환자와 인간의 내피 세포에서 파생 된 전립선 순환 종양 세포 사이에 E-셀렉틴 매개 상호 작용을 관찰하는 시험 관내 방법에

요약

우리의 보고서는 생리 학적 유동 조건 하에서 전립선 암의 CTC / EC의 상호 작용을 시각화하고 분석 할 수있는 독특한 방법을 설명합니다.

초록

전이는 종양 세포가 차 틈새 시장을 extravasate 및 양식에 대한 액세스를 확보함으로써, 기본 종양 intravasate 혈액 혈관과 림프 시스템에서 창고하는 과정이다. 혈액 혈관 시스템에서 종양 세포의 혈관 외 유출은 다양한 세포주에서 얻은 내피 세포 (EC에) 및 종양 세포를 이용하여 연구 될 수있다. 초기 연구는 정적 조건을 사용하여 실시되었다하지만 그것은 잘되는 EC 생리 흐름 조건에서 다르게 행동하는 것이 설명되어 있습니다. 따라서, 다른 유동 챔버 조립체는 현재의 EC와 암세포 간의 상호 작용을 연구하는 데 사용되고있다. 현재 유량 용기 어셈블리는 다른 전단 응력 조건에서 서로 다른 세포주 또는 유체를 사용하여 재현 가능한 결과를 제공합니다. 그러나, 관찰하고 종양 세포 (의 CTCs)를 순환하는 희귀 세포와의 상호 작용을 연구하기 위해, 특정 변경 내용은 기존의 유량 용기의 조립을 할 필요합니다. 의 CTCs혈액 세포의 수백만 사이 희소 세포 집단이다. 결과적으로,의 CTCs 순수 인구를 얻기 어렵다. 정상적으로 순환에서 발견 세포의 다른 유형의 CTCs 오염은 본 농축 또는 공핍 기술을 사용 불가피하다. 본 보고서에서, 우리는 형광 라벨 순환하는 전립선 암 세포에 고유 한 방법을 설명하고 자기 조립 흐름 챔버 시스템에서의 EC와의 상호 작용을 연구한다. 이 기술은 또한 전립선의 CTCs 및 또한 어떤 단백질 사이의 상호 작용을 관찰하기 위해 적용될 수있다.

서문

전이가 제대로 이해 남아있는 복잡한 여러 단계의 프로세스입니다. E-selectin/selectin 리간드 축은 혈관 내피 세포와 암세포 간의 ^1,2 차 접착제 상호 작용을 촉진함으로써 종양 전이에 중요한 역할을하는 것으로 밝혀졌다. 다른 E-셀렉틴 리간드 (들) 종양 세포 ^(3)에 의해 표현되는 반면 내피 (E)-셀렉틴은 활성화 된 내피 세포에 의해 발현 막 횡단 단백질이다. 다수의 체외 방법이 성공적으로 종양 세포와 내피 세포 사이의 E-selectin/selectin 리간드 상호 작용되는 EC ⁽¹⁾ 모델로 사용되어왔다. 이러한 상호 작용을 연구하기 위해, 다른 흐름 챔버 시스템은 혈액 혈관 시스템을 시뮬레이션하기 위해 사용하고있다. 유량 용기 어셈블리 중, 내피와 함께 병렬 플레이트 흐름 챔버 (PPFC)는 정기적으로 생체 전단 응력 조건에서 시뮬레이션 체외 모델로 사용됩니다. 이에방법, 내피는 35 mm 접시에 성장하고 단일 층을 달성 한 후, 내피는 PPFC에 부착하고 전단 응력을 기준으로 실험이 수행된다.

