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요약

A technique to study NG2 cells and oligodendrocytes using a slice culture system of the forebrain and cerebellum is described. This method allows examination of the dynamics of proliferation and differentiation of cells within the oligodendrocyte lineage where the extracellular environment can be easily manipulated while maintaining tissue cytoarchitecture.

초록

NG2 발현 세포 (polydendrocytes, 희소 돌기 아교 세포 전구 세포)는 중추 신경계에서 주요한 넷째 신경교 세​​포 집단이다. 배아 및 출생 후의 개발하는 동안 그들은 적극적으로 증식 myelinating 희소 돌기 아교 세포를 생성합니다. 이 세포는 일반적으로 기본 해리 문화, 신경 세포 공 배양 연구, 고정 조직되었다. 새로 사용 가능한 트랜스 제닉 마우스 선이 배양 시스템은 전뇌와 소뇌 모두 회색과 백질 영역에 희소 돌기 아교 세포 계통 세포의 증식과 분화를 조사하는데 사용될 수있는 슬라이스. 슬라이스 문화는 출생 초기 마우스에서 준비가되어 1 개월까지에 대한 문화에 보관됩니다. 이 조각은 세포의 행동과 상호 작용을 조사하기 위해 배양 기간 동안 여러 번 이미지를 만들 수 있습니다. 이 방법은 NG2의 세포 분열의 시각화와의 상세한 분석을 가능하게하고있는 동안 희소 돌기 아교 세포의 분화로 이어지는 단계 지역별 의존 할 수 있습니다천만에 NG2 세포 및 희소 돌기 아교 세포 기능 이질성. 이는 생체 내에서 밀접 발견 유사한 셀룰러 환경에서 시간 경과에 영향을 미치는 이러한 세포 및 극한 외부 신호를 조사하는데 사용될 수있는 강력한 기술이다.

서문

4 - 중추 신경계 Organoytpic 슬라이스 배양 semiintact 시스템 (1)의 뉴런 및 신경교 세포 생물학을 연구하는데 매우 유용한 것으로 입증되었다. 9 - 이러한 문화를 채택하고 세포 외 환경의 조작을 반복 장기 라이브 세포 이미징에 대한 쉬운 접근과 전기 생리 레코딩 (5)이 기본으로 해리 된 세포 배양의 많은 혜택을 유지하기가 비교적 간단하다. 또한, 슬라이스 배양 3 차원 조직 cytoarchitecture 지역 신경 연결을 유지하고, 가장 중요한 세포 유형은 시스템에 존재한다. 이러한 특성은 세포와 환경의 상호 작용으로 단일 세포의 행동과 생리를 조사하기 위해 이들 문화에 고유 한 편리한 시스템을 확인합니다.

NG2 세포 증식 및 m을 계속 생성 포유류의 중추 신경계에서 신경교 세​​포 집단이다배아 및 출생 후의 개발 10 동안 희소 돌기 아교 세포를 yelinating. 이들은 광범위 해리 일차 세포 배양에서 연구되었으며, NG2 형광 단백질의 세포 특이 식 트랜스 제닉 마우스 라인의 최근의 발전은 급성 슬라이스 제제의 생체 내 거동 매핑 및 전기 생리 레코딩에서 촉진했다. 비록 이러한 연구와 거의 NG2 세포 증식 및 희소 돌기 아교 세포의 분화의 시간적 역학에 대해 공지되어있다. 해리 된 세포 배양 물을 광범위하게 약리 유전 조작에 대하여 설비를 위해 사용되지만, 그것은 세포의 미세 환경의 컨텍스트를 유지하는 것이 바람직하다 특히 다른 뇌 영역에서 이들 세포의 기능 차이를 질의에 적합하지 않다. 슬라이스 배양 세포 약리 조작에 대한 의무이며, 희소 돌기 아교 세포의 수초화 (11, 12)을 조사하기 위해 사용 된 간단한 대안을 제공(LPC)을 lysolecithin 또는 항체 약물 치료 15를 통해 탈수 초화 13, 14, 및 재유 수화 유도를 유도 한 후 신경근 응답.

방법은 조사 및 라이브 영상 및 고정 조직 (또는 postfixation) 전뇌와 소뇌에서 모두 촬영 Organotypic 슬라이스 문화의 NG2 세포의 증식 및 희소 돌기 아교 세포의 분화의 분석 설명을 수행 할 수 있습니다. 이 16 분할 한 후 NG2 세포 세포의 운명을 연구하고 성장 인자 유도 NG2 세포 증식 17 인 지역, 연령 의존적 차이를 발견하는데 사용될 수있는 강력한 방법이다. 이 상대적으로 간단한 기술은 또한 고유 및 / 또는 환경이 아교 세포의 생리학 및 신경 세포의 활동이나 수초의 손상에 대한 반응을 조절하는 메커니즘을 세포를 조사하기 위해 광범위하게 액세스 할 수 있습니다.

