정량 면역 형광 분석은 중심체에서 단백질 수준의 변화를 측정하기 위해

요약

Here, a novel quantitative fluorescence assay is developed to measure changes in the level of a protein specifically at centrosomes by normalizing that protein’s fluorescence intensity to that of an appropriate internal standard.

초록

중심체는 게놈 무결성을 유지 또는 세포에서 감각 기능을 용이하게하기 위해 차 섬모를 조립하는 유사 분열 스핀들의 기둥 역할을 작지만 중요한 소기관이다. 단백질의 수준은 다른 위치들에서보다 .cellular 중심체에서 다르게 조절 될 수 있고, 세포주기의 여러 다른 지점에서의 centrosomal 단백질 레벨의 변화는 중심 소체 조립체의 적절한 조절에 중요​​한 것으로 보인다. 우리는 세포주기의 다른 단계에서와 같은 각종 시약으로 처리 한 후 다른 샘플들로부터 고정 된 세포 중심체에서 단백질의 상대 수준의 변화를 측정하는 정량적 형광 현미경 분석법을 개발 하였다. 이 분석의 원리는 소 영역에서의 단백질에 대응하는 배경 보정 된 형광 강도를 측정에 놓여, 및 선택된 실험 C 하에서 변하지 않는 또 다른 단백질에 대해 동일한 측정을 정상화 그ondition. BrdU의 펄스와 교란 세포주기를 연구 추격 전략과 함께이 분석을 활용하여, 우리는 정량적으로 특별히 중심체에서 프로 테아 좀 중재 저하에 의해 가능성이 VDAC3의 centrosomal 풀 세포주기 동안 중심체에서 규제되고 우리의 최근의 관찰을 검증했다.

서문

중심체는 pericentriolar 물질 (PCM)으로 둘러싸인 중심 소체의 쌍으로 구성되어 있습니다. 포유 동물 세포의 주요 미세 소관 조직 센터 (MTOCs)이기 때문에, 중심체는 분할 세포에서 유사 분열 스핀들의 두 기둥 역할을하고, 따라서 게놈 무결성 ^1을 유지하는 데 도움이. (G0 단계에서 예) 대기 세포에서, 중심체, 즉 머더 중심 소체의 두 중심 소체 중 하나는 일차 섬모, 세포 표면 ^(2)로부터 돌출 감각 소기관 조립 기부 본체로 변형된다. 일단 세포가 세포주기를 다시 입력 일차 섬모 분해하여 각 중심 소체 서서히 성숙한 중심 소체 ^(3)을 형성하는 그것의 신장 기단부 procentriole의 조립을 지시한다. S 단계의 개시시에 중심 소체 9 대칭성을 제공 수레 바퀴 형 구조는 기존의 각 중심 소체의 표면에 형성되고, 각각의베이스 procentriole해질 것이다. Sas6의 t중심 소체 조립체 ^4-6 수레 바퀴의 중심을 형성하기 위해 채용되는 모자 불가결하다. 다른 centriolar 단백질은 말초 방식으로 ⁷ 엄격한 규제, 근위부의 수레 바퀴에 조립된다. 정확하게 중심 소체 중복을 완료 한 후, 세포를 G2 단계 ^(8)의 단부가 두 기능 중심체를 구축하는 추가 물질 pericentriolar 조립한다. 핵심 centriolar 구성 요소 ^9-11, 키나제, 포스, 보호자, 비계 구성 요소, 멤브레인 관련 단백질 분해 기계 등 여러 가지 다른 단백질뿐만 아니라 세포주기 ^12-16의 서로 다른 시간에 중심 소체, 기저 기관 및 PCM과 연결되어 있습니다. 그것은 종종 많은 단백질의 centrosomal 레벨이 일시적으로 centrosomal 타겟팅 메커니즘 및 / 또는 중심체에서 프로 테오 저하에 의해 규제된다는 점에 유의한다. 중요한 것은, 이러한 PLK4, Mps1, Sas6 및 CP110의 여러 단백질의 centrosomal 수준의 변동세포주기 t의 상이한 점은 중심 소체 조립체 ^5,17-22을 조절하는 것이 중요 할 것처럼,이 열화를 방지 centrosomal Mps1의 경우에 과량의 중심 소체 ^(19)의 형성을 이끈다. 한편, 여러 가지 단백질의 세포질 분획 centrosomal 풀에 비해 덜 불안정하다. 예를 들어 하향 조절 Centrin 2 (Cetn2)의 매개 된 siRNA는 그 전체 셀 레벨 ^(23)에서 큰 감소에도 불구 중심 소체에서 단백질의 수준이 적당하게 감소되었다. 오히려 그들의 중심체 특정 기능을 평가할 때 전 세포 단백질 수준을 측정하는 것보다 중심체에서 centrosomal 단백질 수준에서의 변화를 측정하는 것이 중요하다.

