에 가이드<em&gt; 생체</emOptogenetically 확인 된 대뇌 피질의 억제의 interneurons에서&gt; 단일 단위 기록

요약

Here we describe our strategy for obtaining stable, well-isolated single-unit recordings from identified inhibitory interneurons in the anesthetized mouse cortex. Neurons expressing ChR2 are identified by their response to blue light. The method uses standard extracellular recording equipment, and serves as an inexpensive alternative to calcium imaging or visually-guided patching.

초록

신경 생리에서 중요한 과제는 대뇌 피질의 다수의 억제 세포 유형의 응답 특성과 기능을 특성화하고있다. 우리는 여기 리마 ¹ 동료들에 의해 개발 된 방법을 사용하여 마취 마우스 피질에서 확인 된 억제의 interneurons 안정적인, 잘 격리 된 단일 단위 기록을 얻기위한 우리의 전략을 공유 할 수 있습니다. 녹음은 특정 신경 세포의 소집단에 Channelrhodopsin-2 (ChR2)를 표현 생쥐에서 수행됩니다. 인구의 회원은 푸른 빛에 대한 간단한 플래시에 대한 반응으로 식별됩니다. "PinP의"이라, 또는 신경 세포 집단의 Photostimulation 이용한 식별 - -이 기술은 표준 세포 외 기록 장치로 구현 될 수있다. 이것은 유전자 식별 세포 외 기록 타겟팅 목적, 칼슘 이미징 또는 시각 유도 패치에 저렴하고 대안적인 접근이 될 수있다. H오히려 우리는 매일 연습하는 방법을 최적화하기위한 지침을 제공합니다. 우리는 parvalbumin 양성 (태양 광 +) 세포를 대상으로 특별히 우리의 전략을 정제하지만 이러한 소마토​​스타틴 (somatostatin) 발현 (SOM +)를하고 calretinin 발현 (CR +)의 interneurons으로뿐만 아니라 다른 interneuron 유형에 대해 작동하는 것을 발견했다.

서문

Characterizing the myriad cell types that comprise the mammalian brain has been a central, but long-elusive goal of neurophysiology. For instance, the properties and function of different inhibitory cell types in the cerebral cortex are topics of great interest but are still relatively unknown. This is in part because conventional blind in vivo recording techniques are limited in their ability to distinguish between different cell types. Extracellular spike width can be used to separate putative parvalbumin-positive inhibitory neurons from excitatory pyramidal cells, but this method is subject to both type I and type II errors^2,3. Alternatively, recorded neurons can be filled, recovered, and stained to later confirm their morphological and molecular identity, but this is a pain-staking and time-consuming process. Recently, genetically identified populations of inhibitory interneurons have become accessible by means of calcium imaging or visually guided patch recordings. In these approaches, viral or transgenic expression of a calcium reporter (such as GCaMP) or fluorescent protein (such as GFP) allows identification and characterization of cell types defined by promoter expression. These approaches use 2-photon microscopy, which requires expensive equipment, and are also limited to superficial cortical layers due to the light scattering properties of brain tissue.

Recently, Lima and colleagues¹ developed a novel application of optogenetics to target electrophysiological recordings to genetically identified neuronal types in vivo, termed “PINP” – or Photostimulation-assisted Identification of Neuronal Populations. Recordings are performed in mice expressing Channelrhodopsin-2 (ChR2) in specific neuronal subpopulations. Members of the population are identified by their response to a brief flash of blue light. Unlike many other optogenetic applications, the goal is not to manipulate circuit function but simply to identify neurons belonging to a genetically-defined class, which can then be characterized during normal brain function. The technique can be implemented with standard extracellular recording equipment and can therefore serve as an accessible and inexpensive alternative to calcium imaging or visually-guided patching. Here we describe an approach to PINPing specific cell types in the anesthetized auditory cortex, with the expectation that the more general points can be usefully applied in other preparations and brain regions.

