무선 원격 측정 시스템은 척수 절개 및 배아 신경 세포 이식 줄기와 흰쥐의 심장 혈관 기능을 모니터링 할 수

요약

우리는 병변 부위에 이식 팔주 배아 뇌간 신경 줄기 세포 후 T4 척수 가로로 쥐 심혈관 매개 변수를 기록하기 위해 무선 원격 측정 시스템을 사용하기위한 프로토콜을 제시한다. 텔레 메 트리 정확하게 의식이 자유롭게 이동 척수 손상 쥐의 심장 기능을 평가하는 첨단 기술이다.

초록

높은 흉추 또는 경추 척수 손상 (SCI)는 심장 혈관 기능 장애로 이어질 수 있습니다. 심혈관 매개 변수를 모니터하기 위해 또는 녹색 형광 단백질을 발현하는 배아 뇌간 유래의 신경 줄기 세포의 그라프없이 T4 척수 절개를받은 쥐의 대퇴 동맥에 무선 송신기에 연결된 카테터를 주입. 이러한 캐뉼라 삽입 또는 꼬리 - 커프와 같은 다른 방법에 비해, 원격 측정은 연속적으로 자유롭게 움직이는 동물에서 혈압 및 심박수를 모니터링하는 것이 유리하다. 또한 장기적으로 다수의 데이터 획득이 가능하다. 척수 손상 쥐에서 대장 팽창 님의 억제되지 않은 상태와 자율 dysreflexia에서 기저 심혈관 데이터가 성공적으로 기록되었다. 송신기는 척수 절개 전에 주입되는 경우 또한, 전 및 후의 SCI 심혈관 파라미터가 동일한 쥐에 비교 될 수있다. 설명 telemet의 한 가지 제한RY 과정은 대퇴 동맥에 주입이 동측 뒷다리에 혈액 공급에 영향을 미칠 수 있다는 것이다.

서문

심장 혈관 장애는 높은 수준에서 척수 손상 (SCI) 이후에 발생합니다. 이 무질서 혈압과 심박 휴지, 기립 성 저혈압, 운동 유발 성 저혈압 및 부상 레벨 아래 ^1,2 감각 자극에 응답하여 고혈압과 압력 반사 매개 서맥 에피소드 특징 자율 dysreflexia에 명시된다. 이러한 현상은 척수 손상 환자의 일상 생활을 방해. 따라서, SCI 및 실험 동물의 치료와 심장 혈관 변화의 조사를 위해 효과적인 도구를 확립하는 것이 중요하다.

동물에서 심혈관 기능을 조사하기 위해, 여러 가지 기술들은 혈압과 심박을 모니터링하는데 사용되어왔다. 비침 꼬리 커프스 말초 혈압 ^3을 측정하기 위해 이용 될 수있는 반면 중앙 심혈관 파라미터는, 캐 뉼러 삽입 및 원격 측정에 의해 기록 될 수있다. 다른 방법에 비해 텔레metry가 자유롭게 움직이는 동물 및 심혈관 기능 ^(4)의 장기 모니터링 연속 기록 가능 주요 장점을 갖는다. SCI의 동물 모델에서 실험적 자극 후 말초 혈압의 변화를 검출 할 수있을만큼 크지 않을 수있다. 따라서, 적합한 심장 모니터링 기술은 SCI와 동물 선정되어야한다.

본 연구에서, 무선 원격 측정 시스템은 완전한 척수 절개 후 성인 쥐 심장 기능을 모니터링하기 위해 도입되었다. 쥐 병변 사이트에서 동계 쥐 배아 일 14 (E14) 뇌간 유래 신경 줄기 세포 (BS-NSCs의)의 이식을 받았다. 부상없이 이식하고 순진한, 손상되지 않은 쥐와 쥐 컨트롤 역임했다. 원격 측정 절차는 송신기 및 멸균 주입 (도 1), 기저 심혈 관계 파라미터의 기록, 결장 팽만 유도 응답 및 전송기 청소 등을 포함저장.

프로토콜

모든 동물 프로토콜은 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 하였다. 실험실 동물 관리 및 안전에 대한 NIH의 지침을 반드시 따라야한다. 수술 절차와 동물을 적절하게 고통과 불편을 최소화하기위한 처리 하였다.

