간단한 단계별 절차를 제공합니다.

프로토콜

윤리 문 : 모든 동물 실험은 비전과 안과 안과에서 동물의 사용 및 비전 연구 및 동물 관리의 캐나다 협의회 (ARVO) 문에 연구를위한 협회에 의해 설립 된 동물 보호 지침을 준수합니다.

1. 산소 유도 망막 병증 (OIR)

1. 기록 P0로 마우스 새끼의 생년월일.
2. 적절한 체중 범위를 보장하기 위해 O _2에 진입에 동물의 모든 무게를 기록한다. 참고 : P17의 C57BL / 6 마우스의 경우, 체중은 최대 NV ³² 5 7.5 g 사이의 범위해야합니다. 환경의 일관성을 유지하기 위해서는, (유전자 변형 마우스뿐만 아니라 마우스는 실험적인 치료를받는) 제어로 한배 새끼를 사용하는 것이 추천된다. 바이러스 성 벡터의 효과를 평가할 때, 하나는 바이러스의 굴곡 운동을 고려하고 바이러스 성 전달 형질 전환 유전자의 완전한 표현을위한 충분한 시간을 허용해야합니다. 급속하게 표현하는 바이러스이러한 제 ^{3 세대} lentiviruses ^{24, 25} 등의 ^{벡터는, 33를 권장합니다.}
3. P7 (C57BL / 6 원하는 주)과 오일 ^(27)에 대해 75 %의 O _2로 설정 산소 챔버에 어머니를 육성 CD1에서 개최 마우스 새끼. 환경 습도와 온도는 O ₂ 노출에 걸쳐 일정하게 유지되었다. 참고 : O _2의 중앙 소스를 갖추고 연구 시설에 이상적입니다 및 빈 O ₂ 탱크의 번거로운 교체를 제한 할 수 있습니다. 유전자 변형 또는 녹아웃 마우스로 작업하는 경우, 그 제어 및 실험 쥐가 동일한 균주 ^{30, 29} 내 유전 감도를 제한하기 위해 동일한 업체로부터 획득되어 있는지 확인하는 것이 중요합니다.
4. P12에서, 산소 챔버로부터 마우스를 제거하고 O ₂ 대기 온도 동물을 반환.

내부 망막에 화합물의 배달 2. 유리체 강내 주입 (WH약물 화합물 또는 재조합 단백질의 EN 평가하는 효과)

1. P14에서, 산소 2 L / 분 (또는 선택의 동물 보호위원회의 승인을 마취)의 2 % 이소 플루 란 (isoflurane)와 마우스를 마취. 마취의 효과를 확인하기 위해, 순차적 집게로 꼬리 뒷발 및 귀 핀치.
2. 배꼽에 마우스를 놓습니다.
3. 모따 인출 유리 바늘 장착 멸균 10 μL 주사기를 사용하여, 45 °로, 눈의 후방 윤부에서 조사되는 화합물 또는 비히클 (생리 식염수)을 함유하는 용액으로 1 μL의 최대 볼륨의 주입을 수행 렌즈를 피하는 각도. 주 : 뽑아 유리 바늘 에폭시 수지의 방울을 사용 주사기에 부착된다.
4. 마우스의 눈에 면봉으로 윤활유 안과 연고 (이상적으로 항생제)의 드롭을 적용합니다.
5. 어머니가 육성으로 다시 케이지에 마우스를 반환합니다. 마우스는 조심스럽게 재까지 모니터링덮여 완전히 외래.

