두피의 interneurons의 하위 유형 선택적 일렉트로

요약

This procedure shows how to target interneurons in the developing mouse forebrain by means of in utero electroporation. This technique was particularly efficient to achieve selective gene expression in interneuron subtypes destined to the superficial layers of the cortex.

초록

중추 신경계 (CNS) 성숙의 연구는 신경 세포 집단의 유전자 타겟팅에 의존한다. 그러나, 특정 신경 세포 아형의 관심의 유전자의 발현을 제한하는 작업으로 인해 특정 프로모터 요소의 상대적 부족에 현저 도전 입증되었다. GABA 성의의 interneurons 광범위한 유전 적, 형태 적 다양성을 가진 신경 세포의 인구를 구성한다. 실제로, GABA 성의의 interneurons의 11 개 이상의 서로 다른 하위 유형 마우스 피질 ^한 것을 특징으로하고있다. 여기에서 우리는 GABA 성 인구의 표적으로 선택에 대한 적응 프로토콜을 제시한다. 우리는 호 메오 박스 (homeobox) 전사의 증강 요소를 사용하여 GABA 성의의 interneurons의 하위 표적으로 선택 달성 자궁 일렉트로 특정 유전자의 발현을 통해 운전 Dlx5 및 Dlx6, 초파리 말초없는 (DLL) 유전자 ^2,3의 상 동체를, 요인.

서문

대뇌 피질의 GABA 성의의 interneurons의 대부분은 중간과 꼬리 신경절 eminences (각각 MGE 및 CGE)을 명명 된이 과도 배아 구조에서 발생 ^4. Parvalbumin 및 소마토스타틴 (somatostatin) 표현의 interneurons는의​​ interneurons는 CGE에서 발생 표현 Calretinin 반면 MGE 크롬 (Cr), Vasointestinal 펩티드 (VIP) 및 Reelin (재)에서 발생. 이 interneuron 하위 유형은 자신의 생일에 의해 구별 될 수있다. MGE 파생 된 하위 유형은 배아 일 9.5 (E9.5)와 e16.5 ^5,6 사이에서 태어난다. 반면, CGE 유래의 interneurons는 생산이 E15.5 ⁶ 고점으로 E18.5 통해 E12.5에서 태어난다. 늦게 태어난 인구의 유전자 타겟팅은, 그러나, 어려운 남아있다.

쥐의 말초없는 (DLX) 유전자를 독점적으로 개발 복부 전뇌 ³ 표현됩니다. GABA 성의 선조체의 interneurons 및 투영 아니라 피질 뉴런 피라미드 세포 Dlx1 표현할초기 발달 단계 ^3에서 2,5, 6 유전자. 실제로, DLX 유전자는 모든 GABA 성 전구 세포의 MGE 및 CGE 뇌실 영역 (SVZ)로 표현된다. 이들 유전자의 발현은 postmitotic 단계 ^7-9에서 서브 타입을 선택하도록 제한된다. 이전 실험적 증거는 Dlx5 / 6 인핸서 요소가 형질 전환 마우스 모델 ^2에서 GABA 성 계통의 선택 타겟팅을 허용 것으로 나타났다. 우리는 현상 마우스 뇌에서 에피 솜 발현의 문맥에서 이들 인핸서 요소 중 하나의 사용을 시험 하였다. 우리는 최소한의 발기인 및 bluescript (BS) 백본 플라스미드의 강화 된 녹색 형광 단백질 (eGFP는) (그림 1)과 함께 Dlx5 / 6 증강 요소를 복제 서브. 우리는 선택적으로 CR-, VIP를 대상으로 E15.5에서 자궁 일렉트로에 의해 플라스미드를 도입 재는 ^3,8,10을 아류. 우리의 기술은 용이 스파 스 일렉트로, 수 있습니다그을음 세포의 형태 학적 특징의 재건입니다. 또한, 피질 GABA 성 뉴런의 유전자 발현의 예외적으로 높은 수준의 기능 연구를 허용한다. 우리는 손실과 여러 야생 유형 및 지배적 인 부정적인 유전자 ^11를 사용하여 기능 연구의 이득을 실시했다.

프로토콜

모든 동물은 의학의 NYU 학교의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 규정 및 지침에 따라 처리 하였다.

마우스 균주
코닉 의해 제공 암컷 스위스 웹스터 마우스는이 실험에 사용 하였다. 특히 표면층의 interneurons를 타겟팅하기 위하여, E15.5 태아 사용 하였다.

주 : 표준 클로닝 기술을 사용하여 생성 된 본 작업 (Dlx5 / 6.eGFP 플라스미드 3 μg / μL)에 사용 된 플라스미드. eGFP는 cDNA를 Dlx5 / 6 PMIN-polyA 플라스미드에 클로닝 하였다. 이 플라스미드를 요청 (demarn02@nyumc.org)에 따라 사용할 수 있습니다.