In cortex, PINP holds particular promise for investigating the in vivo response properties of inhibitory interneurons. GABAergic interneurons comprise a small, heterogeneous subset of cortical neurons⁴. Different subtypes, marked by the expression of particular molecular markers, have recently been shown to perform different computational roles in cortical circuits^5-9. As genetic tools improve it may eventually be possible to distinguish morphologically- and physiologically-separable types that fall within these broad classes. We here share our strategy for obtaining stable, well-isolated single-unit recordings from identified inhibitory interneurons in the anesthetized mouse cortex. This strategy was developed specifically for targeting parvalbumin-positive (PV+) cells, but we have found that it works for other interneuron types as well, such as somatostatin-expressing (SOM+) and calretinin-expressing (CR+) interneurons. Although PINPing is conceptually straightforward, it can be surprisingly unyielding in practice. We learned a number of tips and tricks through trial-and-error that may be useful to others attempting the method.

프로토콜

참고 : 오레곤 동물 관리 및 사용위원회의 대학 승인 한 다음 프로토콜은 건강 지침의 국립 연구소에 따른다.

1. 급성 수술

1. 복강 내 (IP) 주사 (표 1)를 통해, 케타민 - medetomidine 칵테일 동물을 마취.
   참고 :이 실험에 사용 된 마우스는 드라이버 선 (; SST-iCre12, SOM의 +, CR-iCre12, CR + Pvalb-iCre11, PV +)를 interneuron하는 CRE에 의존 ChR2 - EYFP 형질 전환 line10 교차에 의해 생성됩니다. ChR2 또는 관련 opsins의 바이러스 배달 유사한 발현 수준이 얻어진다 가정, 동일하게 작동합니다.
2. 수술을 시작하기 전에, 확인 동물 전시 부드러운 발가락 핀치에 대한 응답이. 이 깊이의 마취를 유지하기 위해 필요에 따라 실험을하는 동안 마취제를 다시 투여. 주 사용 마취제를 사용하는 경우, 선택적으로 유지 보수 주사에 대한 IP 카테터를 이식.
3. 식염수 또는 유지 보수 주사 (표 1)에 대해 적절하게 희석 마취제 칵테일을 사용하여 예를 들어 실험을하는 동안 락 테이트 링거액 (약 3 ㎖ / ㎏ / 시간), 수화 동물을 유지합니다.
4. 정위 또는 다른 헤드 유지 장치에서 동물을 놓습니다. 두개골이 잘 고정되어 있는지 확인합니다. 이는 안정적인 단일 세포 기록을 유지하기 위해 필수적이다.
5. 건조를 방지하기 위해 눈에 opthalamic 연고를 적용합니다. 36.5-37 ° C의 체온을 유지한다.
6. 추가 기록 안정성 조에 고인 드레인을 수행합니다. 메스 블레이드를 사용하여 치스 테르 나디 라티 나 마그나을 노출 두개골의 후방 얼굴에서 조직을 제거합니다. 뇌척수액을 배출하기 위해 두라에 작은 흠을 확인합니다. 블레이드 만 매우 팁을 사용하여 소뇌 나 뇌간에 문의하지 마십시오.
7. 메스를 사용하여, 청각에 대한 (관심있는 대뇌 피질의 영역 위에 작은 개두술 (~ 2mm ^2)을 수행피질, 브레 그마의 약 -2.3 mm 후방, 정중선의 4.5 mm의 측면).
8. 경질을 제거하고 따뜻한 0.5 아가로 오스의 층으로 노출 된 피질 커버 - 1mm 두께 (식염수에 1.5 % 아가로 오스, 0.9 %의 NaCl을;에 적용 ~ 37 ° C). 주기적으로 생리 식염수를 몇 방울을 적용하여 실험을하는 동안 아가로 오스 습기를 유지합니다.