형광 안저 촬영에 의한 선박 관류 및 장벽 기능 (무결성) 3. 평가

1. 산소 2 L / 분 (또는 선택의 동물 보호위원회의 승인을 마취)의 2 % 이소 플루 란 (isoflurane)와 마우스를 마취. 마취의 효과를 확인하기 위해, 순차적 집게로 꼬리 뒷발 및 귀 핀치. 참고 : 재생이 평가되는 경우는 일반적으로 P17에서 수행된다. 또한 테이크 아웃 분석 P19과 P21에 혈관 무결성이 시간이 지남에 보존되어 있는지 확인합니다.
2. 일단 마취, 마우스의 무게를.
3. 해부 가위로 정중선 복부 절개를합니다. 주 : 해부 악기를 정기적으로 점검하고 선명해야한다.
4. 옆으로 갈비뼈를 잘라 집게의 도움으로 흉곽을 올립니다. 주 : 심장 손상을 피하기 위하여 측방으로 가능한 한 삭감하는 것이 필요하다.
5. perip 제거한 후마음에서 heral 조직은, 지혈 겸자로 하행 대동맥 클램프.
6. 천천히 25 G 바늘을 사용하여 좌심실에 플루오 레세 인 덱스 트란을 주입. 참고 : 혈관 장벽 기능을 조사하는 경우, 70 kDa의 플루 - 덱스 트란이 혈관의 무결성이 손상 될 때이 혈관 밖으로 누출되므로 사용된다. 조사가 혈관을 캐스팅하고자하는 경우, 2 MDA의 형광 - 덱스 트란이 사용됩니다. 중요한 단계 : 1) 균질 다시 파티션, 원심 분리기 플루오 레세 인 덱스 트란을 보장하고, 상층 액을 주입, 2) 혈관 수축을 방지하기 위해, 따뜻하게 플루오 레세 인 덱스 트란 용액을 주입하기 위해, 3) 그 순환 시간해야 초과하지 4 분.
7. 운영 가위 주사 후 쥐에게 2 분 목을 벨.

4. 핵의 제거 및 눈 고정

참고 : 혈관 재생의 비율을 평가하는 경우, 첫 번째 P12에 추가적으로 P14과 P17에 망막을 수집. 샘플링 된 시점의 수를 늘재관류 ^24의 비율의보다 정확한 측정을위한의.

1. 마우스 머리를 기울이고 옆에 놓습니다.
2. 피부와 해부 가위를 사용하여 눈을 덮고있는 눈꺼풀을 제거합니다.
3. 눈 아래의 곡선 포셉을 놓고 부드럽게 시신경이 절단 될 때까지를 당기십시오.
4. 그것의 다른면에 마우스의 머리를 켜고 동일한 단계를 (4.2 및 4.3 단계) 수행합니다.
5. 정착액의 잘 침투를 보장하기 위해 30 G 바늘을 이용하여 안구의 전방에 구멍을 천공.
6. 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)를 포함하는 튜브에 눈을 옮기고, 실온에서 1 시간 동안 고정한다.
7. PFA를 제거하고 얼음처럼 차가운 PBS 용액으로 눈을 4 번 씻는다.

5. 망막 해부

1. 차가운 PBS를 포함하는 배양 접시에 마우스 눈을 놓고 실체 현미경을 이용하여 망막의 해부를 수행합니다.
2. 마이크로 해부 SCI​​와 눈 주위의 여분의 지방 / 조직을 제거ssors.
3. 마이크로 해부 가위로 각막을 잘라.
4. 포셉 두 쌍을 사용하여 미세하게 떨어져 시신경을 향해 주변의 공막을 벗겨 버린다.
5. 집게로 렌즈 (각막 아래에 흰 공을) 조이고 아이 컵에서 압축을 풉니 다. 한 지원과 같은 집게의 쌍, 그립에 다른 사람을 사용하여 조심스럽게 렌즈를 제기하고 제거합니다.
6. 작은 브러쉬 (크기 0)와 집게를 사용하여 망막의 안쪽에서 hyaloid 혈관을 분리합니다.
7. 집게를 사용하여 시신경 유두에 연결 hyaloid 선박의 번들을 제거합니다.
8. 전송 전에 염색 절차를 시작하기에 얼음에 PBS와 장소를 포함하는 2 ㎖의 마이크로 원심 튜브에 망막을 해부.

