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요약

미세 유체 와류를 이용한 일렉트로 플랫폼은 정확하고 독립적 인 투여 량 제어와 동일한 세포 집단에 여러 분자의 순차적 전달을 위해 개발되었다. 시스템의 크기에 기초하여 목표 셀 정제 단계 이전 일렉트로 분자 전달 효율 및 처리 된 세포의 생존 능력을 향상시키는 데 도움.

초록

물리적으로 세포에 비 - 투과 외인성 분자 프로브를 도입하기위한 아주 강력한 기술이기 때문에 전기 천공은, 과거 몇 년 동안 증가 주목을 받아왔다. 이 작업은 정밀한 분자 종속 매개 변수 컨트롤과 함께 포유 동물 세포에 여러 분자 전달을 수행 할 수있는 마이크로 유체 일렉트로 플랫폼을보고한다. 균일 한 크기 분포와 세포를 분리하기위한 시스템의 능력은 주어진 전계 강도 당 전기 천공 효율 적은 편차를 허용; 따라서 샘플 생존력을 향상. 또한, 그 공정 시각화 기능 효율 향상을위한 반응계에서 프롬프트 분자 전달 파라미터 조정을 허용 실시간 형광 분자 흡수 과정의 관찰을 허용한다. 보고 된 플랫폼의 광대 한 능력을 보여주기 위해, 서로 다른 크기와 전기 요금과 거대 분자 (예를 들면, 덱스 트란은 3000 및 70000 다의 MW로)했다테스트 된 모든 분자 높은 전달 효율 (> 70 %)로 전이성 유방암 세포로 전달. 개발 플랫폼은 온 - 칩 기술은 일렉트로 유리할 수있다 연구 분야의 확장에 사용 가능성을 증명했다.

서문

최근, 세포 분자의 세포 내 전달을 용이하게하는 전기 펄스의 사용은 포유 동물 세포를 조작 매력적인 수단이되었다. 일 또한 일렉트로이라고하는이 과정은, 가역적으로 액세스하는 본래 세포막 투과성 분자를 허용 세포막을 permeabilizes 세포의 세포 적 환경이다. 거의 모든 분자 일렉트로를 이용한 세포의 모든 종류의 막으로 임시 만들어진 기공을 통해 세포질 내로 도입 될 수 있기 때문에, 기술이보고 된 것으로, 더욱 재현성 보편적으로 적용하고, 바이러스 - 매개 화학을 포함하는 다른 방법에 비해보다 효율적 세포 생존은 그대로 유지하면서, 광학 접근법. 2-3이 기술은, 형광 물질을 도입하는 약물 4 5 핵산 6-7을 이용하고있다. 이러한 이점을 감안할 때, 일렉트로는 일반적인 노동으로 채택되었다DNA 형질 atory위한 기술, 생체 내 유전자 치료 8 세포 접종 연구. 성공적인 일렉트로 필요한 전계 강도가 밀접 셀의 직경과 상관하기 때문에 종래의 전기 천공 시스템은 동시에 대형화와 이질 샘플 실용적인 효율 및 생존 가능성을 달성하는 것은 여전히​​ 그러나 어렵다. 더욱이, 이러한 시스템은 다수의 분자 양의 정밀한 제어가 벌크 스토캐스틱 분자 전달 프로세스에 대한 의존도로 인해 전달되는 것을 허용하지 않는다. 9는 이러한 문제를 해결하기 위해, 많은 그룹은, 저급 CORPORATION에서 전압의 이점을 제공하고, 미세 유체 일렉트로 플랫폼 개발 더 형질 감염 효율, 세포 사망의 큰 감소, 및 복합 분자를 제공하는 능력. 10-13 이러한 장점은 그 전극 피치 마이크로 전기 천공 시스템의 작은 풋 프린트에 의해 가능하게되었다길이 극적 성공적인 전달을 위해 필요한 전압을 감소시키는, 서브 밀리미터이다. 더욱이, 이들 마이크로 일렉트로 시스템은 전달 효율을 향상하면서 감소 된 세포 사망을 산출, 생성 된 열을 방출 빠르게 균일 한 전계 분포를 달성 할 수있다. 추가적으로 이러한 마이크로 투명 재료 사용률 프롬프트 파라미터 변경에 대한 전기 천공 과정 시츄 관찰에 있습니다. 2,12을 그러나 정확한 투여 량 제어 및 연구 및 치료 적 응용, 6 신흥 필요한 분자 - 및 세포 - 의존 파라미터 제어를, 14-16는 여전히 해결되지 못한 상태로 남아있다.