프로토콜

주 : 모든 동물의 절차는 지침을 따르고 코네티컷 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.

참고 : YFP 기자 20 (JAX 번호 006148) 선이 각각 사용되었다 : NG2cre 18 구성 적 (JAX # 008533)와 NG2creER 16 유도 이러한 실험 (JAX 번호 008538)의 경우 형질 전환 마우스는 19 (JAX은 # 003920) 또는 gtRosa26 / EG Z에 교차 화상 NG2 세포 및 그 자손. 희소 돌기 아교 세포로 성숙 화상, PLPDsRed 트랜스 제닉 마우스 (21)를 사용 하였다. 일관성 생존을 위해, 조각까지 전뇌와 소뇌 모두에서 출생 일 10 생쥐에서 분리 할 수​​ 있습니다.

1 조각 준비

  1. 문화 후드에서 여섯 잘 접시에 조직 배양 삽입을 배치하고 (시약 섹션에서 레시피) 1 ml의 슬라이스 문화 매체를 추가 할 수 있습니다. 5 %와 37 ° C에서 해부하기 전에 CO 2 적어도 2 시간을 세포 배양 인큐베이터에서 접시를 넣습니다.
  2. 70 % 에탄올에서 모든 도구와 조직 초퍼 멸균.
  3. 이전 해부의 시작 적어도 15 분 동안 얼음에 95 % O 2, 5 % CO 2와 버블 해부 버퍼 (시약 섹션에서 레시피).
  4. 승인 된 동물 프로토콜에 따라 5 ~ 10 분 동안 얼음에 배치하여 마우스 새끼를 마취. 쥐 꼬리와 발가락 핀치에 응답하지 않는 것을 확인하여 마취의 적절한 깊이를 확인하라.
  5. 동물 프로토콜을 다음 예리한 가위를 사용하여 동물을 참살. 빨리 첫번째 살균 도구를 사용하여 횡 절개 다음에 시상 컷을하여 전뇌와 소뇌를 통해 두개골을 제거합니다. 조심스럽게 옆으로 조직을 압연하여 뇌와 소뇌의 복부 표면에서 두개골 신경을 잘라.
  6. 얼음처럼 차가운 산소 해부 버퍼를 포함하는 멸균 35mm 접시에 조직을 배치합니다.
  7. 면도날을 사용하여, 소뇌 및 전뇌 단절. 그런 다음 중간 시상 컷 죽을반구를 분리 우 전뇌와 소뇌.
  8. 수동 조직 헬기와 전뇌와 소뇌의 300 μm의 두께의 관상 및 시상 부분을 잘라. 참고 : 수동 조직 헬기 아가로 오스 삽입 할 필요없이 문화 부화 해부에서 신속하게 처리 할 수​​ 있습니다. 앞서 설명한 바와 같이 9 vibratome도 사용될 수있다.
  9. 얼음에 갓 버블 차가운 해부 버퍼로 분리 된 조각을 전송합니다.
  10. 작은 해부를 사용하거나 개별 섹션을 분리하고 배양 삽입과 여섯 잘 요리를 미리 배양로 전송 주걱 무게.
  11. 일회용 전송 피펫 또는 P 200 피펫 팁을 사용하여 문화 삽입물의 표면에서 초과 해부 버퍼를 제거합니다. 세 전뇌 또는 세 소뇌 조각에 두 하나의 문화 삽입에 배치 할 수 있습니다.
    참고 : 전뇌 문화와 일치하는 결과를 얻기 위해서 (때문에)는 전방에게 뇌량의 3 분의 1에 걸쳐 조각을 위해 이상적입니다동일한 슬라이스에 모두 회색과 흰색 문제 영역을 공부하기 위해 (그림 1A). 각 동물은 일반적으로 6 전뇌 슬라이스와 6 소뇌 조각을 얻을 수 있습니다.
  12. 인큐베이터에있는 여섯 잘 접시를 놓고 다음 일 일일 슬라이스 준비 후 슬라이스 매체의 ML 슬라이스 고정 될 때까지 다른 모든 일에 슬라이스 매체를 교체합니다.
  13. 실험에 따라, 문화 5-7 일 후에 조각을 사용합니다. 처음 몇 일 후에 투명하게 조각을 사용하여 요철이 불투명 한 영역을 가지고 그 사람들을 버린다. 참고 : 슬라이스 내에서 불투명 한 영역은 눈으로 볼 수 있으며, 위상차에서 어두운 세포의 덩어리로 나타납니다. 기술이 습득 한 후에, 죽은 불투명 조각 조각 미만 1-5%에서는 거의 발생하지 않는다.