1 척수 Curgery 및 셀 접목

1. 모든 수술 이전에 오토 클레이브 수술 도구. 다른 동물에 대한 절차와 악기에서 병원균 및 미생물 오염 물질을 제거 할 수있는 핫 구슬 살균기 (파인 과학 도구)를 사용합니다. 수술시 무균 수술 장갑, 가운 및 커튼을 사용합니다. 각 수술에 대한 무균 수술 기법을 사용한다.
2. 암컷 피셔에게 복강 내 주사 (IP)를 통해 투여 케타민 (25 ㎎ / ㎖), 자일 라진 (1.3 ㎎ / ㎖), 및 아세 프로 마진 (0.25 ㎎ / ㎖)의 조합으로 344 래트 (2 ㎖ / kg)을 마취.
3. 다시 영역을 면도하고 Betadine 및 에탄올로 반복적으로 피부를 청소합니다.
4. # 10 블레이드를 사용하여 피부를 잘라 퉁명스럽게 근육 층을 해부하다. , 척추를 분리 T3 척추를 노출하고, 뾰족한 rongeurs를 사용하여 지느러미 후궁 절제술을 수행하기 위해 메스를 사용합니다.
5. 종 방향 및 경막을 절개 척수 덩어리 사이에 약 1mm rostrocaudal 간극을 만드는 홍채 절제술 위 및 microaspiration의 조합을 사용 T4 수준에서 척수를 쪼개다.
6. 3-0 Vycril와 완전히 출혈이 중지되며, 봉합 근육까지 2 분, 상처 클립 피부를 닫습니다 -에 대한 일을 기다립니다.
7. 락 테이트 링거액 (5 ㎖), 부 프레 노르 핀 (0.035 ㎎ / ㎏), 피하 즉시 수술 후 암피실린 (33 ㎎ / ㎏)을 주입하고 깨어 때까지 따뜻한 인큐베이터에서 쥐를 유지한다.
8. 주사 링거와 회 삼일 또는 통증과 고통의 흔적이 사라질 때까지 암피실린 회 십일까지 솔루션 및 부 프레 노르 핀. F까지 다른 동물의 회사에 동물을 반환하지 않습니다ully 복구.
9. 수동 비우는 휘어진 방광의 설립까지 두번 약 2 주 동안 하루 방​​광을 비우고, 필요한 경우 다음 생존에 걸쳐 하루에 한번 방광을 비울.
10. 2 주 후 전술 한 바와 같이, SCI 래트를 다시 마취 및 척수 병변 사이트를 재 노출. 병변 사이트에서 이식 된 세포를 유지하기 위해 폐쇄 경질을 유지합니다.
11. 병변 공동의 진원지 여러 주입 병변의 주동이와 꼬리 인터페이스로, 10 E14 유비쿼터스 GFP 유전자 변형 쥐의 배아에서 수집 피브리노겐에 포함 된 세포 용액 (3.5 × 10 ⁵ μL), ㎕의 트롬빈 ^5,6 주입 해밀턴 주사기에 연결된 40 μM의 내경으로 뽑아 유리 마이크로 피펫을 사용하는 사이트.
12. 근육 층을 봉합하고 상처 클립 피부를 닫습니다.
13. 1.8 - 1.6 단계에 설명 된대로 수술 후 주입 및 방광 관리를 수행합니다.
14. 한 주 수이물 관류는 척수 ⁷ 복강 역행 라벨 교감 신경절 뉴런 0.5 % Fluorogold (FG, 증류수 0.4 ㎖) 주사.

2 송신기 주입

1. 멸균을 실온에서 2 시간 (최대 10 시간까지) - 적어도 1 transmittersin보기 2 % 글루 타르 알데히드 용액 (증류수 96 ㎖ 중의 50 % glutaraldhyde 4 ml)에 담근다.
2. 철저하게 멸균 된 0.9 %의 생리 식염수로 3 회 송신기를 세척하고 사용 (더 이상 일 이상 시간)까지 식염수에 저장합니다.
3. 여덟 주 E14 세포 이식 (10 주 포스트 부상) 후, 또는 세포 이식 및 순진한 대조군없이 SCI을 시행 한 쥐를 reanesthetize.
4. 복부와 뒷다리를 면도. Betadine로 피부를 청소합니다. 앙와위에서 수술 테이블에 쥐를 놓습니다.
5. # 15를 이용하여 블레이드 우측 복부 복부와 허벅 다리의 피부를 절개.
6. 의를 통해 잘라ubcutaneous 결합 조직은 작은 가위를 사용하여 대퇴 혈관과 신경의 번들을 노출합니다.
7. 곡선 팁 미세 집게를 사용하여 혈관과 신경의 대퇴 동맥을 분리합니다.
8. 동맥 아래 세 실크 봉합사를 넣고 각 봉합의 느슨한 매듭을합니다.
9. 이후 카테터에 대한 혈관 확장을 유도하는 동맥의 표면에 0.1 ㎖의 리도카인 (2 %)를 적용한다.
10. 근위 느슨한 실크 봉합사를 스트레칭에 의해 영구적 인 실크 매듭 및 임시 블록 원심 용기를 고정합니다.
11. 20 게이지 바늘을 사용하여 곡선을 천공하고 동맥 카테터 삽입 도구를 사용 측거기 카테터 (8 ㎝ 길이)의 선단을 삽입한다.
12. rostrally까지하여 흉부 대동맥에 팁을 배치 4cm에 카테터를 삽입합니다.
13. 대퇴 동맥 주위에 세 실크 봉합사를 묶는하여 혈관 내 카테터를 고정합니다.
14. 흉곽과 t의 꼬리 가장자리 사이의 측면을 따라 피하 주머니 만들기그는 무딘 가위로 무릎의 범위를 대부분의 두개골 확장.
15. 과도한 움직임을 방지하기 위해 송신기 주변 결합 조직에 포켓과 봉합에 송신기 몸체를 삽입한다.
16. 제 6 비단실로 피부를 봉합.
17. 락 테이트 링거액 (5 ㎖), 부 프레 노르 핀 (0.035 ㎎ / ㎏), 피하 즉시 수술 후 암피실린 (33 ㎎ / ㎏)을 주입하고 깨어 때까지 따뜻한 인큐베이터에서 쥐를 유지한다.