그러나 PPFC과 다른 현재의 시스템은 환자와 내피에서 파생 된 종양 세포 (의 CTCs)를 순환 사이의 접착제의 상호 작용을 연구하는 많은 제약을 제시 주로의 CTCs는 혈액 세포의 수백만의 사이에 순환, 기본 종양에서 흘려 세포의 희소 한 인구 때문에 (1 CTC ⁹ 혈구 열마다) ^4. 따라서, 배양 세포 라인의 무제한 공급과 달리 낮은 CTC 수는 재생 분석을위한 상호 작용을 기록하는 적절한 흐름의 채널 폭을 필요로하는, 매우 적은 희귀 CTC / EC의 상호 작용을지도한다. 환자 유래의 CTCs가 불순한 인구 때문에 또한, 따라서 식별 마커는 특정의 CTCs를 추적해야합니다. 이 문제를 해결하기 위해서, 우리는 (PCA) CT 전립선 암을 확인하는 새로운 방법을 개발CS 거의 모든 이들의 CTCs가 자신의 세포 표면 ^5,6에 전립선 특이 막 항원 (PSMA)을 표현한다는 사실을 활용하여. 이 보고서에서, 우리는 결국 전이의 메커니즘을 이해하기 위해, 내피로 전립선 CTC 상호 작용을 연구하기위한 새로운 시스템의 잠재적 인 유틸리티를 보여, 전립선 암 세포주 MDA PCa2b (MDA)를 사용했다.

우리의 방법은 생체 내 혈관 시스템 ^7-9에서 시뮬레이션 각종 전단을 기준으로 실험에 적용 할 수 있습니다. PCA CTC / EC 상호 작용을 조사 외에, 전류 흐름 챔버 시스템은 쉽게 말초 혈액 단핵 세포를 분석하거나 내피와 종양 세포의 상호 작용을 위해 구성 될 수있다. 분해 및 유량 용기의 재 조립의 용이성,하는 마이크로는 III ^(0.1) (이하 마이크로 슬라이드로 함), 관류 및 홍보를 유도하는 다른 사이토 카인과 내피를 자극에서 배양되는 EC 수 있습니다식을 otein. 또한, 배양 된 내피 같은 E-셀렉틴 및 P-재조합 단백질은 종양 세포와 상호 작용하는 마이크로 슬라이드 상에 코팅 할 수는 층류 조건 ^(10)으로 관찰 할 수있다.

프로토콜

관측 CTC - 내피 세포 상호 작용에 대한 Microslides 1. 배양 된 HUVEC

1. 조직 문화 후드에서 첫 번째, PBS 1 ㎜의 채널 폭을하는 마이크로 린스. 부드럽게 코트 50 ㎍ / ml의 피브로넥틴 (PBS에 용해 된) 1 ㎖의 루어 로크 시린지를 사용하여 200 μL와 마이크로 슬라이드.
2. 뚜껑을하는 마이크로을 덮고 30 분 동안 조직 문화 후드 내부에 보관. 마이크로 슬라이드에있는 액체의 느린 분배 채널에서 거품 형성을 방지 할 수 있습니다.
3. 따뜻한 (37 ° C) HUVEC 성장 배지 200 μl를 Perfuse (M199 미디어, 1M HEPES, 20 % FBS, 5 ㎎ / ㎖ 헤파린, 100 ㎍ / ㎖의 내피 세포 성장 인자, 및 L-글루타민)하는 마이크로 이상과 부화 실온에서 20 분. 관류하는 동안, HUVEC 세포 현탁액을 준비합니다.
4. PBS로 된 HUVEC을 씻어 RT에서 1 ~ 2 분 동안 0.05 % 트립신-EDTA를 추가합니다. 5 분 180 XG에 2 ㎖ 성장 매체에 원심 분리기 된 HUVEC.
5. neuba를 사용하여 세포 농도를 측정UER의 혈구 및 성장 매체 μL 10 ⁷ HUVEC의 cells/100를 준비합니다. 그런 다음 조심스럽게 200 μL 피펫 팁을 사용하는 마이크로의 입구에서 매체를 제거합니다.
6. 눈 높이로하는 마이크로 및 1-ML 루어 잠금 주사기를 사용 가져와 부드럽게 채널로 된 HUVEC의 준비 농도의 200 μl를 perfuse. 주의 기포 형성을 방지하기 위해이 단계에서 필요하다. 거품이 나타날 경우, 거품이 출구 채널을 입력 할 때까지 약간 긴 시간 동안 관류 유지.
7. 입구와하는 마이크로의 콘센트에 HUVEC 미디어의 동일한 볼륨 (~ 80 μL)을 넣습니다. 이는 어느 한 방향으로 세포의 유동을 방지한다.
8. 슬라이드를 커버하고 1.5 시간 동안 인큐베이터 (37 °의 C)를 유지한다.