이 작업은 순차적으로 표적 세포의 미리 선택된 동일한 집단에 여러 분자를 전달할 수있는 미세 유체 와류를 이용한 전기 천공 시스템을 제공한다. 균일 한 크기 분포를 가진 세포는 이전에보고 된 실리콘을 사용하여 이전에 전기 천공 법 (electroporation)에 격리되어제 '선택적 트래핑 메커니즘. 17-18 균일 한 크기 분포, 적은 편차 일렉트로 효율 및 달성 하였다 주어진 전계 강도 당 강화 가능성을 갖는 바이. 19 또한, 연속 마이크로 와류를 사용하여 포획 세포를 교반을 통해 분자의 균일 한 전달 허용 결과와 일치하여 전체 세포질은, 이전에,이 시스템은 일반적으로 생물학적 인 응용에 이용 분자의 넓은 범위에 적용될 수 있음을 입증하기 위해. 다른 와류 이용한 일렉트로 플랫폼을 사용하여 (20)을보고로 전달 된 분자량 광범위한 고분자 전이성 유방암 세포. 또한, 실시간 프로세스 모니터링의 도움으로,이 작품은 주로 확산 매개. 14 대 전기 매개되고, electrporation 동안 분자 전달의 메커니즘에 관한 오랜 논쟁에 종지부를 찍을 더 많은 증거를 제공 다른 전기 천공 시스템과는 달리,이 플랫폼 고유 일렉트로의 정확한 멀티 분자 전달, 고분자 전달 효율, 최소의 세포 사망, 크기 및 전달 분자의 전하의 넓은 범위뿐만 아니라 실시간 시각화 결합 된 장점을 제공한다 과정. 이러한 기능을 감안할 때, 개발 된 일렉트로 시스템은 일렉트로 분자 전달 메커니즘에 대한 깊이있는 이해를 필요로하는 세포 리 프로그래밍 연구, 6,14,21-22 약물 전달 응용 프로그램 10,19 및 애플리케이션을위한 다양한 도구로 실제적인 가능성이있다.

프로토콜

1 셀 준비

  1. 접시 1 × 10 10 % (v / v) 소 태아 혈청과 1로 보충 Leibovitz의 L-15 중간에 조직 배양 용 T75 플라스크 당 10 ㎖의 부피 전이성 유방암 세포주 MDA-MB-231의 5 세포 / ml % 페니실린 - 스트렙토 마이신.
  2. 0 % CO 2 환경과 37 ° C에서 가습 배양기에서 MDA-MB-231 세포를 품어.
  3. 2 분 동안 0.25 % 트립신-EDTA로 세포를 처리함으로써 이일 파종 후 실험 수확 세포 및 성장 배지 8 ㎖에 첨가함으로써 트립신의 활성 효소를 불 활성화.
  4. 5 × 105 세포 / ml의 최종 농도 (칼슘 및 마그네슘 2 +없이 DPBS, 1X) 둘 베코 인산염 완충 식염수를 200 × g 및 재현 탁에서 5 분 동안 원심 분리하여 세포 펠렛.

2 장치 설계 및 제작

참고 : 마스크, 마스터 몰드 날조와마이크로 채널 클로징 처리는 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 미세 주조법이 일반 실험실 벤치 탑상에서 수행 될 수있는 동안 클린 룸 안에서 실시하여야한다.

