사용<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 챈들러 루프 장치 수정 된 고분자 혈액 도관의 생체 적합성을 평가하기 위해

요약

Blood exposure to polymeric blood conduits initiates the foreign body reaction that has been implicated in clinical complications. Here, the Chandler Loop Apparatus, an experimental tool mimicking blood perfusion through these conduits, is described. Appendage of recombinant CD47 results in decreased evidence of the foreign body reaction on these conduits.

초록

합성 체 표면에 도입 될 때 이물 반응이 일어난다. 이 시술 후 합병증으로 이어지는, 혈액 단백질의 흡착 및 혈소판의 후속 부착 및 활성화, 단핵구 / 대 식세포 접착 및 염증 세포의 신호 이벤트에 의해 특징입니다. 챈들러 루프 장치 연구자들은 혈액의 많은 양이 고분자 도관을 통해 관류 때 발생하는 분자 및 세포의 상호 작용을 연구 할 수있는 실험 시스템입니다. 이를 위해, 본 장치는 다양한 중합체 표면 변형 항염의 평가를 허용하는 생체 외 모델로 사용되고있다. 우리 연구실은 공유 재조합 CD47와 photoactivati​​on 화학을 통해 수정 된 혈액 도관, 고분자 표면에 생체 적합성을 부여 할 수 있습니다 것으로 나타났습니다. 고분자 표면에 CD47를 추가하는 것은 중합체 혈액 도관 효능을 촉진 할 수있는 효과적인 수단이 될 수있다. 그녀의EIN은 CD47 변성 및 제어 도관과 혈액의 상호 작용을 조사하는 임상 적으로 중요한 중합체 혈액 도관 및 생체 외 실험 모델로서 챈들러 루프의 사용 재조합 CD47을 추가하는 데 사용 photoactivation 화학 디테일 방법론이다.

서문

그러한 체외 순환 및 신장 투석과 같은 많은 임상 절차, 중합체 혈액 도관의 사용을 필요로하고 종종 시술 후 합병증 ^1과 연관된다. 혈액 관류 할 때,이 폴리머는 혈액 단백질 및 혈소판, 단핵구 / 대식 세포 접착의 흡착 결과, 이물 반응 (FBR)를 이끌어 낼, 그리고 할 시술 후 합병증에 기여 모두 염증성 사이토 카인의 방출 / 또는 장치 고장 ^2,3. 따라서, 이러한 문제를 해결하기위한 전략은 생체 재료 연구의 중요한 영역 및 지속적인 유지. 연구자들은 생리 활성 또는 생체 불활성 분자 ^4-6 혈액 접촉면을 수정하여이 문제를 해결하려고했습니다. 우리의 실험실에서 연구는 FBR을 완화하고 이들 물질의 효능을 증가시키기위한 전략으로 고분자 생체 재료에 재조합 CD47 (recCD47를) 추가에 초점을 맞추고있다. CD47는 재하 표현 transmembr입니다세포 ^7-10와 쇼를 표현하는시의 면역 회피의 알려진 역할 부여 "자기"상태 메탄 단백질은 고분자 표면에 ^{11 ~ 13에} 추가 할 때 생체 적합성을 부여에 약속드립니다. 신호 규제 단백질 알파 (SIRPα), CD47에 대한 동족 수용체 및 횡단 단백질의 가족을 함유 면역 수용체 티로신 기반의 억제 모티프 (ITIM)의 회원은 골수 기원 ^(14)의 세포에 표현된다. 우리는 이전에 CD47가 SIRPα 매개 세포 신호를 통해, 생체 외, 생체 ​​폴리 우레탄 (PU)와 폴리 염화 비닐 (PVC)에 대한 면역 반응을 하향 조정하고 생체 내 모델 ^11-13에 있음을 증명하고있다.

