신경 세포주에 신경 독성과 신경에 관여하는 분자 진학의 윤곽을하는 도구로 실시간 임피던스 기반의 세포 분석기

요약

Improved in vitro neurotoxicity assays would aid the identification of new neuroprotective compounds. The utility of a real-time impedance-based cell analyzer to determine cytotoxicity and cytoprotection in neuronal cell lines and to delineate the involvement of second messenger pathways, thus gaining insight in the mechanism of neuroprotection is presented.

초록

많은 뇌 관련 질환은 병태 생리에 관여하는 신경 세포의 죽음이있다. 약물과 신경 / 신경 독성의 분자 메커니즘에 대한 통찰력을 확보하고 잠재적으로 신약 개발을 촉진 할 수 있습니다 도움이 될 관련 다운 스트림 경로의 신경 또는 신경 독성 효과를 연구하기 위해 체외 모델에서 개선. 그러나, 기존의 많은 시험 관내 독성 분석법은 중요한 제한이 - 가장 안 시간 코스 및 효과의 동력학을 관찰 할 수 있도록, 하나의 시점에서 신경 보호 및 신경 독성을 평가한다. 또한, 실시간으로 신경 보호에 관여하는 신호 전달 경로 다운 스트림에 대한 정보를 수집 할 수있는 기회는 매우 중요하다. 현재의 프로토콜에서는 라벨없는 실시간 condit하에 신경 세포주에서 세로토닌 2A (5-HT의 _2A) 수용체 작용제의 신경 보호 효과를 결정하기 위해 실시간 임피던스 기반 세포 분석기의 사용을 설명임피던스 측정을 이용하여 이온. 더욱이, 우리는 제 메신저 경로의 억제제는 신경 보호 효과에 관여하는 분자 스트림을 묘사하기 위해 사용될 수 있음을 보여준다. 우리는 또한 세포 증식에​​ 영향이 관찰 된 신경 보호 효과에 기여 여부를 확인하려면이 기술의 유틸리티를 설명합니다. 시스템은, 웰의 바닥 표면에 금 미세 전극 배열을 교대 셀 센서로서 포함 E-플레이트라고도 특수 마이크로 플레이트를 이용한다. 임피던스 읽기가 부착 세포, 세포 생존, 형태, 및 접착 숫자로 변경된다. 셀 인덱스라는 무 차원 파라미터는 전기 임피던스 측정으로부터 도출되고, 상기 셀의 상태를 나타내는 데 사용된다. 전반적으로, 실시간 임피던스 기반 세포 분석기는 더 기여 실시간, 신경 보호 및 신경 독성의 라벨없는 평가, 및 제 메신저 경로 개입의 평가를 허용치료 후보를 선택하기위한 시험 관내에서 잠재 신경 화합물의 상세하고 높은 처리량 평가.

서문

신경 세포의 사멸이 많은 뇌 관련 질환의 병태 생리 ^1에서 중요한 역할을한다. 체외 독성 분석의 신뢰성 및 높은 처리량의 가용성은 신경 독성의 메커니즘에 대한 통찰력을 얻기 위해 약물 ^개발이의 치료 후보로 신경 분자를 선택하기 위해 매우 중요합니다. 그러나 가장 널리 운동 해상도를 허용하지 않는 하나의 시간 시점에서 신경 독성 / 신경을 평가 체외 신경 독성 assays.They 사용에 많은 제한이있다; 종종 신호 전달 경로를 방해하고 같은 세포 집단에서 추가 연구를 제한하고, 종종 노동 집약적이며, 많은 경우에 기계적인 통찰력을 제공하지 않습니다 수 있습니다 라벨 또는 프로브를 사용합니다. 본 연구에서 우리는 실시간 미만 신경 세포주에서 세포 독성 및 신경 보호를 결정하기 위해 실시간 임피던스 기반 세포 분석기의 유용성을 증명 라벨없는조건 효과에 관련된 제 메신저 경로의 분석을 통해 하류 메커니즘에 대한 통찰력을 제공하고.

