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요약

gDNA enrichment for NGS sequencing is an easy and powerful tool for the study of constitutional mutations. In this article, we present the procedure to analyse simply the complete sequence of 11 genes involved in DNA damage repair.

초록

차세대 시퀀싱의 광범위한 사용은 암 연구 및 진단을위한 새로운 길을 열었습니다. NGS는 거대한 암에 대한 새로운 데이터의 양, 특히 암 유전학을 가져올 것이다. 현재의 지식과 미래의 발견은 필요한 암의 유전 적 소인에 관여 할 수있는 유전자의 거대한 숫자를 연구 할 것입니다. 이러한 관점에서, 우리는 DNA 손상의 복구에 관여하는 유전자의 완전한 11 공부 Nextera 설계를 개발 하였다. 이 프로토콜은 안전하게 동시에 24 명에서 11 유전자 (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAD80 및 TP53) 프로모터에서 3'-UTR을 연구하기 위해 개발되었다. transposase 기술과 gDNA를 농축에 따라이 프로토콜은, 다중화를 샘플링 할 수있는 유전자 진단 덕분에 시간의 측면에서 큰 장점을 제공합니다. 이 프로토콜은 혈액 gDNA를 안전하게 사용할 수있다.

서문

2010 년 (기본적으로 여성) 거의 1백50만명는 전 세계적으로 유방암을 개발했다. 그러나, 이들의 경우 5-10 %의 유전 있다고 추정된다. 유전성 유방암과 난소 암의 1에 관련된 거의 이십년 전, BRCA1과 BRCA2가 확인되었다. 약 15 년 전 이후로, BRCA1 및 BRCA2 코딩 영역은 유방암과 난소 암에 대한 유전 적 소인을 결정하는 순서가되었다. BRCA1 및 BRCA2의 변화는 이들 영역의 분석을 효과적으로 스크리닝 충분하지 않은 것을 시사 선택된 가족이 10-20 %가 검출된다. 최근, BRCA1 및 BRCA2의 비 - 코딩 서열 (프로모터, 인트론, 3 'UTR)의 분석은 새로운 돌연변이 / 변형 유방암 3-6의 높은 위험에 링크 될 수 있다는 것을 강조 하였다.

BRCA1과 BRCA2 단백질은 (상동 재조합 수리에 참여하고 있습니다수많은 파트너 (7)에 의해 완료 HHR). BRCA1 또는 BRCA2의 변화는 DNA 복구에 결함을 유발하지만, 다른 파트너는 유방암 위험에 영향을 미칠 수있다. 이 가설은 BRIP1 8 이후 확인 된 것으로 나타나고 PALB2 9는 각각 자궁 경부 암과 유방암에 대한 입증 영향을 미친다. 또한, 다른 두 "중등도 위험"유방암 감수성 유전자, ATM 및 CHEK2는 또한 정기적으로 열 연구 할 수있다.

이 연구에 이어, 우리는 동시에 상대적으로 매우 쉽고을 사용하여 24 명에서 11 유전자 (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAP80 및 TP53)를 분석 할 수있는 프로토콜을 개발하기로 결정 매체 처리 장치 및 농축 transposase 시퀀싱 기술을 기반으로 빠른 프로토콜. 감사합니다이 기술로, 우리는 2500 염기쌍의 인트론 영역이 포함되지 않은 RAP80, (: 176,381,588-176,390,180 CHR5)을 제외하고, 3'-UTR의 단부에 프로모터 개시로부터 완전한 유전자 서열. 이는 2734 프로브 연구에 대한 1,000,300 염기쌍의 합계를 나타냅니다. 일반적으로 BRCA1과 BRCA2 엑손 서열은 20 명 미만 환자의 1.5 개월을 필요로 생거 시퀀싱에 의해 분석된다. 본 프로토콜 (도 1)와 동일한 시간에, 75 개 이상 11 명의 환자에 대한 완전한 유전자를 분석 할 수있다.