우리의 조사에 중앙 화학적으로 반응성 티올 그룹이 공유 다기능 고분자 (PDT-의 BZ와 튜브를 반응시켜 고분자 튜브에 추가되는 여기에 설명 된 비교적 새로운 photoactivati​​on 화학은있다2 - 피리 딜 디티 오 (PDT)로 이루어지는) 액, 광 반응성 페논 (BzPh) 및 카르복시 변성 폴리 알릴 ^11-13. 트리스 함께 공유 첨부 PDT기를 환원 (2 - 카르복시 에틸) 포스 핀 히드로 클로라이드 (TCEP)는 ^{11 일 이후} 일 수 티올 표면은 치료 잔기와 반응하여 산출한다. 본원 이전 상세한 ^12,13, 상기 C-말단 폴리 - 리신 ^12,13 꼬리의 첨가로 개질 recCD47는, Sulfosuccinimidyl - 4 - [N -maleimidomethyl] 시클로 헥산 카르 복실 레이트 1과 반응 (술포-SMCC) 1 시간 동안 튜브 ⁽¹¹⁾ 사이 및 recCD47 우람 모노 설파이드 결합 형성을 허용 티올 반응성기를 생성한다. CD47의 표면 기능화 항염증제 용량은 원래 응고 혈전 ^(15)의 시험 관내 모델로서 1958 년에 설명 된 전체 인간 혈액과 챈들러 루프 장치를 이용하여, 전 비브 O, 시험 하였다. 장치에 의존밀폐 된 튜브 시스템은 부분적으로 공기 튜브 ^(15)를 통해 혈액을 순환하는 회전 모터 가득합니다. 이 실험 모델 수정 및 표면 개질시 혈액 노출의 효과뿐만 아니라, 혈액 세포의 생리학에 따라 그 표면 변형의 영향을 조사 할 수있는 기회를 제공한다.

recCD47이 photoactivation 화학을 사용하여 중합체의 다양한 표면에 추가 될 수 있고, 그것의 항 염증 능력은 중합체 표면 ^{(11, 12)를} 통해 혈류를 흉내 임상 적으로 중요한 생체 모델을 이용하여 평가 될 수있다. 장치에서 인간의 혈액에 노출되었을 때 변성 중합체에 비해 recCD47 변성 임상 등급의 혈액 도관은 상당히 적은 혈소판과 염증 세포 부착을 보여준다. 본 변형 과정의 단계별 설명은 아래에 자세히 설명된다.

프로토콜

recCD47 1. 수정 고분자 표면

NOTE :. 프로토콜은도 1에 개략적으로 요약은도 1a는 티올 반응성 중합체 표면의 생성을 도시 한도 1b는 티올 반응성 recCD47의 생성을 도시한다..