본 연구에서 우리는 중심체에서 단백질의 상대적인 수준을 정량화하는 간접 면역 형광 (IIF)를 사용하여 분석을 개발 하였다. 이 분석은 다른 샘플로부터 아르 세포를 분석하는데 특히 개발따라서 동시에 묘화 될 수 없다. 이들 샘플은 상이한 시점에서 수집 된 다른 시약 (즉, 약물 대 제어) 처리 한 세포가 될 수있다 (즉, 체이스 대 펄스) 또는 세포주기의 상이한 위상에있다. 이 분석의 원리는 배경 형광 강도 보정 소 영역에서 단백질에 대응하고, 그 레벨 선택 실험 조건에서 변화하지 않는 또 다른 단백질에 대해 동일한 값이 정상화 측정에있다. 중심체 생물학의 여러 연구는 최근에 후보 단백질 ^{24 ~ 27의} 중심체 고유의 기능을 결정하기 위해, 모두 라이브 또는 고정 세포에서 다양한 정량적 현미경 기술을 활용했다. 이러한 분석과 유사하게, 본 기술은 또한 시험 단백질의 백그라운드 보정 된 형광 강도를 측정한다. 그러나,이 분석에서 내부 표준을 사용하여 정규화 포함될 가능성이 큰 것이라고 알려정확성과 커버 슬립 상에 두 개의 서로 다른 두 개의 서로 다른 시료를 분석의 신뢰도. 또한, 중심체의 단백질 수준을 조사 이외에 약간의 조정으로이 방법은 실험 조건의 다양한 세트 또는 다른 부위에서 세포에 적용될 수있다.

여기서 우리는 다른 세포주기 단계에서 세포를 비교하는 BrdU의 펄스 체이스 전략과 우리의 양적 현미경 분석을 결합한다. 대신에, 다양한 세포주기 시점 공부 비동기식 성장하는 세포를 표준 세포주기 정지 및 해제 방법을 사용하는 S 단계에서 세포를 라벨 BrdU를 배양하고, 표지화 된 세포는 다양한 시간 (전형적으로 4-6 시간) 미국 쫓기는. 표지 된 세포의 대부분은 즉시 펄스 후 S 상에있을 것입니다. 체이스 후, 표지 된 세포는 형태 학적 특성 NUC에 대한 중심체의 이러한 된 직후 위치하여 확인할 수 있습니다 늦게 S, G2, 또는 유사 분열에 될 수 있도록 체이스의 길이는 선택레이, 중심체 사이 거리 등의 염색체 축합 따라서, 추적의 길이를 S, G2 및 특정 세포 유형의 M상의 평균 지속 기간에 의존한다. 이 접근법 등 히드 록시, aphidicolin, nocodazole 같은 세포주기 억제제를 방지하기 때문에, 더욱 중요한 생리 학적 세포주기 분석을 허용한다.

따라서, 우리는 단독 정량적 형광 현미경 분석법 또는 BrdU의 펄스 - 체이스 분석과 조합하여, 정확하게 섭동 세포주기 동안 후보 단백질 centrosomal 수준의 상대적인 변화를 측정하기위한 간단하지만 강력한 방법 인 것은 여기에서 설명한다. 우리는이 어 세이를 이용하여, VDAC3, 우리가 최근 ^{16, 28을} 미토콘드리아에 부가 중심체에서 식별 centrosomal 단백질 수준을 측정 하였다. 여기에서 얻어진 결과 VDAC3의 centrosomal 풀 저하에 의해 규제되는 우리의 이전의 관찰을 확인하고 또한 세포주기 dependen에 변화t 방식 ^(16)은 또한이 방법의 적용 성을 검증.