하는 마이크로 밤새 HUVEC 문화 흐름 상공 회의소 총회의 2. 준비

1. 15 마일의 인큐베이터에서 멸균 20 ML 주사기, 여성과 남성 루어 커넥터, 튜브, 주사기 펌프를 배치N.
2. 최소한의 죽은 볼륨의 경우, 0.04 인치의 내경 튜브를 사용합니다. 작은 튜브의 직경은 거품 형성을 방지 할 수 있습니다.
3. 따뜻한 (37 ° C) HUVEC 미디어 (12 ㎖) 20 ㎖를 주사기를 채우십시오. 주사기에 커넥터와 튜브를 연결합니다. 거품을 제거합니다. 마이크로 슬라이드에이 어셈블리를 연결합니다.
4. 완전히 HUVEC 미디어와 마이크로 슬라이드의 입구를 입력합니다. 다음 마이크로 슬라이드에 커넥터에 연결된 가득 20 ML의 주사기를 가져옵니다. 부드럽게하는 마이크로에 커넥터를 연결합니다.
5. 인큐베이터에 셋업을 가지고 있으며 10 μL / 분의 전단 속도로 설정 주사기 펌프에 연결합니다. 37 ℃에서 인큐베이터에있는 세포 O / N를 남겨
6. 다음날, 마이크로 슬라이드의 유입구에 연결된 커넥터를 제거함으로써 셋업을 분해.
7. 내장 컴퓨터에 E-selectin의 발현을 상향 조절하려면 4 ML 미디어 / ㎖를 겨 (10)에서 IL-1β를 포함하는 신선한 성장 매체를 준비합니다. 10 ㎖를 주사기에 미디어를 대기음. T를 제거그가하는 마이크로의 입구에서 미디어와 슬라이드에 주사기를 연결합니다.
8. 인큐베이터에서 4 시간 10 μL / 분의 전단 속도에서 주사기 펌프를 설정합니다.

3. 안티 PSMA의 준비 (J591-488) 레이블이 전립선 암 세포

1. 된 HUVEC의 IL-1β의 배양하는 동안, 안티 PSMA의 J591-alexa488 표시 PCA 세포를 준비합니다. 1 분 동안 MDA 세포에 0.05 % 트립신-EDTA를 추가합니다. 이 세포 표면에 존재하는 글리코 펩타이드에 영향을 미칠 수있는 긴 시간 동안 트립신으로 세포를 노출시키지 않는다. 효소 자유로운 세포 해리 시약 대신 트립신 사용될 수있다. 5 분 200 XG에 원심 분리기.
2. 1 ㎖의 H / H 버퍼 (행크스 균형 소금 solution/0.1 % HSA/10 mM의 HEPES / 1 ㎜ _{염화칼슘)에} MDA 세포 펠렛을 Resuspend. 어두운 곳에서 실온에서 30 분 동안 20 ㎍ / ml로 안티 PSMA의 J591-alexa488 항체를 추가합니다. 배양 중에 세포를 재현 탁.
3. 30 분 후, 5 분 동안 800 XG에서 세포 용액을 원심 분리기. ASPI레이트 및 1 ml의 H / H 버퍼에 펠렛을 재현 탁. 표지 MDA 세포를 세어 1 × ⁶ 세포 / ml로 최종 농도를 가져옵니다. J591-488 라벨 MDA 세포와 5 ML의 주사기를 입력하고 거품을 제거합니다.