1. 1 일
   1. 멸균 수에 PDT-BzPh의 용액 (1 ㎎ / ㎖)과 탄산 수소 칼륨 (KHCO ₃₎ (0.7 ㎎ / ㎖)을 준비한다. 4 ° C (빛으로부터 보호)에서 밤새 교반한다.
2. 2 일
   1. (회전 바퀴 주위에 맞게 충분히) 40cm 길이의 조각으로 고분자 튜브를 잘라.
   2. 통이나 챈들러 루프 장치에 실온에서 90 분 동안 hexacylpyridinium의 0.1 % 수용액에 튜브를 만끽. 90 분 담근 후 멸균 수의 3 배와 튜브를 씻어.
   3. (15 % 수성 칼륨 인산을 첨가하여 1 일부터 PDT-BzPh의 용액을 산성화 KH ₂ PO _4). 흐린 미셀 솔루션을 형성 PDT-BzPh의 ML 당 50 μL KH ₂ PO _4를 추가합니다.
   4. 진탕 또는 장치 상에 실온에서 40 분 동안 산성화 PDT-BzPh 용액 튜브를 담근다.
   5. 한 번 : 묽은 초산 (1000 일)와 튜브를 씻어.
   6. 60 분의 전체 지속 시간 동안 UV 조사에 튜브를 노출. 전체 면적을 조사하기 위해 15 분마다 차례 ¼ 튜브를 회전합니다.
   7. 쉐이커 또는 장치에 실온에서 20 분 동안 20 ㎎ / ㎖의 탄산 칼륨의 수용액 (KHCO _3)에서 튜브를 담근다.
   8. 멸균 수에 4 ° C에서 멸균의 3 배 및 저장소와 튜브를 씻어.
3. 3 일
   1. (: 흄 후드에서 수행주의) 200 ㎕의 디메틸 포름 아미드 (DMF)에 5 mg의 설포-SMCC을 녹인다.
   2. recCD47 폴리 라이신 용액을 0.1 ㎎ / ㎖에 1 단계에서 제조 된 설포-SMCC 용액 50 μl를 추가하고, RO에서 60 분 동안 교반톰 온도.
   3. 60 분 교반하는 동안, 가스 제거는 둘 베코 인산염 완충 생리 식염수 (DPBS)와 따로 멸균.
   4. 정화 설포-SMCC는 제조업체의 지침에 따라 7K 분자량 컷 - 오프 스핀 탈염 컬럼을 사용하여 recCD47을 반응. 최종 관류 (고품질 티올 반응성 recCD47)를 모아서 코트 DPBS와 관의 내부에 필요한 볼륨으로 희석한다.
   5. 멸균과 일이에서 튜브를 씻어 DPBS 배는 탈기.
   6. 이하 2 분간 탈기 DPBS 20 ㎎ / ㎖와 트리스 (2 - 카르복시 에틸) 포스 핀 히드로 클로라이드 (TCEP)의 용액으로 튜브의 표면 개질 반응. 멸균 탈기 DPBS 배와 튜브를 씻어.
   7. 튜브에 설포-SMCC-반응 recCD47를 추가하고 통 또는 장치에 4 ° C에서 하룻밤 배양한다.

수정 된 표면에 recCD47의 2 면역 정량

1. 수정 된 튜브를 씻어하는 3 일 기지에서 정량시간 DPBS 배. 저장 튜브는 4 ° C에서 DPBS에 정량을 사용하지.
2. 96 웰 플레이트의 우물에서 생검 펀치를 중복 튜브 샘플을 만들 수 및 배치 4mm 생검 펀치를 사용합니다.
3. 검출 항체로 처리하지 변성 샘플 튜브로 이루어지는 음성 대조군을 준비한다. 검출 항체 처리 변성 샘플 튜브로 이루어진 항체 제어를 준비한다. 검출 항체 처리 변성 튜브 시험 샘플을 준비한다.
4. 진탕 기에서 실온에서 60 분 동안 DPBS에서 0.4 % 소 혈청 알부민 (BSA)으로 차단 샘플.
5. 차단 대기음 BSA 트리스 완충 식염수 플러스 1 % 트윈 20 (TBST) 3 배, 통에 10 분 각 씻어 후.
6. 면역에 대한 제조업체의 권장 희석에 따라 0.4 %의 BSA에 항체의 희석 작업을 준비합니다. 인간 CD47 항체 B6H12-FITC 일을 희석 : (100) 0.4 %의 BSA에.
7. 적절한 우물에 항체 희석 200 μl를 추가합니다. Incuba0.4 %의 BSA 만과 테 부정적인 제어합니다. 쉐이커에 60 분 (빛으로부터 보호)을 실온에서 품어.
8. TBST 배, 10 분 쉐이커 각 씻어. 마지막 TBST 린스를 대기음 및 튜브 샘플 웰에 200 μL의 DPBS를 추가합니다.
9. 최종 관류 고품질 티올 반응성 재조합 CD47이다 모아서 코트 DPBS와 튜브의 내부에 필요한 양으로 희석한다.
10. FITC 여기 (485 나노 미터) 및 배출 (538 나노 미터) 설정을 사용하여 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 FITC 신호 강도를 읽으십시오.
11. 계산 recCD47 자동 형광 및 비특이적 항체는 대조 샘플에서 바인딩 차지 표준 값을 기초로 중합체 표면에 결합.