미세 주입 피펫의 1 준비

1. 860에 끌어 당기는 열 # 2를 설정합니다.
2. 놓고 필라멘트 근처 유리 모세관을 고정합니다. 피펫의 외경 (OD)이 약 30 μm의 있는지 확인합니다.
3. "풀"버튼을 눌러.
4. 조심스럽게 캐 필러를 제거합니다. 하단 부분은 바늘이다. 상단 부분을 폐기하십시오.

2 마취 절차

1. 이소 플루 란 수용 실을 준비합니다. 참고 : 아이소 플루 란으로 인해 자사의 빠른 동작과 부작용의 낮은 발생 빈도를 선호하는 마취제입니다. 펜 토바 비탈 다른 옵션입니다; 그러나,이 약의 허용 오차 변수 이소 플루 란보다 높은 사망률의 원인이됩니다.
2. 0.5 L / 분 _O이 4-5 %의 이소 플루 란의 흐름을 설정합니다.
3. 헤드 어댑터의 밸브가 닫혀있는 반면, 챔버의 밸브가 열려 있는지 확인합니다.
4. 챔버에 임신 한 마우스를 놓습니다.
5. 마우스를 마취의 영향 아래에 갈 수 있습니다. 이 약 2 ~ 3 분 소요됩니다. 호흡 속도를 확인합니다. 마우스가과 호흡 시작하면, 이소 플루 란의 복용량을 낮 춥니 다.
6. 마우스를 마취 한 후, 즉시 챔버에서 제거합니다. 가열 패드에 복부 측면을 놓고 전수술을 통해 이소 플루 란을 공급하기 위해 계속 마스크를 머리를 nsert. 헤드 어댑터 조각을 연결하는 튜브에 챔버에서 이소 플루 란의 흐름을 전환해야합니다. 각각의 눈에서 눈 윤활유 한 방울을 넣고 눈을 닫습니다.
7. 저체온증을 최소화하기 위해 36 ° C 정도에 전기 패드를 설정합니다.
8. 뒷발과 꼬리를 집어 발과 꼬리 반사의 부재를 확인합니다.

3 외과

1. 70 % 에탄올로 복부를 덮는 피부를 정화.
2. 위쪽으로 피부를 당겨 집게를 사용합니다. 각 수술 후 세제와 물을 모든 기기를 세척하고, 72 ° CO / N 살균.
3. 유선의 세 번째와 네 번째 쌍 사이의 중간에 시작 정중선을 따라 수직 작은 절개 (약 2 ㎝)를 확인. 미세 수술 가위를 사용합니다. 복부 벽을 손상하지 않도록주의하십시오.
4. 조심스럽게 복막으로부터 피부를 구분합니다.
5. 동맥을 시각화및 복벽에 정맥. 복강을 노출 (선박을 피) 복막을 통해 다른 2cm 수직 절개를합니다.
6. 동맥을 클램핑 피하는 양쪽에있는 피부와 복부 벽을 클램프. 주 : 동맥이 실수로 구멍이있는 경우, 자궁 경부 전위 또는 이소 플루 란 과다 복용을 수행하여 동물을 즉시 희생.
7. 37 ° C로 멸균 PBS를 따뜻하게 사전. 김 물티슈 촉촉한 PBS와 클램프를 커버.
8. PBS와 노출 복강 보습. 수술을 수행하는 동안이 단계를 여러 번 반복합니다.
9. 라운드 집게를 사용하여 부드럽게 떨어져 공간에 배아 체인 (E15.5)을 당깁니다. 물티슈의 체인 휴식을 보자. 첫번째 자궁의 절반을 노출함으로써 시작합니다. 그 안에 배아 전기 천공되면, 내부를 돌아 오게 한 후 하반기에 작동합니다.