이전의 연구는 표준 기법 ^3,4,5,6 비해 세포 독성은 물론 세포주에서 세포 증식에 미치는 영향을 결정하기 위해 실시간 세포 분석의 유효성을 확인했다. 예를 들어, 상관 관계는 기저 증식 조건 및 HeLa 세포에서 ³ 개의 다른 독성 패러다임 후 여러 시점에서 표준 세포 생존 WST-1 분석의 판독 및 셀 인덱스 값 사이에서 관찰되었다. 셀 지수 측정에 의해 평가하고 표준 적 사용 sulforhodamine의 B (SRB) 분석 ^4시 미세 소관 안정 파클리탁셀과 자극 A549 및 MDA-MB-231 세포의 증식과 세포 독성은 매우 유사한 값을 나타내었다. 불후의 해마 신경 세포의 신경 세포 라인에서 HT-22 세포 지수 측정은 자신의 능력 t에 대해 검증 하였다O 널리 사용되는 3 - (4,5 - 디메틸 -2 - 일)에 대해 세포 증식, 글루타메이트 독성 세포 보호 및 2,5 - 디 페닐 테트라 졸륨 브로마이드 (MTT) 분석 ^(5)를 검출한다. 같은 연구에서, MTT 분석 결과 및 셀 인덱스 측정은 또한 팬 카스파 제 억제제 QVD ^(5)에 의해 성장 인자 결핍 및 세포 독성의 복구 후 신경 전구 세포의 증식, 세포 독성을 측정하는 상관 관계. Vandetanib (혈관 내피 성장 인자 수용체 및 표피 성장 인자 수용체 억제제)으로 NIH 3T3 세포에서 유도 된 세포 독성 세포 인덱스 값 또는 중성 적색 흡수 분석법 ^(6)로 측정 유사한 결과를 보였다.

우리가 최근 세로토닌 2A의 신경 보호 효과를 평가하기 위해 실시간 세포 분석 시스템을 사용 하였다 (5-HT _2A) 수용체 작용제, (±) -2,5 - 디메 톡시 4 - iodoamphetamine 염산염 신경 세포주 (DOI) ( SK-N-SH 세포)와 세코의 참​​여에 대한 검사관찰 된 신경 보호 ⁽⁷⁾ 상에 화학적 억제의 효과를 모니터링을 통해 차 메신저 경로. 흥미롭게도, 5-HT의 _{2A 수용체는} 일반적으로 별개의 두번째 메신저 경로 ^팔 모두를 활성화시킬 수있다 (DOI 및 lisuride 각각 같은) 환각 및 nonhallucinogenic 모두 효능을 가지고 있습니다.

제시된 기술의 이점은, 일의 과정에서 세포 생존에 대한 정보를 실시간으로 수집하는 신경에​​ 대한 증식 효과 가능한 공헌을 평가하고 최적 시간을 선택하는 제 메신저 경로가 관여 묘사 할 수 있다는 점이다 같은 세포 집단에 대한 자세한 엔드 포인트의 연구. 현재 프로토콜의 워크 플로우의 개략도는 그림 1에 제시되어있다.

프로토콜

1 준비

1. 37 ° C에서 5 % CO ₂ 세트 조직 문화 인큐베이터에서 실시간 세포 분석기의 역을 놓습니다. 멸균 조건 하에서 조직 배양 후드 내의 모든 세포 배양 처리 및 약리 치료를 수행한다.
2. NOTE : 표준 배양 조건에 비해 서로 다른 온도 설정을 필요로하는 신경 세포 라인, 그에 따라 조정되어야한다. 약하게 부착 세포주를 들어, E-96 플레이트의 웰의 바닥에 금 미소 전극과 세포의 상호 작용을 용이하게하기 위해 코팅제를 사용한다.
3. (적당한 용매에 신경 보호제 또는 두번째 메신저 경로 억제제 - 디메틸 설폭 사이드 또는 멸균) 1000 배 스톡 세포 배양 치료를위한 약물 화합물의 솔루션을 준비하고 -20 ° C에 저장합니다. 다음과 같은 치료에 차량과 같은 용매를 사용합니다.
4. DMEM / F1 문화 인간 신경 모세포종 SK-N-SH 세포이 매체는, 약 75 %의 밀도로 175cm ^2면과 세포 배양 플라스크에서 10 % 태아 소 혈청 (FBS) (증식 배지)로 보충. 세포 증식 및 세포 독성에 대한 응답 속도의 관점에서 실험 사이의 일관성을 확인하기 위해 (약 10 유로의) 범위 내에서 세포 통로 번호를 유지합니다. 하부 통로 번호가 바람직하다.
5. PBS에 부착 SK-N-SH 세포 층을 세척하고, 37 ℃에서 5 분 동안 0.05 % 트립신-EDTA 용액으로를 Trypsinize. 원심 분리기는 5 분 동안 170 × g에서 세포를 트립신을 제거합니다. 10 ml의 증식 배지에서 세포를 재현 탁. 홀 셀 카운터 셀 카운트 및 증식 배지로 희석하여 세포를 300,000 세포 / ml의 세포 수를 조정한다.