3 챈들러 루프 장치 프로토콜

혈액 수집 프로토콜의 임상 시험 심사위원회 (IRB) 승인 및 동의서 서류 이전에 인간의 혈액 샘플 수집을 시작하기를 추구합니다. 정보를 얻rmed 인간의 혈액 기증자의 동의.
참고 : 장치를 묘사 한 그림이 그림 2에 나타나있다.

1. 약 2 직경 바퀴의 때까지 증류수로 수조를 작성하는 침수된다. 10 % 표백제 솔루션을 만들기 위해 물을 욕조에 충분히 표백제를 추가합니다. 설정 물 37 ° C에 욕조와 온도가 평형을 할 수 있습니다.
2. 금속 (도 1b에 도시) 어댑터, 미 변성 및 변성 튜브 튜브를 수집하고,도 1c에 도시 된 바와 같이, 장치를 바퀴 주위에 조립한다. 그 튜브가 제자리에 금속 어댑터 바퀴 snuggly 주위에 적합해야합니다.
3. 구연산이나 다른 항응고제의 2 ㎖로 채워져 유리 병에, IRB 승인 프로토콜을 사용하여 30 ml의 혈액 샘플을 확보하고, 시료가 수집 된 후 응고 방지하기 위해 반전으로 섞는다.
4. 튜브에 약간의 공기를 떠나, 금속 밸브와 주사기를 사용하여 각 튜브에 혈액의 약 10 ML을 추가합니다. 밸브 캡과 연구를 고정3 시간 동안 otate.
5. 10 % 표백제 용액으로 처리 폐기물 비커에 혈액을 배출 (또는 기관 정책 필요).
6. 부드럽게 혈액의 모든 흔적을 제거하는 DPBS와 튜브 내부를 씻어. 흐름을 통해 폐기물 비커를 수집합니다. 기관의 정책에 따라 혈액 폐기하십시오.
7. 장치 및 표면 10 % 표백제 용액을 사용하거나 기관 방침에 따라 접촉하는 혈액 소독.
8. 형광 현미경 또는 주사 전자 현미경을위한 프로세스 샘플 후술.

4 형광 현미경과 세포 계수

1. 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA) 용액 (주의 : 흄 후드에서 수행)을 준비.
2. 4 ° C에서 하룻밤 4 % PFA 용액에 튜브를 품어.
3. 하룻밤 배양 후, 4 % PFA를 제거하고 DPBS 매우 부드럽게 영화를 씻어.
4. 염색에 대한 루멘 표면을 노출하는 섹션으로 튜브를 잘라.
5. 얼룩실온에서 30 분 동안 4 ', 6-diamidino-2-페닐 인돌 (DAPI)로 미디어를 장착 몇 방울의 튜브 섹션 (광으로부터 보호). 염색 후, DAPI 배경 신호를 감소시키기 DPBS로 매우 조심스럽게 튜브를 헹군다.
6. DAPI 필터 및 디지털 카메라가 장착 된 형광 현미경을 사용하는 이미지 200X 배율 하에서 뷰 9 맹목적 선택된 분야에서 세포의 수를 계산한다.
7. 기록 셀은 시야 당 계산 및 결과의 통계적 유의성을 결정하기 위해 적절한 통계 분석을 수행합니다.