  1. AutoCAD를 그림 1에 나타낸 바와 같이 미세 유체 장치를 설계합니다. 이 장치는 (L = 7mm W = 40 μm의, 그리고 H = 70 μm의) 여러 주입 포트, 거친 필터와 두 개의 평행 한 직선 직사각형 관성 중심 채널 입구로 구성되어야합니다. 개별 직선 채널은 알루미늄 전극 구멍을 통해이와 떨어져 800 μm의 배치 5 일렉트로 챔버 (W C = 400 μm의)로 구성되어 있습니다. 두 횡 방향으로 인접하는 일렉트로 챔버 음극 용 구멍을 공유한다. 두 개의 직선 채널은 일렉트로 지역의 하류에있는 콘센트에 병합합니다.
  2. LinkCAD를 사용하여 GDSII 파일에 마이크로 패턴 CAD 파일을 변환합니다. 빈 5 "× 5"포토 마스크에 미세 패턴을 작성레이저 마스크 라이터. 제조 업체의 프로토콜에 따라 마스크를 개발한다. 참고 : 마스크 개발 프로세스는 포토 레지스트 현상, 크롬 에칭 및 레지스트 제거를 포함한다. 대안 적으로, 마이크로 패턴을 고해상도 투명도에 인쇄 (> 20,000 DPI)를 타사 메이커로부터 구입하고, 포토 마스크로 사용될 수있다. 포토 마스크에 최종 마이크로 기능은 네가티브 포토 레지스트의 극성이 일치하도록 투명해야한다.
  3. 70 μM의 최종 두께를 갖도록 2000 rpm에서 4 인치 실리콘 웨이퍼 상에 네거티브 포토 레지스트를 스핀 코트 표준 소프트 리소그래피 기술 (23)을 사용하여 장치 설계의 주형을 제조.
  4. 95 ° C에서 20 분 동안 네가티브 포토 레지스트와 웨이퍼를 프리 베이킹.
  5. 웨이퍼와 마스크를 연락 마스크 얼 라이너를 사용하여 80 초 동안 UV 소스 (17.4 엠제이 / cm 2)에 노출.
  6. SU-8 개발에 4 분 동안 노출 된 웨이퍼를 개발한다.
  7. 측정표면 프로파일로 미터를 사용하여 개발 된 포토 레지스트 두께.
  8. 제 (실리콘 엘라스토머 키트) 경화 엘라스토머 1 비율 및 PDMS 복제본을 생성하는 주형에 부어 혼합물 : 엄격 10 섞는다. 30 분 동안 주조 엘라스토머를 탈기하고 2 시간 동안 70 ° C의 오븐에서 탈기 엘라스토머 주형을 경화.
  9. 핀 바이스를 사용하여 입구, 출구 및 전극 삽입을위한 금형 및 펀치 구멍에서 마이크로 패턴과 경화 된 PDMS 복제를 박리. NOTE : 핀 바이스의 통상 절삭 날 직경 단단히 대신 PEEK 튜빙 (32 분의 OD ") 및 알루미늄 전극 (0.029의 OD")를 유지하기위한 충분한 0.76 mm이어야한다.
  10. 각각 75 W, 500 mTorr로의 고주파 전력 및 산소 분압에서 7 초간 산소 플라즈마 클리너로 처리 된 유리 슬라이드에 결합 PDMS 복제본으로 둘러싸인 미세 유체 채널을 생성.