2. 녹화 환경

1. 텅스텐 전극 준비 (7-14 MΩ, 127 μm의 직경, 12 ° 테이퍼 팁, 에폭시 코팅). 유리 모세관 튜브에 전극을 Superglue 그립 (그림 1)를위한 열 수축 튜브를 추가합니다.
2. 대뇌 피질의 표면에 직각 여행 세트 모터 (또는 유압) 미세 조작기에 전극을 장착합니다. 두개골에 대해, 피부 아래에 지선을 밀어 넣습니다. 그들은 근전도 아티팩트를 생성 할 수있는 머리의 측면과 목 뒤쪽에 근육과의 접촉을 피하십시오.
3. 세포 외 A를 이용하여 전기 신호를 증폭단일 단위 녹음에 적합한 리 파이 어은, 바람직하게는 임피던스 검사 모드를 갖추고 있습니다. 두 개의 오실로스코프 및 전원 스피커 세트 - 지속적인 스파이크 활동 (5,000 Hz의 대역 통과 300)를 모니터링합니다. 여기서, 기록 된 데이터는 10 kHz의 샘플링 속도로 연속적으로 디지털화되고; 스파이크는 오프라인 추출한다.
4. 팁 피질의 표면에 도달 할 때까지 아가 통해 전극을 전진. 현미경을 통해이 단계를 관찰한다. "제로"미세 조작기에이 위치.
5. 최고 기록의 깊이를 근사하기 위해, 시각적 침투 끝에 전극을 인출 할 때, 전극 팁은 제로의 깊이에 대뇌 피질을 종료 확인.
   참고 : 조작하는 읽기와 관찰 된 전극의 위치 사이의 불일치가 조직에 상대적으로 표류 나타냅니다. 이것은 뇌이나 동물, 또는 조작하는 드리프트의 불안정으로 인해 발생할 수 있습니다.
   1. 있는지 확인하기 위해 추가 검사로조직의 첫 번째 수백 마이크로 미터를 통해 진행하는 동안이 제로 세트 포인트가 대뇌 피질의 표면에 해당하고, 자극 유발 필드 전위를 모니터링 할 수 있습니다. 필드 전위를 모니터링 할 때, 10 Hz로 세포 외 증폭기의 하부 대역 통과 필터 컷오프 낮은. 로컬 필드 전위의 극성이 레이어 I / II 국경 근처에 ¹³ ~ 100 ㎛의 깊이 주위에 반전 있는지 확인합니다. 이는 청각 피질 신뢰성 기준점이지만, 다른 피질 다를 수있다.
6. 수동 미세 조작기에 푸른 빛 소스 (그림 2)에 결합 된 광섬유를 탑재합니다. 현미경을 사용하여 가능한 한 아가의 표면에 가깝게 섬유 팁의 위치. 전극이 조직을 입력 할 빔을 센터입니다.
7. 지정된 폭과 duratio의 TTL (트랜지스터 - 트랜지스터 로직) 펄스열을 제공 할 수있는 제어 장치와, 광원의 출력을 레귤N- 예 아두 이노 (도 3), (도시 된 바와 같이) 컴퓨터 I / O 카드, 또는 시판 펄스 발생기.
   1. 모두 오실로스코프에 신호를 모니터링합니다.
8. 파워 미터를 이용하여 광섬유의 선단부 전체 광선 전력 (MW)을 측정한다. 섬유 코어의 단면적으로 나누어 방사도 (Mw / mm ^2)을 계산하기 위해이 값을 사용한다. 10의 범위의 강도 값으로 시작 - 15 mW의 / ^mm이 필요한 경우 생성물이 제거 될 때까지, 하향으로 조정한다.
9. 조직을 입력 할 태세 아가로 오스의 전극, 빛 이슈를 확인합니다. 검색 펄스열을 시작합니다 (예를 들어, 30 밀리 광 펄스, 500 밀리 초 interstimulus 간격 (ISI)).
   1. 입사광의 각도를 변경하는 전극에 대하여 광섬유를 재배치함으로써 과도 광 아티팩트 (도 4)을 제거한다. 유물이 계속되면, 빛 전력을 감소하려고합니다. 일에즉 아티팩트가 완전히 (에만 최소화)을 제거 할 수없는 드문 경우에는, 탐색 펄스의 지속 기간을 연장. 이것은 사실이 신경 세포의 스파이크를 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다.