(5) 주사 전자 현미경

1. 2 % 글루 타르 알데히드 용액 (주의 : 흄 후드에서 수행) 준비합니다.
2. 밤새 4 ° C에서 2 % 글루 타르 알데히드 용액 튜브를 품어.
3. 하룻밤 배양 후, 부드럽게 DPBS와 함께 호스의 3 배를 씻어.
4. 산화 오스뮴의 1 % 용액을 준비합니다 (주의 : 심각한 흡입 위험! ) 흄 후드에서 사용합니다.
5. 실온에서 15 분 동안 산화 오스뮴의 1 % 용액에서 배양 튜브.
6. 부드럽게 DPBS와 함께 호스의 3 배를 씻어.
7. 에탄올 농도의 시리즈 (25 %, 50 %, 75 %, 95 %, 100 % 에탄올)을 준비한다.
8. 에탄올 농도의 일련의 인큐베이션 튜브 탈수. 25 %, 50 %, 75 %, 20 분마다 95 % 에탄올에서 배양한다. 30 분 동안 100 % 에탄올에서 배양한다.
9. 초 임계 점은 모든 수분을 제거하고 45 분 동안 CO _2와 함께 호스를 건조.
10. 페이스트 또는 흑연 표본 스텁에 마운트 튜브 섹션.
11. 금 - 팔라듐의 12.5 nm의 코트 튜브 섹션.
12. 주사 전자 현미경으로 조사한다.

결과

SMCC를 사용하여 티올 - 반응성 recCD47 폴리 리신과 함께 PDT-BzPh 및 TCEP를 사용하여 티올 - 반응성 중합체 표면을 생성하는 것은 중합체 recCD47 표면에의 부착을 허용한다. 개질 방법은도 1에 개략적으로 요약된다. 본 변형 공정의 편의성이 단백질을 가정 할 아민 - 함유 리신과 같은 충분한 화학적 반응성기로 변성 될 수 있으며, 다양한 단백질 및 다양한 중합체 표면에인가 될 수 있다는 ?...

토론

(그림 1에 요약) photoactivation의 화학에 대한 PDT-BzPh 첨부 및 후속 UV 조사 용이하게하기 위해 충분한 탄화수소가 거의 모든 고분자 표면의 수정을 허용 PDT-BzPh을 사진을 활성화. 반응성 티올 그룹과 고분자 표면을 기능화하는 것은 관심의 검증 가능한 분자의 범위의 후속 첨부 할 수 있습니다. 우리의 특정 연구에서 우리는 재조합 CD47 ^{11 ~ 13을} 선택했다. 우리는 이관 능성 가교 링...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% Paraformaldehyde (PFA)	Thermo Scientific	58906	Caution! Use in fume hood
25% Glutaraldehyde	VWR	AAA17876-AP	Caution! Use in fume hood
2-pyridyldithio,benzophenone (PDT-BzPH)	Synthesized in lab	N/A
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A3059-100G
Citrate	Sigma	S5770-50ML
Digital Camera	Leica	DC500	Out of production
Dimethylformamide (DMF)	Sigma	270547-100ML	Caution! Use in fume hood
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Gibco/Life Technologies	14190-136
Fluorescent Microscope	Nikon	TE300
Glacial Acetic Acid	Fisher Scientific	A38-212	Caution! Use in fume hood
Human CD47 (B6H12) – FITC Antibody	Santa Cruz Biotechnology	SC-12730
Osmium Tetroxide	Acros Organics	197450050	Caution! Use in fume hood
Potassium Bicarbonate (KHCO3)	Sigma	237205-100G
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4)	Sigma	P5655-100G
PVC Tubing (Cardiovascular Procedure Kit)	Terumo Cardiovascular Systems	60050	Most clinical-grade tubing will work
Scanning Electron Microscope	JEOL	JSM-T330A
Sodium Chloride (NaCl)	Fisher Scientific	BP358-212
Microplate Reader	Molecular Devices	Spectramax Gemini EM
Sulfo-SMCC	Sigma	M6035-10MG	Moisture Sensitive!
tris (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP-HCl)	Thermo Scientific	20491
Tween-20	Bio-Rad	170-6531
Vectashield with DAPI	Fisher Scientific	H-1200	Light sensitive!
Zeba Spin Desalt Columns – 7 K MWCO	Thermo Scientific	89891