프로토콜

gDNA를 1. 평가 (게놈 DNA) 수익률

  1. 갓 라이브러리의 준비를하기 전에 gDNA를 추출 정량화. (gDNA를 수익률 평가를위한 분광 광도계를 사용하지 마십시오) 그대로 gDNA를 정량화하기 위해 형광 수율의 평가 방법을 사용합니다. (280 분의 260 nm의) 비율을 측정하고 주 1.8 사이 2가 있는지 확인 : gDNA를 50 ng의 실험이 필요합니다.

2 gDNA를 보충 : 1 일, 아침

  1. 시작하기 전에
    1. DNA 농축 키트에서 DNA 버퍼 (TD) 및 얼음에 DNA 효소 (TDE1) 솔루션 해동 (자재 / 장비의 표 참조). 적어도 30 분 사용하기 전에, 정화 자석 구슬을 가져다 목표 명세서 (ST)를 중지 실온 (RT)에 버퍼. 샘플 당 잘 μL 직접 96 웰 플레이트에 / 2-2.5 NG에 일을 gDNA를 샘플의 20 μl를 추가합니다. 중요 : 프로토콜 (알려진 서열 변이 샘플)을 확인하는 긍정적 인 컨트롤을 사용합니다.
  2. Tagmentation
    1. MIX 모두 철저하게 배를 반전하여 시약 및 스핀 다운 잠시. RT에서 TDE1 버퍼의 각 웰 gDNA를 50 NG (20 μL)를 포함하고 5 μL에 TD 버퍼의 25 μl를 추가합니다. 부드럽게 위아래로 10 배 전체 볼륨을 피펫, 50 μL에 피펫을 설정합니다.
    2. 20 ° C에서 280 XG에 1 분 접착 필름 및 원심 분리기와 함께 접시를 커버. 그런 다음 열 순환기의 판 (100 ° C로 가열 커버)를 배치하고 다음 프로그램을 실행시킵니다 5 분 동안 55 ° C 및 시간 제한없이 10 ° C를.
    3. 이 인큐베이션 동안 사용될 인덱스를 정의하는 실험 관리자 소프트웨어와 샘플 시트를 제작.
  3. Tagmentation 정화
    참고 :이 단계는 매우 중요합니다. 매우주의해야합니다.
    1. 정제 자기 구슬과 ST 버퍼에 침전물의 유무를 확인합니다. 석출물이 존재하는 경우, 손을 따뜻하게 해법. 얼음에 녹여 재 부상 버퍼 (RSB).
    2. RT에서, 소용돌이 ST 솔루션 및 추가각 웰에 포함 된 샘플 15 μL. 부드럽게 위아래로 10 배 전체 볼륨을 피펫, 65 μL에 피펫을 설정합니다. 실온에서 5 분 동안 품어. 20 ° C에서 280 XG에 1 분 동안 접시와 원심 분리기를 커버.
    3. 각 웰에 이전에 혼합 정제 자석 구슬의 52 μl를 추가합니다. 부드럽게, 117 μL에 피펫을 설정 위아래로 10 배 전체 볼륨을 피펫. 실온에서 10 분 동안 품어. 20 ° C에서 280 XG에 1 분 동안 접시와 원심 분리기를 커버.
    4. 접착 필름을 제거합니다. 실온에서 2 분 동안 자기 스탠드에 96 - 웰 플레이트를 놓습니다. 상층 액이 완전히 명확 나타나는지 확인합니다.
    5. (24 샘플 8 ㎖의 에탄올에 증류수 2 ㎖를 추가) 신선한 80 % 에탄올 용액을 준비합니다. 제거하고 구슬을 방해하지 뜨는 돌보는 폐기합니다.
    6. 자기 스탠드 플레이트 유지하면서, 비즈를 방해하지 않고, 각 웰에 새로 제조 된 80 % 에탄올 200 μL를 추가하고, 적어도 30 초 동안 배양 접시실온에서. 뜨는을 취소하고이 세척을 한 번 더 반복합니다. 에탄올이 꺼 졌는지 확인되었습니다. 10 분 동안 또는 에탄올을 완전히 증발 될 때까지 실온에서 건조하자.
    7. 자기 스탠드에서 플레이트를 제거하고 RSB 버퍼의 22.5 μl를 추가합니다. 부드럽게 위아래로 10 배 전체 볼륨을 피펫, 22.5 μL에 피펫을 설정합니다. 자기 스탠드에 96 - 웰 플레이트를 놓고 2 분 동안 배양한다. 상층 액이 완전히 명확 나타나는지 확인합니다. 조심스럽게 새로운 96 웰 플레이트에 상층 액의 20 μl를 전송합니다.
      NOTE : 선택적으로, 프래그먼트 분석기를 사용하여 tagmented 샘플의 크기를 결정한다. 대신에 상술 한 바와 같은 단계, 고해상도 아크릴 아미드 겔 전기 영동을 사용한다. 조각은 150 BP와 1000 bp의 사이에 있어야한다.
  4. 1 차 PCR 증폭
    1. 얼음에 중합 효소 (LP-PMM), 인덱스 1 프라이머, 및 색인이 프라이머 솔루션을 포함 해동 PCR 마스터 믹스. 조합 O를 일치실험 관리자 샘플 시트와 F 인덱스. 다중화, 각 샘플에 대한 인덱스 1 (I7, N7xx) 다른 I7을 준비합니다.
    2. 각에서 잘 부드럽게, LP-PMM의 20 μL, 인덱스 1의 5 μL, 50 μL에 피펫을 설정 인덱스 2의 5 μl를 추가 위아래로 10 배 전체 볼륨을 피펫. 접착제 microseal 필름과 플레이트를 커버. 20 ° C에서 280 XG에 1 분 동안 원심 분리기.
    3. 열 순환기의 판 (표지 100 ° C로 가열) 및 실행 프로그램 1 (표 1)를 배치합니다.
      NOTE : 절차는이 시점에서 중단 될 수 있고, 반응은 열 순환기 또는 2, 8 ° C 사이의 2 일간 밤새 저장된다.