3 기초 평균 동맥압 (MAP) 및 심박수 (HR) 녹화

1. 일찍이 송신기 주입 다음 일일로, 수신기 패드에 하나의 동물을 넣고에 송신기를 켜십시오. 심장 혈관 매개 변수를 동물을 길들과 안정 15 분 - 약 10 기다립니다.
2. 적어도 1 시간 동안 전산 데이터 수집 시스템과 펄스 동맥압로부터 유도되는 기록 쉬고 MAP 및 HR. 데이터마다 5 초를 수집합니다.
3. 모니터imals 연속적으로 가시 경련의 발생시 데이터 요소를 제거한다. 각각의 동물의 경우, 평균 데이터 포인트의 평균값을 얻는다.

4 대장 자율 Dysreflexia 팽만에 의한

1. 송신기 수신기 내부의 음식 펠릿와 함께 제공되는 수건에 NSC-이식 또는 SCI 제어 쥐를 제지합니다. 보통 쥐 절차를 수행하는 동안 협력 머물 수 있습니다.
2. 약 2cm의 직장에 라텍스 풍선 팁 카테터를 삽입하고 테이프 ^팔과 꼬리에 고정.
3. 에 송신기의 전원을 켜고 10 기다립니다 - 15 분은 혈압이 preinsertion 기준에 응답 할 수 있습니다.
4. 약 30 mmHg로의 압력을 발생하기 위해, 서서히 1 분간 공기 1.4 mL를 10 초 동안 풍선의 팽창에 의해 결장 팽창을 유도한다.
5. 기록 MAP 및 전 HR 1 분 동안 1 분, 대장 팽창 후 1 분; 샘플 데이터를 3 분의 절차를 수행하는 동안 3 초마다.
6. 이 시험 사이에 적어도 15 분 복구 간격으로 동물 당 3 시험 - 2를 수행합니다.
7. 만약 더 이상의 평가 위에서 설명한 두 번 투여 마취 조합으로 과다 복용 동물 (IP). 4 % 파라 포름 알데히드이어서 식염수 동물들을 관류.
8. 각각의 동물의 경우, 이전에 각각 결장 팽만 동안 값을 평균; 기준 및 각 시험에 대한 팽만에 의한 MAP와 HR의 변화 사이의 차이를 계산; 2 평균 이상 - 3 시험은 평균값을 얻었다.

5 송신기 청소

1. 마취 후와 관류하기 전에 동물의 몸에서 송신기를 제거합니다. 청소 때까지 증류수로 가득 비커에 즉시 담근다; 텔레 장치의 건조를 방지.
2. 실온에서 24 시간 동안 1 % Terg-A-Zyme 효소 세척 용액 (10g / L의 물)로 텔레을 전송합니다.
3. 무딘 30 게이지 바늘로 송신기 카테터의 끝을 Regelregel 주사기에 연결.
4. 조심스럽게 접힌 부드러운 티슈를 사용하여 송신기를 건조하고 원래 플라스틱 트레이에 보관합니다.

결과

상기 원격 측정 기술을 이용하여, 우리는 성공적 척수 손상 동물에서 심혈관 매개 변수를 기록했다. HR 이전 보고서 ^9과 일치 순진한 동물에 비해 증가하는 반면 단독으로 SCI와 동물에서 MAP은 크게 감소 하였다. BS-NSC 이식,지도 및 HR과 동물에서 순진한 동물에서 측정 된 수준 (그림 2)에 접근했다. 유해 자극 MAP 상승 및 ^3,8 HR의 감소를 생성하면 결장 팽만 동안, 래트는 dy...

토론

전통적으로, 유체가 채워진 뉼러 동맥에 삽입하고, 각 동물 ¹¹ 스냅 단자로서 심혈관 매개 변수를 기록하기 위해 압력 변환기에 연결된다. 연속적으로 장시간 심혈관 성능을 모니터링하는, 무선 원격 측정 시스템은 여러 실험실에서 사용된다. 이 세련 도구는 자유롭게 동물을 이동, 의식의 혈압을 기록 할 수 있습니다. 유체 가득 카테터에 비해 원격 측정은 정확하게 SCI 동물에서 심장 혈?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fibrinogen (rat)	Sigma	F6755-25MG	2 hr at 37 oC to dissovle
Thrombin (rat)	Sigma	T5772-100UN	Dissovle in 10 mM CaCl2
1% Terg-A-Zyme	Sigma	Z273287	Enzymatic solution for telemeter cleaning
Fluorogold	Fluorochrome		Dissovle in distilled water and avoid light
Telemeter            (PA-C40)	Data Sciences International
Telementric recording and analysis system	Data Sciences International		Signal stimulator, Data Exchange Matrix, receivers, Ambient pressure reference monitor
Balloon-tipped catheter	Edward Lifesciences	111F7-P	For colorectal distension