6. 망막 혈관 염색

1. 밤새 부드러운의 찬란 PBS의 커플 isolectin의 B4 (로다 민 - 렉틴 등)이 1 ㎜ _{염화칼슘을} 함유 한 용액에 4 ° C에서 진탕 해부 망막을 품어 (1:100가 2 ㎎ / ㎖ isolectin B4 용액의 희석 권장). 전체 염색 절차를 수행하는 동안, 알루미늄 호일이나 빛으로부터 보호하기 위해 불투명 호일로 튜브를 포함한다.
2. 다음 날, 염색 액을 제거하고, 실온에서 10 분 동안 PBS에서 3X 망막 씻는다.

망막 Flatmounts 7. 준비

1. 현미경 슬라이드에, 광수 쪽 아래로 망막을 전송하고 네 개의 동일한 크기의 사분면으로 망막을 분할하는 수술 메스를 사용하여 네 개의 깊은 등거리 방사상 절개를합니다. 이 이동하지 않도록 절개 동안 붓으로 망막 붙잡아.
2. PBS에 담가 두 브러쉬를 사용하여 조심스럽게 사분면의 광 수용체 측이 아래로 평평하게 사진 표백을 방지하기 위해 장착 매체에서 망막을 몰두. 조심스럽게 압력을 적용하고 공기 기포는 커버 슬립에 따라 누적되지 않도록하지 않고 장착 망막의 표면에 커버 슬립을 배치.

8. 이전 ³¹ 설명 된 이미징 및 Vasoobliteration (VO) 및 혈관 신생 (NV)의 정량화로

1. 10 배의 배율로 에피 형광 현미경으로 전체 마운트 망막의 이미지를 가져 가라.
2. 사진 편집 소프트웨어의 망막 이미지를 열고, 함께 스티치와 전체 망막 영역 및 무 혈관 영역을 측정합니다. 위치는 픽셀 단위로 표현 될 수있다.
3. 전체 망막 영역의 화소 수에 의해 무 혈관 영역에서 픽셀 수를 분할하여 VO의 정도를 결정한다.
4. 기재 ^(31)로서 전체 망막 영역의 화소 수로 NV의 픽셀 수를 분할함으로써 NV의 범위를 결정.

결과

OIR 모델은 널리 망막에 산소에 의한 혈관의 변성과 허혈에 의한 병적 인 혈관 신생을 연구하는 데 사용되며, 안구 질환 ^{27, 29, 30에} 대한 현재 사용중인 항 혈관 신생 치료의 개발에 도움이되었습니다. 이 모델을 사용하여 얻은 연구 결과는 느슨하게 증식 성 당뇨 망막 병증 및 미숙아 ^(30)의 망막 병증 등의 허혈성 망막 병증으로 추정 할 수있다.

여기에 우리가 ...

토론

허혈성 신경 조직의 새로운 건강한 혈관의 성장을 촉진하는 가장 효과적인 방법은 무엇입니까? 그것은 방해하고 혈관 재성장을 자연적으로 발생하는 가속 치료 유효합니까? 허혈성 망막 병증이나 뇌졸중과 같은 신경 허혈성 병변에서 혈관 변성 감소 된 신경 세포의 기능을 ^{35 ~ 38과} 연결되어 있습니다. 따라서 질병의 초기 / 즉시 세그먼트 동안 지역의 미세 순환을 복직, 초기 부상에 대응...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57Bl/6 mice (Other strains may be used; angiogenic response varies from one strain to the other)
CD1 nursing mothers	Vendor of choice
Operating Scissors straight	World Precision Instruments	14192
Dissecting Scissors straight	World Precision Instruments	14393
Vannas Eye Scissors	Harvard Apparatus	72-8483
Iris Forceps, curved, serrated	World Precision Instruments	15915
Brushes 362R size 0	Dynasty
Dumont Forceps #3; straight	World Precision Instruments	500338
Surgical Blade, size 10	Bard-Parker	371110
Rhodamine Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I	Vector Laboratories, Inc	RL-1102
Microscope slides	VWR	16004-368
Fluoromount G	Electron Microscopy Sciences	17984-25
Zeiss Axio Observer Z1 Inverted Phase and Fluorescence Microscope	Zeiss
Leica MZ9.5 Stereomicroscope	Leica
Fluorescein isothicyanate-dextran, 70000	Sigma-Aldrich	46945