3 gDNA를 보충 : 1 일, 오후

  1. 시작하기 전에
    1. 해동 올리고 (CSO), 캡처 한 목표 버퍼 (NCT1) 및 얼음에 RSB 해법. 적어도 30 분 사용 전에, RT로 정제 자성 비드를 가져온다.
  2. PCR 정화
    1. 20 ° C에서 280 XG에서 1 분, 2.4 단계에서 접시를 원심 분리기.
    2. RT에서 각 웰에 혼합 정제 자석 구슬의 45 μl를 추가합니다. 부드럽게, 95 μL에 피펫을 설정 위아래로 10 배 전체 볼륨을 피펫. 실온에서 10 분 동안 품어. RT에서 이분에 대한 자기 스탠드에 96 - 웰 플레이트를 놓습니다.
    3. 상층 액이 완전히 명확 나타나는지 확인합니다. (24 샘플 8 ㎖의 에탄올에 증류수 2 ㎖를 추가) 신선한 80 % 에탄올 용액을 준비합니다. 펠렛을 방해하지 뜨는 복용주의를 폐기하십시오.
    4. 자기 스탠드 플레이트 유지하면서, 비즈를 방해하지 않고, 각 웰에 새로 제조 된 80 % 에탄올 200 μL를 추가하고 실온에서 30 초 동안 배양 접시. 뜨는을 취소하고이 세척을 한 번 더 반복합니다. 에탄올이 꺼 졌는지 확인되었습니다. 15 분 동안 실온에서 건조하자.
    5. 자기 스탠드에서 플레이트를 제거하고 RSB 버퍼의 40 μl를 추가합니다. 파이프를 설정40 μL에 TTE는 부드럽게 아래로 10 배 전체 볼륨 업 및 피펫.
    6. 자기 스탠드에 96 - 웰 플레이트를 놓고 2 분 동안 배양한다. 상층 액을 완전히 명확 나타납니다. 조심스럽게 새로운 96 웰 플레이트에 상층 액의 38 μl를 전송합니다.
    7. 적인 형광 방법으로 각 샘플의 수율을 결정합니다. 평가 수익률이 30 및 50 NG / μL 사이에있는 경우 프로토콜의 첫 번째 부분은 검증 될 것이다.
  3. 1 일 하이브리드
    1. 새로운 96 - 웰 플레이트에 각 시료 500 ng를 혼합하여,이 단계에서 풀당 12 샘플까지 풀. 각 풀의 최종 부피가 40 μl를 초과하지 않도록하십시오.
      NOTE : (: 가열 DNA 저하 원인으로 심지어 30 ° C에서, DNA의 농도는 가열에 의해 변형 될 수 없다주의) 필요한 경우, RT에서 진공 농축기 장치를 사용하여 풀의 양을 감소시킨다. 추가 RSB 용액 40 μL에 최종 볼륨을 조정합니다.
    2. 철저하게 믹스NCT1 솔루션입니다. 풀링 된 DNA 샘플의 각 웰 포함하는 40 ㎕를 들어, NCT1의 50 μL 및 CSO의 10 μl를 추가합니다. 부드럽게 위아래로 10 배 전체 볼륨을 피펫, 100 μL에 피펫을 설정합니다. 20 ° C에서 280 XG에서 1 분 동안 접시와 원심 분리기를 밀봉.
    3. 열 순환기의 판 (표지 100 ° C로 가열) 및 실행 프로그램 2 (표 1)를 배치합니다.