3 흐름 실험

  1. 삽입알루미늄 전극 (0.029 "OD) 및 출구 PEEK 튜빙 (32 분"미세 구멍을 통해 지정된 장소에 OD)는 (그림 3B 참조).
  2. 알루미늄 전극에 고전압 짧은 구형파 펄스를 발생하기위한 18 담당 전기 기기를 연결 PDMS 몰드에 흐르는 용액과 접촉하는 (도 3c 참조). 참고 :이 장비는 펄스 발생기 및 자체 내장 된 고전압 앰프로 구성한다 (18).
  3. (도 3a 참조) 세포 및 생체 분자와 네 개의 50 ml의 원심 개별적 DPBS를 함유하는 튜브, 용액을 준비하고, 공기 유량 제어 시스템에 연결된 각각의 바이알 홀더에 각각 끼운다. 18
  4. 미세 유체 장치의 각 입구 구멍에 유리 병 홀더에서 유입 PEEK 튜브를 연결합니다.
  5. 저런 전기를 갖기 위해 100 V로, 구형파 펄스 V의 크기를 설정LD 강도, E = V / L 전자, 전기 천공 챔버 걸쳐 0.7 kV로 / cm 동등. NOTE : 여기서, L 전자는 양극과 음극이 흐르는 용액과 접촉하는 두 점 사이의 거리 (도 1 참조).
  6. 40 PSI에 압력 조절기를 설정합니다. NOTE :. 단일 수동 조절 질소원 균일 모든 샘플 튜브를 가압하기 위해 사용되며, 고속 매니 폴드 적시 맞춤식 LabVIEW 소프트웨어를 사용하여 각각의 용액 포트를 활성화하기 위해 이용되는 18
  7. 밸브 제어의 경우, 밸브 러너 레이블 주문 제작 LabVIEW 소프트웨어를 열고 운영한다라는 제목의 드롭 다운 메뉴에서 실행을 클릭합니다.
  8. 해당하는 각 밸브 아이콘을 클릭하여 밸브를 켭니다. 참고 :이 활성화 될 때 밸브의 아이콘이 녹색으로 변합니다. 활성화 된 아이콘을 클릭하면 비활성화하고 밸브를 닫습니다. 닫힌 밸브 아이콘이 회색으로 설정해야합니다.
  9. (DPBS 저수지에 밸브를 열고즉., 1.5 분 동안 안정한 세포 트래핑 와류 발생에 필요한 주요 흐름 속도로 세정액).
  10. 30 초 (즉, 셀 - 포착 공정)를위한 전기 천공 챔버에서 트랩 세포에 세포 용액으로 세척 용액으로부터 활성 용액 포트 스위치.
  11. 용액 스위칭 단계 동안 파쇄 흐름을 보장하기 위해 셀 - 포착 단계 이전에 10 초 동안 동시에 장치를 통해 모두 세탁 셀 솔루션을 흐른다. 참고 :이 간단한 공동 흐름 단계는 각 솔루션 전환 단계를 반복해야합니다.
  12. 세척 포트 켜고 비 오염 포집 세포를 제거하기 위해 20 초 동안 세척 장치.
  13. 관심 장치로 (3000 다 중성 및 음이온 덱스 트란 분자 또는 1.5 밀리그램 / 70000 다 중성 덱스 트란 분자 ml의 0.2 ㎎ / ㎖)의 제 분자를 함유하는 용액을 주입한다.
  14. 즉시 주사 후 5 쇼트 펄스 (Δt를 2 초 간격으로 30 밀리 초 =) 적용분자 용액 및 오실로스코프를 사용하여 실시간으로 적용되는 전기 펄스의 크기 및 지속 기간을 모니터링한다.
  15. 3.10만큼 추가 분자의 수와 같은 단계를 반복 배달 할 수 있습니다. 각 분자 납기 후 분자 용액에 100 초 동안 세포를 배양한다 (100)의 과잉 물질을 제거하기위한 세척 용액으로 세척 장치.
  16. 5 이하 PSI 작동 압력을 낮춤으로써 하류 분석 용 96 - 웰 플레이트에서 세포를 릴리스. 참고 : 100 셀 솔루션의 약 100 ㎕의 각 릴리스에서 수집됩니다.
  17. 실험은 유동 세포 계측법을위한 충분한 세포를 수집하는 3.16 세 시간을 통해 3.9 단계를 실행합니다.
  18. 228 × g에서 5 분 동안 처리 된 세포를 포함하는 96 - 웰 플레이트를 원심 분리기.
  19. 초과 형광 분자를 포함하는 상층 액을 제거합니다.
  20. 유동 세포 계측법 분석을 위해 DPBS 세포를 재현 탁.
  21. 분자 U에 대한 흐름 cytometer에 로드셀효율성 분석 ptake.