3. 스트레이트 떠있을-에 '

1. 약 1 ㎛ / 초의 속도로 뇌를 통해 천천히 전극을 전진. 지속적인 활동을 모니터링 한 오실로스코프를 사용합니다. 다른 한편으로, 레이저 펄스를 발생시킨다.
2. 전극이 ChR2 + 셀을 접근 종종 전기 신호 오실로스코프에 분명 잘하기 전에 감지 할 수 있음을 나타냅니다 오디오 모니터에 빛을 유발 스파이크의 희미한 '해시'를 수신합니다. 사전의 속도를 느리게하는 효과가 있습니다.
   NOTE : 셀 전극의 경로에 직접적으로 놓여있는 경우, 광 - 유발 활성이 더 큰 (더 크게) 성장할 것이다. 전극은 단일 interneuron 접근하면, 해시는 균일 한 크기와 형태의 작지만 잘 정의 스파이크로 해결한다.
3. 즉시 리튬 등GHT-유발 스파이크 개별적으로 오실로스코프의 오프 트리거 할만큼 큰, 그래서 일을 시작합니다. 스파이크 파형의 정확한 형상을 관찰 횡축 배율을 조정한다.
4. 중지하고 조직이 정착 될 때까지 기다립니다. 가까운 셀에 전극을 이동하는 유혹에 저항. 이 단계는 안정된 기록 중요하다. 몇 분 후, 신호 대 잡음비가 개선되지 않은 경우 - 즉, 티슈가 가라 앉을되지만 가​​까이 전극의 선단에 세포를 가져 못한 - 미리 5 더 μm의 다시 기다린다.
   1. 피크 또는 활동 전위의 물마루 어느 확실 잡음 플로어 (예를 들어, +/- 300 μV 이상)보다 충분히 위에 설정된 전압 임계치로 캡처 될 수있을 때까지이 과정을 반복한다.
      참고 : 억제의 interneurons을 PINPing 때 가양 또는 모호함의 작은 위험이있다. 대부분의 세포는 쉽게 30 밀리의 기간 간 PUL과 펄스의 기차를 따를 수있다SE 간격 2-5 밀리 초 (그림 5)의 신뢰할 수있는 최초의 스파이크 대기 시간이 500 밀리 초, 또는 빠르고. PV + 세포의 대부분은, 특히, 전체 1 초 (그림 6)에 대한 발사 유지할 수 있습니다. 이러한 억제 뉴런 때문에, disynaptic (경유) 활성화는 큰 문제가되지 않습니다.
5. 녹음하는 동안, 최초의 오실로스코프에 지속적인 활동을 모니터링 할 수 있습니다. 크기와 두 번째 오실로스코프를 사용하여 스파이크의 모양에 눈을 떼지. 스피커에 자신의 소리의 품질을합니다.
   1. 셀이 중 하나 (이 찔려 죽은 또는 손상 위험이) 전극에 너무 가까이 도면을 나타냅니다 급격한 변화에 대해주의 깊게 듣거나 떨어져 표류한다. 스파이크가 크고 왜곡되는 경우, 백 아웃; 이들이 작은 커지면, 전극을 전진. 2 μm의 단계로 천천히 이동합니다.
   2. 정점 또는 저점에 정렬 된 모든 스파이크 파형을 중첩하여 기록 사후의 품질을 확인합니다. 전압 Thres를 비바리보유. 임계 값의 넓은 범위에 걸쳐, 오직 일정한 높이 (도 5a)의 일관된 스파이크 형상이 있어야한다.
6. 어떤 지점에서 신호가 인접 신경 세포에서 스파이크에 오염 될 경우, 이동합니다. 전극은 인접 셀의 범위 밖에 통과하지만, 표적 뉴런의 범위 내에 남아있을 오프 기회에 천천히 전진. (이것은 일반적으로 성공하지 못합니다.)
7. 각 침투 피질 (900+ μm의)의 전체 깊이를 통해 전극을 이동합니다. 더 빛 응답 뉴런 반대로, 녹음 정기적으로 이웃 ChR2- 세포의 스파이크에 오염 된 많은 침투 또는 후에 발생하지 않으면, 새로운 전극을보십시오.
   참고 : 단 한 번의 일괄 처리 내 개별 전극의 임피던스 및 팁 형상 상당히 다를 수 있습니다. 두 요인 ㅁ - 빛 유발 스파이크를 감지 할만큼 충분히 커야합니다 전극의 유효 "듣고 반경"에 기여ILE 검색은 아직 분리에서 하나의 interneuron을 기록 수 있도록 충분히 제한.
8. 원하는대로 전극의 임피던스를 테스트합니다. 조직의 손상을 방지하기 위해, 아니라 뇌 밖에, 아가로 오스 층의 상부에 전극의 끝으로이 작업을 수행. 7-14 MΩ의 범위 내에서, 정확한 임피던스는이 애플리케이션에 대한 성능, 또는 수율의 확실한 예측 아니다. 즉, 수신 반경을위한 합리적인 프록시의 말했다 : 낮은 임피던스 전극 이상의 유닛을 선택, 높은 임피던스, 적은.
9. 실험의 끝에, 이러한 마취 깊이 평면 아래 마취제 과다, 또는 경추 탈구 등 제도적으로 승인 된 수단에 의해 동물을 안락사.