4 gDNA를 심화 : 2 일, 아침

  1. 시작하기 전에
    1. DNA 농축 키트에서 해동 (자재 / 장비의 표 참조)이 N의 NaOH, 용출 버퍼 1 ET2, 스트렙 타비 딘 자석 구슬 (SMB), 세척 용액 1 (WS1), 세척을 대상으로 (HP3), 대상 용출 버퍼 1 (ET1) 솔루션 2 (WS2), 세척 용액 3 (WS3), RT에서 CSO 및 NCT1 솔루션을 제공합니다.
  2. 1 일 하이브리드 워시
    1. 20 ° C에서 280 XG에 열 순환기 원심 분리기 1 분에서 96 웰 플레이트를 제거합니다. 매우 carefu 접착 덮개를 제거합니다에서야.
    2. 새로운 MIDI 96 웰 플레이트에 플레이트에서 100 ㎕의 반응 믹스를 전송하고 잘 텍싱 SMB 솔루션의 250 μl를 추가합니다. 부드럽게 위아래로 10 배 전체 볼륨을 피펫, 350 μL에 피펫을 설정합니다. 플레이트를 밀봉하고 실온에서 30 분 동안 배양한다.
    3. 20 ° C에서 280 XG에 1 분 동안 원심 분리기, 접착제 씰을 제거하고 2 분 동안 자기 스탠드에있는 플레이트에 배치합니다. 상층 액이 완전히 명확 나타나는지 확인합니다. 상층 액을 버리고 자기 스탠드에서 플레이트를 제거합니다.
    4. 잘 들어있는 구슬로 잘 혼합 WS1 용액 200 μl를 추가합니다. 거품 / 거품의 형성을 피할 수 아래로 15 배 전체 볼륨 업 및 200 μL에 피펫을 설정하고 부드럽게 피펫.
    5. 2 분 동안 자기 스탠드에 접시를 놓습니다. 상층 액이 완전히 명확 나타나는지 확인합니다. 상층 액을 버리고 자기 스탠드에서 플레이트를 제거합니다.
    6. 우물 conta의로 잘 혼합 WS2 용액 200 μl를 추가ining 구슬입니다. 200 μL에 피펫을 설정하고 부드럽게 전체 볼륨 업을 피펫 아래로 15 배 거품 / 거품의 형성을 방지.
    7. 2 분 동안 자기 스탠드에 접시를 놓습니다. 상층 액이 완전히 명확 나타나는지 확인합니다. 상층 액을 버리고 자기 스탠드에서 플레이트를 제거합니다.
    8. 구슬을 포함 우물에 잘 혼합 WS2 용액 200 μl를 추가합니다. 200 μL에 피펫을 설정하고 부드럽게 위아래로 15 배 전체 볼륨을 피펫.
    9. 새로운 96 - 웰 플레이트의 전체 볼륨을 전송. 플레이트를 밀봉하고 열 순환기 (덮개가 100 ° C로 가열)에서 접시를 놓습니다. 30 분 동안 42 ° C에서 열 순환기를 시작합니다.
    10. 는 즉시 2 분 동안 자기 스탠드에있는 플레이트에 배치합니다. 상층 액이 완전히 명확 나타나는지 확인합니다. 봉인을 제거하고 즉시 모든 상층 액을 버린다. 그런 다음, 자기 스탠드에서 플레이트를 제거합니다.