2 도금 및 SK-N-SH 세포의 증식

1. E-플레이트 (96)의 각 웰에 100 ㎕의 증식 매체를 추가하고 평형을 RT에서 조직 문화 후드에서 30 분 정도 둡니다. E-괞 찮아 삽입37 ° C에서의 CO ₂ 배양기에서 실시간 세포 분석기 역에서 테 96.
2. 실시간 셀 분석기 소프트웨어를 시작. 레이아웃 페이지에서 우물 실험에 포함 된 선택하고 편집 상자에 셀 타입, 휴대폰 번호, 이름 및 세포 치료에 사용되는 화학 물질의 농도에 대한 정보를 입력합니다.
   참고 :이 프로토콜의 목적을 위해 최소 4 회 반복 각각의 치료를 위해 사용하는 것이 좋습니다.
3. 스케줄 소프트웨어 페이지 실험에서, 세포 지수와 각 단계의 스위프 사이의 간격을 측정 스위프의 번호를 선택하여 포함 "단계"를 결정한다. 1 단계는 배경에 소정의 측정되기 때문에, 셀 인덱스 96 시간 동안 15 분마다 측정하고, 2 단계로 설정 "하는 단계를 추가"를 선택한다.
   참고 : 치료를 들어,있는 빠른 반응 속도와 효과가 예상되는 짧은 간격으로 스윕을 설정합니다.
4. 자동으로 미리 정해진 단계를 시작하려면 시작을 클릭 한및 매체의 배경 임피던스를 측정한다. 세포를 웰에 첨가하면이 값이 자동으로 각 데이터 포인트에서 소프트웨어에 의해 감산된다.
5. 증식 배지에서 300,000 세포 / ml의 1.5 이전 단계에서 제조 됨) 세포 현탁액을 사용한다. / 웰 세포 독성 / 신경 연구와 잘 세포 증식 연구를위한 15,000 세포 / 30,000 세포. E-플레이트를 꺼내 세포 독성 / 신경 연구를 위해 잘 당 100 ㎕의 세포 현탁액을 추가하고 세포 증식 연구를 위해 잘 당 50 μL 세포 현탁액 50 ㎕의 증식 매체를 추가 할 수 있습니다. 물론 당 도금 셀의 수는 경험적으로 각 세포주에 대해 최적화 될 필요가있다.
6. 조심스럽게 세포의 경우에도 도금 E-플레이트 96 소용돌이 친다. 세포가 웰의 바닥에 균일하게 정착 할 수 있도록 RT에서 조직 배양 후드에서 30 분 동안 E-플레이트 (96)를 떠난다.
7. 실시간 세포 분석 국에 E-플레이트 (96)를 삽입하고 일정 페이지에 2 단계를 시작연령. 플롯 페이지 및 소프트웨어 셀 인덱스 페이지 원시 셀 색인 데이터 셀 곡선을 보면 실험 내내 셀 인덱스 값을 모니터한다.

3 혈청 박탈

1. 24 시간 후 세포를 도금 실험을 일시 중지하고, 실시간 셀 분석기 역 E-플레이트 (96)를 제거한다. DMEM / F12의 무 혈청 배지로 1000 배 주식에서 두번째 메신저 억제제를 희석 - 200에 최종 농도 ×. 각각의 경로를 억제하기 위해, 두번째 메신저 경로의 1 μL 억제제가 30 분 세포 독성을 시작하기 전에 신경 독성 / 신경에서의 참여를 판정하는과 세포를 치료. 역에 E-플레이트 (96)를 돌려 실험 휴대 지수 측정을 다시 시작합니다.
2. 30 분 후 다시 실험을 일시 중지합니다. 조심스럽게 부착 된 세포층을 방해하지 않도록주의하면서 피펫 (또는 멀티 채널 피펫)와 E-플레이트에서 완전히 96 우물을 확산 매체를 제거웰의 코너 피펫 팁의 끝을 지시함으로써. 200 μL / 무 혈청 DMEM / F12 배지 (혈청 박탈 매체)의도를 추가합니다. 세포의 기계적 교반을 최소화하는 세포 배양 배지의 신속한 교환을 보장한다.
3. 화합물을 희석하는 최종 농도 × 200 무 혈청 DMEM / F12 매체와 1000 배의 재고 자신의 신경에 미치는 영향을 평가한다. 1 ㎕의 화합물을 추가하는 것은 자신의 신경 보호 효과와 실험 계획에 따라 개별 우물에서 두번째 메신저 경로의 1 μL 억제제 테스트합니다.
4. 확산 연구에 대한 세포에서 매체를 변경하지 않습니다. 물론 당 1 μL로 처리 증식 배지에서 문화를 계속 확산 매체의 최종 농도 × 200에 1000 배의 재고에서 테스트 할 화합물을 희석.
5. 이전에 설정 한 96 시간 동안 셀 지수 측정과 매 15 분을 계속 실험을 다시 시작합니다.