4 일렉트로

1. 배아를 조작하는 라운드 집게를 계속 사용합니다.
2. 바이올렛측면 심실을 sualize. 중간 선 (그림 1b)을 따라 실행 측면 심실.
3. 빠른 그린 (주식을 10 % / w V) 추가 1:20 혼합물에 대한 DNA 용액에 주입하는 동안 시각화 할 수 있습니다. 증류수 표준 맥시 프렙 정제 프로토콜로부터 얻어진 펠릿을 용해시킴으로써 DNA 용액을 준비한다.
4. 빠른 그린으로 DNA 용액 (Dlx5 / 6-eGFP는, 3 μg / μL) 1 ㎖를 주입하는 플런저 미리 뽑아 마이크로 피펫을 사용합니다. 피펫을 넣기 전에 바늘의 팁 단부에 어깨의 선두로부터 6mm 길이를 남겨 미세 forcep # 5 (듀)를 마이크로 피펫의 선단을 잘라. 라운드 핀셋으로 태아의 머리를 잡아. 중간 선 근처에있는 뇌실 목표로하는 45 ° 각도로 피펫 뇌를 입력합니다. 바늘이 뇌실을 관통하는 경우가 DNA를 주입 플런저를 사용할 때, 천천히 피펫을 철회. 심실이 녹색해야 할 때솔루션을 작성하기 시작합니다. 이 시점에서, 피펫을 움직이는 멈추고 DNA 1 ㎖를 주입. 조심스럽게 피펫을 철회.
5. 950 밀리 초 간격으로 50 밀리의 오 45V 펄스 CUY21의 electroporator을 설정합니다.
6. E15.5 배아에 대한 5mm 패들 전극을 사용합니다. 효율적인 전류 전송을 보장하기 위해 PBS에 전극을 담근다.
7. DNA 솔루션을 포함하는 심실에 긍정적 인 패들과 태아의 머리 주위에 전극 패를 놓습니다. 약간 신경절 eminences을 통해 복부 전류를 만들 수있는 음의 일의 대한 긍정적 인 패를 내립니다. 이 조작은 피라미드 세포에서 이소 식을 최소화 할 수 있습니다.
8. 전극을 배치 한 후, 한 번 풋 페달을 눌러 펄스를 제공한다.
9. 전극을 제거하고 깨끗하게 닦아주십시오. 반복 각 배아와 4.6-4.9 단계를 반복합니다.
10. 모든 배아를 electroporating 후 복강에 PBS 3 ㎖를 부어 복강에 반환.
11. 제 봉합사 곡선 바늘과 5-0 실크 봉합사 후 피부 복벽. 상처에 리도카인 (4 %)을 적용합니다. 진통제 아스피린 내 복막의 120 ㎎ / ㎏을 관리 할 수​​ 있습니다.
    주 : 전체 절차는 20 분 이하로 수행되어야한다. 그것은 초보자는 짧은 수술 시간을 유지하기 위해 몇 배아를 electroporate하는 것이 좋습니다. 장시간 수술 배아의 생존율을 감소한다.
12. 마취 튜브에서 동물을 제거하고 종이에 가열 패드에 복구를 닦아 수 있습니다.
13. 케이지에 동물을 돌려 37 ° C에서 가열 패드에 그것을 유지하고 건강 상태를 모니터링 할 수 있습니다. 동물은 일반적으로 수술을 잘 견딜 그들이 마취 튜브에서 제거 된 직후 서서히 이동하기 시작합니다. 과도한 출혈이나 혼수가 관찰되는 경우, IACUC는 자궁 경부 전위 또는 마취 과다 복용으로 안락사 절차를 승인 수행하여 즉시 동물을 희생.
14. 비바에 케이지를 반환rium. 여성은 분만 자연적으로 줄 것이다.

결과

우리는 성숙 뉴런 세포 유형 특정한 타겟팅을 달성하기에 자궁 일렉트로 기법을 적응. CGE 유래의 interneurons에서 eGFP는의 발현을 구동하기 위해, 우리는 Dlx5 / 6 증강 요소를 사용 E15.5에 우리의 주사를 제한, 무대 CGE 유래의 interneurons의 대부분이 발생하는 경우. 우리는 P8에서 분석을 수행하고 P15 ⁽¹¹⁾ (도 1 및도 2). 우리는 E15.5에서 몰 농도에서 CAG-mCherry 및 D...

토론

기술의 한계

이 기술은 셀 프로세스 셀 자율적 분석이 가능하지만,이 집단 분석에 적합하지 않다. electroporations 뇌 당 electroporation하여보다 천 세포와 매우 드물다. 결과적으로, 기술은 CGE의 interneurons 유래의 유전자 조작으로 인한 행동 결과를 평가하기 위해 사용될 수 없다.

electroporations가 E13.5-E14.5 대상 MGE에서 파생 된 하위 유형에서 수행하지만, 효율이...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Electroporator  with pedal	Protech International	CUY21
5 mm paddle electrodes	Protech International	CUY650P5
Heating pad	Kent Scientific	DCT-15
Sutter Instruments P30 Puller	Sutter Instruments	3282322
Fluovac Anesthesia Systems	Harvard Apparatus	726425
Delicate Operating Scissors 4.75" Straight Sharp/Sharp	Roboz	RS-6702
5-0 Silk Black Braid 18" C-1 Box 36	Roboz	SUT-1073-21
Micro Clip Applying Forceps 5.5"	Roboz	RS-5410
2 Clamp scissors	Roboz	RC-4894
Holding forceps	Fine Science Tools	11031-15
Glass capillary tubing	FHC	27-30-0	Borosil 1.0 mm OD x 0.75 mm ID
Fast Green	Sigma-Aldrich	F7258
Sterile PBS	Life Technologies	20012-027