    11. 구슬을 포함 우물에 WS2의 200 μl를 추가합니다. 200 피펫을 설정μl를 부드럽게 전체 볼륨 업을 피펫 아래로 15 배 거품 / 거품의 형성을 방지. 플레이트를 밀봉하고 열 순환기 (덮개가 100 ° C로 가열)에서 접시를 놓습니다. 30 분 동안 42 ° C에서 열 순환기를 시작합니다.
    12. 즉시 2 분 동안 자기 스탠드에있는 플레이트에 배치합니다. 상층 액이 완전히 명확 나타나는지 확인합니다. 봉인을 제거하고 즉시 모든 상층 액을 버린다. 그런 다음, 자기 스탠드에서 플레이트를 제거합니다.
    13. 구슬을 포함 우물에 잘 혼합 WS3 용액 200 μl를 추가합니다. 200 μL에 피펫을 설정하고 부드럽게 위아래로 15 배 전체 볼륨을 피펫.
    14. 2 분 동안 자기 스탠드에 접시를 놓습니다. 상층 액이 완전히 명확 나타나는지 확인합니다. 모든 상층 액을 버리고 자기 스탠드에서 플레이트를 제거합니다.
    15. WS3이 2 번 씻어 반복합니다.
    16. 상층 액을 제거한 후, 잔류 뜨는을 아래로 끌어 판과 간단히 원심 분리기를 밀봉. 에 접시를 놓고2 분 동안 자기 스탠드. 잔류 상층 액을 버린다.
    17. 0.2 ML 튜브에서 ET1의 28.5 μL 및 HP3 솔루션의 1.5 μl를 섞는다. 이 혼합 더 풀을 준비하는 경우, 준비 풀의 숫자로 이러한 볼륨을 곱 한 수영장입니다.
    18. 자기 스탠드에서 플레이트를 제거합니다. 상기 제조 믹스 23 μl를 추가합니다. 23 μL에 피펫을 설정하고 부드럽게 위아래로 15 배 전체 볼륨을 피펫. 플레이트를 밀봉하고 실온에서 5 분 동안 둡니다. 20 ° C에서 280 XG에 1 분 동안 원심 분리기.
    19. 2 분 동안 자기 스탠드에 접시를 놓습니다. 상층 액이 완전히 명확 나타나는지 확인합니다. 접착 필름을 제거하고 새로운 96 웰 플레이트에 상층 액의 21 μl를 전송합니다.
    20. 각 웰에 ET2 솔루션의 4 μl를 추가합니다. 25 μL에 피펫을 설정하고 부드럽게 위아래로 10 배 전체 볼륨을 피펫 판을 밀봉하십시오.
      참고 : 프로 시저가이 시점에서 중지 될 수 있고, 반응이 -15 ° C에서 최대 7 일간 저장. 플레이트가 고정되어있는 경우, 완전히 2 차 하이브리드를 시작하기 전에 해동.
  3. 2 차 혼성화
    1. 20 ° C에서 280 XG에서 1 분 동안 접시를 원심 분리기. 접착 필름을 제거하고 라이브러리의 25 μL에 NCT1의 50 μL, CSO의 10 μL, 그리고 PCR 등급 물 15 μl를 추가합니다. 100 μL에 피펫을 설정하고 부드럽게 위아래로 10 배 전체 볼륨을 피펫.
    2. 20 ° C에서 280 XG에서 1 분 동안 접시와 원심 분리기를 밀봉.
    3. 열 순환기의 판 (표지 100 ° C로 가열) 및 실행 프로그램 2 (표 1)를 배치합니다.