결과

개발 병렬 미세 electroporator 전이성 유방암 살아있는 세포로 다양한 크기 및 전하와 거대 분자를 전달. 성공적인 전달 분자는 질적 인 시츄 electroporation하여 선회 세포의 형광 강도의 변화를 모니터링함으로써 결정과 유세포 분석을 통해 정량 측정에 의해 확인되었다. 4A가 처리 된 세포의 90 %가 중성 70000 다 덱스 트란 통풍 관 것을 보여준다. 통계적인 분석을 위해, ?...

토론

처리량 및 다중 분자 전달 효율의 새로운 병렬화 일렉트로 플랫폼, 10 배 향상된 기능을 통해 이전에 개발 된 단일 챔버 시스템이 제공하는 모든 장점에 부가하여 달성되었다. 18 이전 가능한 장점은의 (ⅰ) 전처리 정제를 포함 생존 능력 향상을위한 균일 한 크기 분포, (ⅱ) 정확한 분자량 및 개별 투여 량 조절, 및 (ⅲ) 낮은 동작 전류와 표적 세포. 그들은 분자량, 공액 형광 유형 및 전하의 ...

공개

저자가 공개하는 게 없다.

감사의 말

이 작품은 로우 랜드 주니어 펠로우 프로그램에 의해 지원됩니다. 크리스 스톡스 주문 제작, 컴퓨터를 이용한 압력 제어 설정, 박사 다이앤 Schaak의 개발에 그의 도움을 : 저자는 하버드 로우 랜드 연구소의 과학자들과 직원에게 감사의 말씀을드립니다 생물학적 시료 처리에 대한 그녀의 입력, 윈필드 힐에 대한 전기 설치, 박사 Alavaro 산체스 개발 압력 설정에 필요한 기계 배관 부품 가공에 대한 흐름 cytometer, 스콧 Bevis, 케니 스펜서 돈 로저스에 대한 액세스 권한을 부여합니다. 미세 유체 주인은 하버드 대학 나노 시스템을위한 센터 (CNS)에서 제작 하였다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
MDA-MB-231 cancer cell lineAmerican Type Culture Collection (ATCC)HTB-26
Leibovitz’s L-15 MediumCellgro, Mediatech, Inc.10-045-CV
Fetal bovine serum (FBS)Gibco, Life Technologies16000-044
Penicillin-streptomycinSigma-AldrichP4333
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS)Cellgro, Mediatech, Inc.21-030
TrypsinGibco, Life Technologies25200-056
Flow Cytometer easyCyte HTMillipore0500-4008
Oxygen Plasma CleanerTechnics Micro-RIE
Dektak 6M surface profilerVeeco
KMPR 1050Microchem
SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER KITDow Corning
Compressed Nitrogen gasAirgasNI 300
High Pressure RegulatorMcMaster-Carr6162K22
Downstream regulatorMcMaster-Carr4000K563
High-speed 3/2way-8 valve manifoldFesto
Inline Check ValveIdex Health and ScienceCV3320
5/32" OD x 3/32" ID Polyurethan tubesPneumadynePU-156F-0
1/4" OD X 0.17" ID Polyurethan tubesPneumadynePU-250PB-4
1/16" PEEK tubingsFestoP1533
1/32" PEEK tubingsIdex Health and ScienceP1569
PEEK tubing unionsIdex Health and ScienceP881
Pulse GeneratorHP8110A
Aluminum WireBob Martin Company6061 ALUM
OscilloscopeAgilentDSO3062A
50 ml centrifuge tubesVWR21008-178
15 ml centrifuge tubeVWR21008-216
T75 culture flaskVWR82050-862
Dextran, Tetramethylrhodamine, 3,000 MW, AnionicGibco, Life TechnologiesD3307
Dextran, Tetramethylrhodamine, 70,000 MW, Neutral Gibco, Life TechnologiesD1819
Dextran, Texas Red, 3,000 MW, NeutralGibco, Life TechnologiesD3329

참고문헌

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