4. PCA 환자에서 안티 PSMA (J591-488) 레이블의 CTCs 풍성하게 준비

1. (구연산 나트륨을 포함하는) 파란 모자 관에서 전립선 암 환자에서 7.5 ml의 혈액을 수집합니다. 부드럽게 0.1 % BSA / 1 ㎜ EDTA / PBS에서 혈액 1:1 희석.
2. 5.3 ㎖의 피콜 - paque 플러스 50 ML 원뿔 튜브를 추가합니다. 레이어 피콜 - paque 위에 혈액을 희석. 30 분 400 XG에 원심 분리기.
3. 프리 코트의 모든 튜브 또는 팁은 2 % FBS/RPMI-1640 / 1 ㎜ 염화칼슘 ₂ / 4 mM의 _MgCl2를 표면에의 CTCs 비 특정 바인딩을 방지하기 위해 (R / S 버퍼)과의 CTCs과 접촉. 의 CTCs과 접촉 매체 및 버퍼의 4 ° C 온도를 유지합니다.
4. 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC를) 분획을 모아서30 ml의 R / S 버퍼를 포함하는 다른 50 ml의 원추형 튜브 인터페이스에서의 CTCs 함유. 8 분 400 XG에 원심 분리기.
5. 펠렛을 재현 탁하고 8 분 400 XG에서 R / S 버퍼에 다시 씻는다. 원심 분리 후, H / H 버퍼에 펠렛을 재현 탁. 어두운 곳에서 실온에서 30 분 동안 20 ㎍ / ml로 안티 PSMA J591-488 항체를 추가합니다.
6. 30 분 후, 5 분 동안 800 XG에서 J591-488 표지의 CTCs 함유 PBMC를 원심 분리. H / H 버퍼를 Resuspend. 샘플 1 ML의 주사기 (R / S 버퍼 사전 코팅)을 입력합니다.

5. 현미경의 준비, 주사기 펌프 및 유량 용기 조립

1. 거꾸로 현미경을 켜고 10X 목적에 쾰러 조명을 설정합니다. 현미경의 시료 스테이지 같은 수준의 주사기 펌프를 지참 한 DYN / ^cm이 전단 응력 (~ 10 μL / 분)로 설정.
2. 혈구 AxioVision의 소프트웨어를 엽니 다. 컴퓨터 화면에 목표를 선택한다. 새로 만들기소프트웨어의 도구 옵션에서 폴더.
3. AxioVision의에서 스마트 실험 옵션을 열고 30 분 동안 짧은 30 초 영상을 기록하는 설정을 조정합니다.
4. 실시간 형광 영상의 경우, 영상 옵션-12 밀리 초 노출, 2 × 2 빈 5 게인을 설정합니다. 이러한 매개 변수는 MRM 자이스 카메라와 비디오 프레임 속도 (~ 초당 23 프레임)에 가까운 동영상을 달성하는 데 도움이됩니다.
5. 컴퓨터 화면에 10 X의 목적에 유동 채널의 전체 너비를 시각화 C-마운트 어댑터 (0.63 xf/60 mm 인터페이스)를 사용하십시오.
6. 수은 램프를 켭니다.
7. 주사기 펌프에 주사기와 세포를 포함하는 커넥터를 놓습니다.
8. 가져 IL-1β를 인큐베이터에서 H​​UVEC를 자극. 된 HUVEC을 포함하는 마이크로의 작성 유입 채널에 커넥터를 연결합니다.
9. 튜브에 부착 된 커넥터와 콘센트 채널을 연결합니다. 을 통해 흐름을 수집하는 접시 15 ML 원뿔 튜브에 튜브를 넣어.
10. infusi를 시작합니다10 μL / 분하는 마이크로를 통해서 전달됩니다. 내피 세포 및 표시 MDA 세포 또는 표면 형광 현미경에 488 나노 필터에 따라 환자에서 파생 된 레이블의 CTCs 사이의 상호 작용을 관찰한다.
11. 30 초 짧은 영상으로 실험을 녹음을 시작합니다. 재생 분석 중에, 압연 속도를 측정. 회전 속도는 시간이 지남에 따라 셀에 의해 이동 한 거리를 나눔으로써 측정된다.