5 gDNA를 심화 : 2 일, 오후

  1. 시작하기 전에
    1. 해동 ET1, ET2, SMB, WS1, WS2, WS3 및 하이브리드 세척에 대한 RT에서 HP3 솔루션을 제공합니다. DNA 농축 키트에서 PCR 증폭을위한 얼음에 PCR 마스터 믹스를 포함하는 중합 효소 (TC-PMM), PCR 프라이머 칵테일 (PPC)와 RSB 솔루션을 해동.
  2. 2 차 하이브리드 워시
    1. 1 차 혼성화 세척 - 4.2과 완전히 동일한 프로토콜을 따르십시오.
  3. PCR 증폭
    1. 새로운 96 웰 플레이트에서, 단계 5.2, TC-PMM의 25 μL 및 PPC의 5 μL에서 용출의 20 μl를 섞는다. 50 μL에 피펫을 설정하고 부드럽게 위아래로 10 배 전체 볼륨을 피펫. 20 ° C에서 280 XG에서 1 분 동안 접시와 원심 분리기를 밀봉.
    2. 열 순환기의 판 (표지 100 ° C로 가열) 및 실행 프로그램 3 (표 1)를 배치합니다.

6 gDNA를 심화 : 3 일

  1. 시작하기 전에
    1. 얼음 해동 RSB 솔루션입니다. 적어도 30 분 사용 전에, RT로 정제 자성 비드를 가져온다.
  2. PCR 정화
    1. 20 ° C에서 280 XG에서 1 분 동안 단계 5.3에서 접시를 원심 분리기 및 접착 덮개를 제거합니다.
    2. RT에서, 페이지의 90 μl를 추가reviously 아니라 각 정제 자석 구슬을 혼합. 부드럽게 위아래로 10 배 전체 볼륨을 피펫, 140 μL에 피펫을 설정합니다. 실온에서 15 분 동안 품어. 실온에서 5 분 동안 자기 스탠드에 96 - 웰 플레이트를 놓습니다. 상층 액이 완전히 명확 나타나는지 확인합니다.
    3. (이 샘플 800 ㎕의 에탄올에 증류수 200 μl를 추가) 신선한 80 % 에탄올 용액을 준비합니다. 펠렛을 방해하지 뜨는 복용주의를 폐기하십시오.
    4. 자기 스탠드 플레이트 유지하면서, 비즈를 방해하지 않고, 각 웰에 새로 제조 된 80 % 에탄올 200 μL를 추가하고 RT에서 30 초 동안 배양 접시. 뜨는을 취소하고이 세차를 한 번 더 반복합니다. 에탄올이 꺼 졌는지 확인되었습니다. 플레이트는 자기 스탠드에있는 동안 15 분 동안 또는 에탄올을 완전히 증발 할 때까지 실온에서 건조 보자.
    5. 자기 스탠드에서 플레이트를 제거하고 RSB 버퍼의 30 μl를 추가합니다. t 피펫 부드럽게 30 μL에 피펫을 설정하고그는 전체 볼륨 위아래로 10 배. 실온에서 2 분 동안 접시를 품어.
    6. 자기 스탠드에 96 - 웰 플레이트를 놓고, 5 분 동안 또는 완전히 맑은 상청액이 나타날 때까지 배양한다. 조심스럽게 새로운 96 웰 플레이트 (: TCY 플레이트 타입)에 상층 액의 28 μl를 전송합니다.
      NOTE : 절차는이 단계에서 중단 될 수 있고, 반응은 최대 7 일 동안 -15 ℃에서 보관.