NG2의 세포 분열 및 희소 돌기 아교 세포 분화 2 타임 랩스 영상

참고 : 경제의 제로 성장 생쥐 16 : 우리가 NG2cre를 사용 NG2 세포의 증식과 분화의 시간 경과 이미징을 수행하려면NG2 세포 및 그 자손 (도 1C-E)에서 EGFP를 발현한다. 이 줄 리포터 발현 즉시 적어도 4주의 기간 동안 후 단면 슬라이스 라이브 GFP + 세포의 이미지를 획득 할 수있을만큼 충분히 튼튼하다. 깨끗한 이미지는 문화의 첫 번째 3-5일을 통해 발생하는 슬라이스의 초기 숱이 기간 이후에 얻을 수있다.

  1. 실험을하는 동안, 37 ° C에서 세포 배양 인큐베이터에서 조각을 유지하고 시간의 짧은 기간 만 제거 (슬라이스 미만 15 분), 육 웰 플레이트 동안 영상에 뚜껑을 유지.
  2. 디지털 카메라를 구비 한 반전 된 형광 현미경을 사용하여, 10 배 대물 렌즈를 사용하여 첫 번째 시점에서 이미지를 캡처. 참고 : 처음 지점이 실험에 의해 달라지며 조각이 제조되었다 일 또는 후 어느 시점이 될 수 있습니다.
  3. 슬라이스의 두 회색과 흰색 물질 분야에서 시점 일에 여러 지역의 이미지를 캡처합니다. 주 일슬라이스 내의 특정하여 도시 및 후속 이미징 세션에 사용할 수있는 이미지에 개략적 위치를 매핑하여 전자 묘화 영역. 유용한 랜드 마크 백질 책자의 조각 및 / 또는 방향의 모서리를 포함 할 수 있습니다. 콘텐츠 각 시점에서 각 조각에 위치 4-8.
  4. 4-6 시간 간격으로 연속 된 이미지를 캡처 NG2의 세포 분열 및 희소 돌기 아교 세포의 분화, 이상적 통해 5~7일 검사하는.
  5. 모든 지역의 최종 이미지를 캡처하여 즉시 조각을 수정. 다음 조각 위에 다른 하나를 가하여, 문화 삽입의 바닥 (0.1M L-라이신 0.01 M 나트륨 메타 요오드와 4 % PFA) 고정액의 한 ML을 추가합니다. 그것은 막에서 분리 할 수​​ 있습니다로 슬라이스에 직접 정착 물총 않도록주의하십시오. 30 분 동안 조직을 수정하고 4 절에 설명 된대로 발달 단계 특정 마커를 사용하여 면역 조직 화학 진행합니다.
  6. 0.2 M 인산 나트륨 완충액 3 × 10m 씻을 조각인치 1-3일 0.2 M 인산 나트륨 완충액에서 4 ° C에서 필요한 저장하기 전에 조각은 면역 염색한다면 이상적으로 24 시간 내에 염색을 수행합니다. 희소 돌기 아교 세포 (그림 2D-F)로 분화 한 세포의 비율을 결정하기 위해 4 장에 아래와 같이 면역 조직 화학 염색을 진행합니다.

슬라이스 문화에 유도 성 기자 형질 전환 마우스를 사용 NG2 세포 자손의 3 운명 매핑

주 : 문화 특정 시점에서 NG2 세포의 운명을 추적하기 위해, 유도 NG2creER : YFP 트랜스 제닉 마우스를 사용할 수있다.

  1. 배지에 에탄올 100 나노 4OHT 추가하여 Cre 호텔 재조합 및 리포터 발현을 유도한다. NOTE : 리포터 양성 세포는 모든 NG2 세포 단계에서 세포 것이다 ~ 20-25% YFP + NG2 + / NG2 + 세포의 유도 효율이 시점에서 1~2일 내에 표시한다 (도 2A-C)
  2. 수정하고 슬라이스를 씻어상이한 시점에서의 각종 조작 후 (섹션 2.5 및 2.6에 기재되어 있음).

4 슬라이스 면역 조직 화학

  1. 메스를 사용하여 삽입에서 부착 된 조각 세포막을 잘라.
  2. 멤브레인 픽업시 슬라이스의 조성물을 방해하지 않도록주의하면서, 핀셋의 세트를 이용하여 24 웰 플레이트에 함유하는 인산염 완충 식염수 (PBS) 중 각각의 웰에 조각을 전송.
  3. 1 시간 동안 PBS에서 5 % 정상 염소 혈청 (NGS)와 0.1 % 트리톤 - X100을 포함 차단 솔루션과 24 웰 플레이트에 조각을 전송합니다.
  4. 4 ° C에서 PBS에서 5 % NGS에 / 차 항체 O에서 N을 슬라이스를 품어. NG2 세포 단계에서 세포를 식별하기위한, 그리고 NG2 PDGFRα 대한 항체를 사용. 희소 돌기 아교 세포 분화를 확인하기위한, 선종 성 용종증 콜라이 항원에 대한 항체를 사용하여 (APC; 클론을 CC1).
  5. PBS 3 X15의 분에서 두 번째 일 세척 슬라이스에서 다음 차 antibo에 품다RT에서 1 시간 동안 PBS 중 5 %에​​서 NGS 죽는다. PBS 3 X15 최소의 조각을 세척하고 슬라이드에 탑재합니다. 멤브레인 대물과 조직 사이되지 않도록 슬라이드 대향 조각 위로 막 마운트.