하는 마이크로의 6. 면역 염색

1. 10 분 동안 IL-1β 자극 된 HUVEC에 MDA 세포를 관류 한 후하는 마이크로의 입구와 출구에서 용지를 제거합니다.
2. 200 ㎕의 팁을 사용하여 5 분 동안하는 마이크로의 입구에 칼슘과 마그네슘을 포함하는 따뜻한 (37 ℃) PBS를 넣어. 벤치에 소품으로의 뚜껑을 사용하는 마이크로를 기울이십시오. 면역 염색 동안 모든 배양을 위해 기울어 진 위치에하는 마이크로 유지.
3. 입구에 따뜻한 2 % 포름 알데히드를 관류하여 HUVEC를 수정
RT에서 20 분 동안 품어. 5 분마다 PBS로 두 번 씻어.
4. 실온에서 10 분 동안 PBS에서 5 % BSA에 트리톤-X 100 (0.1 %)를 추가합니다.
5. 5 분마다 PBS로 두 번 씻어. 30 분 동안 PBS에서 5 % BSA로 차단합니다.
6. 차 항체 염소와 부화 방지 VE-cadherin의 (1:100)를 2.5 % BSA의 O / N로 4 ℃에서
7. 다음 날, 5 분마다 PBS로 두 번 세척한다. 45 분 동안 차 당나귀 방지 염소 647 항체를 추가합니다. 5 분마다 PBS로 두 번 씻으십시오.
8. 1 시간 동안 인간 답게 J591-alexa488 복합 항체로 실온에서 품어.
9. 5 분마다 PBS로 두 번 씻으십시오. 5 분 DAPI를 추가합니다. 5 분 동안 증류수로 세척 할 것.
10. PBS를 추가 (또는 장기 저장을 위해 MOWIOL). 공 초점 현미경으로하는 마이크로 시각화.

결과

그림 1은 마이크로 슬라이드에 내장 컴퓨터의 단일 층의 O / N 문화를 보여줍니다. 그림 1A에 스케일링은하는 마이크로의 100 %는 70 %가 10 배 목표 (그림 1B)를 사용하여 표시되는 동안 5 배 목표를 사용하여 볼 수 있음을 보여줍니다. E-셀렉틴 매개되는 상호 작용의 경우, 가장자리에서 롤링 균체 영상 기록 재생 분석을위한 마이크로 슬라이드의 70 % 이상이 가능?...

토론

인해 혈액 세포들 사이의 CTCs 낮은 숫자로, 그것은 세포의 순수로의 CTCs 모집단을 분리하는 것이 곤란하다. CTC / EC의 상호 작용을 연구하기 위해,의 CTCs 희귀하고 불순한 인구는 두 가지 주요 도전 포즈 : 혈액 세포들 사이의 CTCs) 확인을; B) CTC / EC의 상호 작용을 관찰.

혈액 세포들 전립선의 CTCs 식별 첫번째 한계를 극복하기 위해, 우리는 사실상 모든 전립?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microslide	Ibidi	80331
Fibronectin	Millipore	FC010
Plastic tubing	Cole Parmer	EW-96115-08
Male Luer adapter	GlycoTech	31-001
Female Luer adapter	GlycoTech	31-001
Syringe pump	Chemyx Inc	Fusion 100
Luer-lock syringe	BD Biosciences	309628
M199 medium	Sigma	M7653
Endothelial Mitogen	Biomedical Technologies	BT-203
HBSS	Sigma	H9269
Anti-PSMA J591-488	Weill Cornell Medical College-Lab of Urologic Oncology
Interleukin-1 beta	Peprotech	200-01B
Trypsin	Millipore	SM-2002-C
Heparin	Sigma	H-3149
HUVECs	Weill Cornell Medical College-Department of Surgery		provided by Marco Seandel
VE-Cadherin	Santa Cruz	sc-5648
10x objective	Zeiss Plan Neofluar
Enzyme free cell dissociation reagent	Millipore	S-004-C
RPMI-1640	Lonza	12-702-F
Ficoll-paque plus	GE healthcare	17-1440-02