  3. 라이브러리 확인 및 정량
    1. 단편 분석기를 사용하여 라이브러리의 질을 결정한다. 고해상도 아크릴 아미드 겔 전기 영동은 위에서 언급 한 단계를 대체 할 수도 있지만, 권장되지 않는다. 조각은 150 BP와 1000 bp의 사이에 있어야한다.
      권장 : 주 연속 동안 클러스터의 최적의 수를 얻기 위해 qPCR에 의해 라이브러리를 정량화.
    2. 참고로, 검증 된 라이브러리 (2 nm의)를 사용합니다. 제 라이브러리를 제조하는 경우, sequenc의 교정을 위해 제공 PhiX 파지 DNA (10 nM의)을 사용장치를 보내고.
    3. , 20 (7)에서의 포인트를 획득하기 위해 양성 대조군의 일련의 희석액을 제조 16, 8, 6, 4, 2, 1 EBT시 (EB 용출 완충액 + 0.1 % 트윈 20). 1 / 1000과 1 / 2000에 관심있는 라이브러리를 희석. 각 점은 세중 분석해야합니다.
    4. 잘 일에 대한 qPCR에 마스터 믹스 (2 배)를 포함 SYBR 녹색의 10 μL, 앞으로 프라이머 0.2 ㎕의 (10 μM, AATGATACGGCGACCACCGAGAT), 역 프라이머 0.2 μl를 추가 (사용 우물의 수를 곱 볼륨) 다음 믹스를 준비 (10 μM, CAAGCAGAAGACGGCATACGA), 7.6 ㎕의 PCR 등급 물입니다.
    5. 혼합 한 후, 양성 대조군 도서관 희석액의 각 웰과 2 μL로, 96 웰 플레이트에 믹스 18 μl를 면직. 20 ° C에서 280 XG에서 1 분 동안 접시와 원심 분리기를 밀봉. 그런 다음, 정량 PCR 열 순환기 및 실행 프로그램 4 (표 1)에서 접시를 놓습니다.
    6. 각 L의 수율을 얻기 위해, 종래와 같은 절대 정량 결과를 분석ibrary. qPCR에의 장점은 오직 플로우 셀과 상호 작용 DNA 정량화한다는 것이다.
      참고 : 인해 시약의 하나의 DNA 모방 분자의 존재로 DNA의적인 형광 정량을 사용하지 마십시오. 이 정량 방법은 라이브러리 수율을 과대 평가하고 그 결과 클러스터링 점수를 과소 평가하는 것입니다.
  4. 시퀀싱 런칭
    1. 용출 버퍼 (EB)의 30 μL의 최종 볼륨에서 4 nm에서 각 라이브러리를 희석하고, 모든 라이브러리를 풀 잘 섞는다.
    2. EB 버퍼에 신선한 0.2 N NaOH 용액을 준비하고 풀링 라이브러리의 10 μL로이 NaOH 용액 10 μl를 섞는다. 잘 혼합하고 실온에서 정확히 5 분을 품어.
    3. 5 분 후, 즉시 (순서 카트리지에서) 하이브리드 버퍼의 980 μl를 추가하고 잘 섞는다. 그리고, 하이브리드 버퍼 600 μL이 혼합물의 400 μl를 섞는다. 잘 혼합하고 (8)의 주입을 위해 카트리지 300주기 (2 × 150)에 600 μl를 전송할시. 실행 순서.