결과

대표 데이터의 예는 다음과 같습니다 P8 NG2cre의 전뇌와 소뇌에서 모두 슬라이스 문화를 사용하여 획득 한 것을 : 경제의 제로 성장, NG2creER : YFP를 형질 전환 마우스 라인을 PLPDsRed. NG2 세포 전뇌와 소뇌 조각 (그림 1B-D, 비디오 1) 이러한 세포의 표현형 일 동안 이미지를 만들 수는 고정 후 결정 NG2와 CC1 항체 (그림 1E)과 면역 염색 할 수 있습니다. 이미징 사는 또한 세포 증식?...

토론

중추 신경계의 수초화 효율적으로 신경 세포의 통신 및 축삭의 생존 22 필수적이다. 25 - 대부분의 뇌 영역 16,23의 거주 인구를 유지하면서 NG2 세포는 지속적으로 성인에 myelinating 희소 돌기 아교 세포를 생성합니다. 이러한 세포의 분화를 조절 일부 유전 및 분자 메커니즘을 설명했지만 많이 발견되고 남아있다. Organotypic 슬라이스 배양 인해 해부학 영역, 세포 외 환경의 쉬?...

공개

The authors declare that they have no competing financial interests

감사의 말

This work was funded by grants from the National Multiple Sclerosis Society (RG4179 to A.N.), the National Institutes of Health (NIH R01NS073425 and R01NS074870 to A.N.) and the National Science Foundation (A.N.). We thank Dr. Frank Kirchhoff (University of Saarland, Homburg Germany) for providing PLPDsRed transgenic mice. We thank Youfen Sun for her assistance in maintaining the transgenic mouse colony.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Slice Culture Medium
Minimum Essential MediumInvitrogen1109050%
Hank’s Balanced Salt SolutionInvitrogen1417525%
HEPESSigma-AldrichH-403425mM
L-GlutamineInvitrogen250301mM
InsulinSigma-AldrichI66341mg/L
Ascorbic AcidSigma-AldrichA-02780.4mM
Horse SerumHycloneSH30074.0325%
Titrate to pH 7.22 with NaOH, filter with bottle top filter, and store at 4 degrees Celsius
Dissection Buffer
NaClSigma-AldrichS3014124mM
KClSigma-AldrichP54053.004mM
KH2PO4Sigma-AldrichP56551.25mM
MgSO4 (anhydrous)Sigma-AldrichM75064.004mM
CaCl2 2H2OSigma-AldrichC79022mM
NaHCO3Sigma-AldrichS576126mM
D-(+)-GlucoseSigma-AldrichG702110mM
Ascorbic AcidSigma-AldrichA-02782.0mM
AdenosineSigma-AldrichA40360.075mM
Filter with bottle top filter and store at 4 degrees Celsius, oxygenate with 95%O2 5%CO2 before use
Other Reagents and Supplies
4-hydroxy tamoxifen (4OHT)Sigma-AldrichH7904100nM
Paraformaldehyde (PFA)EM Sciences192004%
L-LysineSigma-AldrichL-60270.1M
Sodium MetaperiodateSigma-AldrichS-18780.01M
Rabbit anti NG2 antibodyChemicon (Millipore)AB53201:500
Mouse anti CC1 antibodyCalbiochem (Millipore)OP801:200
Mouse anti Ki67 antibodyVision BiosystemsNCL-Ki67-MM11:300
Mouse anti NeuN antibodyChemicon (Millipore)MAB3771:500
Species specific secondary antibodiesJackson Immunoresearch
Normal Goat Serum (NGS)5%
Triton X-1000.10%
Mounting medium with DAPIVector LabsH-1200
Millicell culture membrane inserts 0.45μm pore sizeFisher ScientificPICM03050
Bottle top filtersFisher Scientific09-740-25E
Ethanol
95% O2 5% CO2 gas mix
Phosphate Buffered Saline (PBS)
Sterile six well plates
Dissecting (hippocampal) or weighing spatulas
Manual or automatic tissue chopper
Razor blades
Disposable transfer pipettes
35mm and 60mm sterile Petri dishes
Stereomicroscope
Inverted Phase Microscope
Laminar Flow Hood
Tissue Culture Incubator
Inverted Fluorescence Microcope

참고문헌

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