(4) 데이터(분석)

1. 신경 독성은 / 신경 데이터는 플롯 페이지의 "시간을 정상화" "표준화 된 셀 인덱스"를 선택하여 실험 간의 편차를 줄이고하기 위해 약물 치료 또는 매체 변경 전 마지막 포인트로 셀 인덱스를 정상화.
2. 관심의 실험 조건에 대한 플롯 페이지의 우물을 선택하고 정규화 된 셀 인덱스 곡선을 그릴 "추가"를 클릭합니다. 또는 시간의 함수로 정규화 된 셀 인덱스 곡선으로 두번째 메신저 억제의 신경 독성 / 신경 보호 효과의 반응 속도를 관찰한다.
3. 증식에 대한 신경 보호 효과 / 신경 독성 효과에 관여되는지 여부를 평가하기 위해 시간의 함수로서 증식 배지에서 시험 약물 치료 용 세포 지수 곡선을 관찰한다.
4. 결과의 통계적인 평가를 개시 엑셀 파일로 셀 색인 소프트웨어 페이지의 모든 셀 인덱스 시점에 대한 정보를 내보내는 실험
   NOTE : 통계 분석에서 초기 단계의 p 값, 웰치 t-테스트를​​ 사용하여 개질 MATLAB 프로그램 세트 semilogarithmically 플롯으로 (보조 코드 파일로 제공되는)의 시간 척도에 대하여 반전 축을 이용한다. 이러한 프로그램은, 전체 실시간 셀 분석기 실험의 시간 과정을 통해 P-값의 검출을 허용하고, 따라서보다 상세한 통계적 분석 시점의 선택을 돕기. 프로그램에 대한 자세한 내용은 보충 자료를 참조하십시오.
5. 특정 시점에서 다른 처리 조건 하에서 셀 인덱스 값의 차이의 통계적 분석을 위해, 반출 엑셀 파일에서 각각의 시점에서 셀을 선택 인덱스 값. 통계 소프트웨어를 이용하여 사후 시험 뒤에 분산의 단방향 또는 양방향 분석 (ANOVA)으로 선택한 시점에서 셀 인덱스 값들을 분석한다.

결과

혈청 부족은 실시간 셀 분석기로 연속적으로 모니터링 할 수있다 셀 인덱스 값에서 감소하는 리드

세포 신경 독성 자극 제시된 기법 및 특정 신경 독성 자극과 연구 세포 유형에 의존하는 역학과 실시간으로 모니터링 할 수있다 셀 인덱스 값의 저하를 초래할.도 2의 증가를 보여 SK-N-SH 세포는 고원 (녹색 선)과 박탈 매체 (빨간 선) 혈청하는 세포?...

토론

현재 프로토콜은 연속적 및 라벨없는 조건에서 신경 세포주에서 화합물의 신경 / 신경 독성 효과를 평가하기 위해 상기 효과에 관련된 제 메신저 경로에 대한 통찰력을 얻기 위해 실시간 셀 분석기의 유틸리티를 제공한다.

세포 독성 및 세포 증식에​​ 대한 약물의 효과를 연구하기 위해 실시간 셀 분석기 효용은 일반적으로 인식 되더라도, 단지 몇 연구는 신경 관련 세포 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
xCELLigence  RTCA SP system bundle	ACEA Biosciences	No: 00380601030	Consists of RTCA Analyzer, RTCA SP Station and RTCA Control Unit
E-plate 96	ACEA Biosciences	No: 05232368001	For culturing the cells, inserted in the RTCA SP Station
SK-N-SH cells	ATCC (in partnership with LGC Standards)	HTB-11	Can be replaced by another adherent neuronal cell line of interest
DMEM/F12	Sigma-Aldrich	D8437	Cell culture medium
Fetal bovine serum	Life Technologies	16140-063	Supplements proliferation, but not serum deprivation medium
Tissue culture flask T175	Sarstedt	83.1812.302	For culturing cells, which will be later plated on the E-Plate 96
0.05% Trypsin-EDTA	Life Technologies	25300-054	For trypsinization of cells cultured in tissue culture flasks
Scepter 2.0 cell counter	Merck Millipore	PHCC20060	Automated cell counter
Phosphate-buffered saline	Life Technologies	10010-015	For washing the cells
(±)-DOI hydrochloride	Sigma-Aldrich	D101	5-HT2A agonist for cell culture treatment
LY-294002 hydrochloride	Sigma-Aldrich	L9908	PI3-K inhibitor for cell culture treatment
Lisuride maleate	Tocris Bioscience	4052	Compound with 5-HT2A agonistic activity for cell culture treatment
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D4540	For dissolving LY-294002 and lisuride maleate