7 데이터 분석

  1. 장치가 데이터를 처리 한 후에, 새 컴퓨터로 .bam 및 .VCF 파일을 전송.
    참고 : Transposase 조각화 발자국을 통합합니다. 따라서, 소프트웨어는 자동으로 이러한 데이터를 트리밍.
  2. 장치 분석을 얻은 유전 적 변이를 수집합니다.
  3. 제조업체의 지침에 따라 다른 소프트웨어 (Alamut)와 함께 보낸 파일 (.bam, .VCF)를 분석 할 수 있습니다. 그런 다음 모두 분석 얻은 유전자 변이를 비교합니다. 만 변화는 두 번 본 것으로 간주됩니다 발견했습니다.

표 1 PCR 조건

프로그램 온도 시간 민. 반복
1 72 ° C 3 분 1
98 ° C 30 초 1
98 ° C 10 초 10
60 ° C 30 초
72 ° C 30 초
72 ° C 5 분 1
10 ° C 무제한
이 95 ° C 10 분 1
93 ° C 1 분 1
91 ° C 1 분 1
89 ° C 1 분 1
87 ° C 1 분 1
85 ° C 1 분 1
83 ° C 1 분 1
81 ° C 1 분 1
79 ° C 1 분 1
77 ° C 1 분 1
75 ° C 1 분 1
71 ° C 1 분 1
69 ° C 1 분 1
67 ° C 1 분 1
65 ° C 1 분 1
63 ° C 1 분 1
61 ° C 1 분 1
59 ° C 1 분 1
58 ° C 1 분 16 ~ 18 시간
3 98 ° C 30 초 1
98 ° C 10 초 10
60 ° C 30 초
72 ° C 30 초
72 ° C 5 분 1
10 ° C 무제한
4 95 ° C 10 분 1
95 ° C 15 초 40
60 ° C 1 분

결과

샘플 QC 결과

표적 유전자의 서열을 결정하는 본 방법의 기능은 gDNA를 (도 2a)의 품질 및 tagmentation 단계의 품질에 기초한다. tagmentation은 (도 2b를 참조하면, 상부 패널) 충분하지 않은 경우, 시퀀스는 만족스럽지 않을 것이다. 전술 한 바와 같이, tagmentation 정제 후, gDNA를 약 300 bp의 단편의 대부분 (도 2B, 하부 패널)로 1000 염기쌍 150로부터 염기?...

토론

NGS 장치 및 기술의 광범위한 사용은 암과 유전 질환의 연구에 새로운 기회를 제공하고 있습니다. 전체 게놈 염기 서열 또는 RNA 서열에 더하여, 다수의 환자에서 선택된 서열의 gDNA를 다량의 분석을 동시에 진단에 큰 가능성을 제공한다. 여기에, 우리는 중간 서열 분석 장치 (자재 / 장비의 표)와 동시에 24 명에서 11 완전한 유전자를 연구하는 Nextera 기술을 사용하여 (필요시) 특정 디자인을 개발했다...

공개

The authors have no conflicts of interest to declare.

감사의 말

We thank the Ligue contre le Cancer de Côte d’Or and the Centre Georges-François Leclerc for their financial support. We thank Philip Bastable for the editing of the manuscript.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
MiSeqIlluminaSY-410-1001Sequencing/medium throughput device
Nextera Enrichment kitIlluminaFC-123-1208Transposase based technology
300 cycle cartridgeIllumina15033624
AMPure beadsBeckman CoulterA63881Magnetic purification beads
Magnetic standAlpaquaA32782
96-well PlatesLife Technologies4306737
MIDI 96-well platesBioradAB0859
Microseal ABioradMSA-5001This seal is necessary only for PCR amplification. Other standard seals can be used throughout the experiment
MiSeqIlluminaProvided with the sequencing device
Experiment Manager software
Internet adress: http://designstudio.illumina.com/NexteraRc/project/new
Manufacturer website tool

참고문헌

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