결과

우리는 여기에 "리마 등. ^한. 표 1 세부 제안 마취 칵테일, 케타민-Medetomidine - 아세 프로 마진을 (가 개발 한 optogenetic 방법을 사용하여, 마취 마우스 피질에서 유전 분류 억제의 interneurons에서 단일 단위 기록을 얻기위한 우리의 전략을 공유 KMA ").도 1은 도표 4. 3 아두 이노 마이크로 컨트롤러와 광 출력 게이팅위한 구성 및 코드를 포함하는도.도 ...

토론

떠있을 개념적으로 간단하지만, 실제로 문제가 될 수 있습니다. 성공의 주요 결정은 전극의 선택입니다. 전기 청취 반경은 중요한 파라미터이다. 이것은 선단이 약간 먼 거리 ChR2 + 셀로부터 정지되었을 때에 하나 이에 따라 어드밴스의 속도를 조정할 수 있도록, 광 유발 스파이크를 검출하기에 충분히 커야한다. 동시에, 양호한 단일 유닛 분리 가능하도록 충분히 제한되어야한다. 즉, 전극은 이웃...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
ChR2-EYFP Line	Jackson Colonies	12569
Pvalb-iCre (PV) Line	Jackson Colonies	8069
Sst-iCre (SOM) Line	Jackson Colonies	13044
Cr-iCre (CR) Line	Jackson Colonies	10774
Agarose	Sigma-Aldrich	A9793	Type III-A, High EEO
Micro Point (dural hook)	FST	10066-15
Surgical Scissors	FST	14084-09
Scalpel	FST	10003-12 (handle), 10011-00 (blades)
Puralube Ophthalmic Ointment	Foster & Smith	9N-76855
Homeothermic Blanket	Harvard Apparatus	507220F
Tungsten Microelectrodes	A-M Systems	577200	12 MΩ AC resistance, 127 μm diameter, 12° tapered tip, epoxy-coated
Capillary Glass Tubing	Warner Instruments	G150TF-3
Heat Shrink Tubing	DigiKey	A332B-4-ND
Zapit Accelerator	DVA	SKU ZA/ZAA	Use with standard Super Glue.
Microelectrode AC Amplifier 1800	AM Systems	700000
MP-285 Motorized Micromanipulator	Sutter	MP-285
4-channel Digital Oscilloscopes	Tektronix	TDS2000C
Powered Speakers	Harman	Model JBL Duet
Manual Manipulator	Scientifica	LBM-7
800 µm Fiber Optic Patch Cable	ThorLabs	FC/PC BFL37-800
Power Meter	ThorLabs	PM100D (Power Meter), S121C (Standard Power Sensor)
475 nm Cree XLamp XP-E	DigiKey	XPEBLU-L1-R250-00Y01DKR-ND	LED power and efficiency are continually increasing, so we recommend checking for the latest products (www.cree.com).
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