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프로토콜

1. 세포 배양

1. 역전사 효소 (는 hTERT) 불후의 망막 색소 상피 세포 인간 텔로 머라 아제를 사용 (의 hTERT-RPE1하면, RPE1 여기 함).
   주 : RPE1 세포 일반적 중심 소체 조립체와 ciliogenesis을 연구하는 데 사용되는 근거리 이배체 인간 형질 전환되지 않은 세포이다. 이 세포들은 규제 세포주기와 조정 정상적인 중심 소체 중복주기를 따르십시오.
2. 통로 1에서 RPE1 세포의 거의 합류 100mm 세포 배양 접시 : 10 ㎖를 함유하는 신선한 100mm 접시에 원래 배양 5 희석 DME / F-12 (1 : 1) 중 10 % 소 태아 혈청 (FBS), 100 U / ml의 페니실린 G 100 ㎍ / ml의 스트렙토 마이신 (전체 매체가 DME / F-12 매체로 함). 5 % CO ₂ 존재하에 37 ℃에서 세포를 성장한다.
   1. 물 목욕이나 인큐베이터에서 60 ° C에서 흔들림없이 덮여 유리 비커, O / N에서 1 N 염산 50ml에 12mm 라운드 커버 글라스를 품어.
   2. AF산 용액을 폐기 터가 가끔 흔들어 15 분간 배양하여 커버 슬립을 증류수 100㎖를 세 번 씻는다. 70 % 에탄올 및 95 % 에탄올 중의 마찬가지로 세탁을 반복.
   3. 개별적으로 60 분 동안 자외선으로 살균 다음에 생물 안전 캐비닛의 실험실 블로 팅 종이에 그들을 밖으로 확산으로 된 커버를 건조시킵니다.
3. 35mm 세포 배양 접시에 2-4 건조 된 커버를 놓습니다. 세포 배양 물에서 25 μg의 PBS / ㎖의 농도로 엔지니어링 중합체 (1 ㎎ / ㎖의 스톡 농도) 등 피브로넥틴 또는 피브로넥틴 용액을 희석.
   1. 각 커버 슬립에 희석 된 용액의 80 ~ 100 μl를 놓고 코트에 60 분의 coverslip의 상단 동안 품어. 전체 매체를 추가하기 전에 PBS를 사용하여 삼배 된 커버를 세척 할 것.

2. 성장 세포와 프로 테아 좀 억제제 치료 세포

1. 항로 2 × 10 ⁵ 비동기 적으로 성장각 35mm 접시 ING RPE1 세포는 커버 슬립을 함유하는 2 ml의 완전 배지에서 세포를 성장한다. 배양액에게 신선한 미리 예열 완료 매체와 매 24 시간을 교체합니다.
   1. 시험 단백질의 수준에 centrosomal 테아 좀 억제의 효과를 분석하는 (여기 VDAC3 또는 튜 불린-γ)은 44 시간 동안 두 35mm 접시에서 세포를 성장한다. 완전 배지로 배지를 교체하고, 각각 5 μM 또는 0.05 %의 최종 농도 제어 MG115 또는 용매로서 DMSO를 추가한다. 동시에, 4 시간 동안 세포를 40 μM의 최종 농도로 세포를 BrdU의 추가 배양한다.
   2. 24 웰 플레이트의 각 coverslip에 전송합니다. 각 웰에 500 ㎕의 냉각 메탄올을 추가하고 10 분이 된 커버에 세포를 해결하기 위해 -20 ° C에서 접시를 품어. 즉시 된 커버 500 μL 세척 버퍼로 3 회 세척 (0.5 mM의의 MgCl _2와 0.05 %를 포함하는 1X PBS를 트리톤-X 100).
2. 잔류를 수확35mm 접시 원심 분리기 5 분 1,000 XG에 세포에서 세포. 웨스턴 블롯 (단계 6)에 의해 전체 단백질을 분석하기 위해 세포 펠렛을 사용한다.

3. BrdU의 펄스 체이스 분석은 다른 세포주기 단계에서 단백질 수준을 분석하기 위해

1. 44 시간 동안 커버 슬립을 함유하는 두 개의 35mm 접시에서 세포 성장, 세포주기의 다른 단계에서의 중심체에서 단백질 (VDAC3 여기서, Sas6 또는 Cep135)의 레벨의 변화를 분석한다. 40 μm의 BrdU의를 포함하는 완전한 매체와 문화 매체를 교체하고 세포 배양 인큐베이터에서 4 시간 동안 세포를 배양한다.
2. 한 접시에서, 단계 2.1.2에서 설명 된 바와 같이 냉각 된 메탄올을 사용하여 세포를 고정하는 24- 웰 플레이트로 커버 슬립을 전송.
3. 4 시간의 BrdU의 펄스 후, BrdU를 함유 배지를 제거 PBS로 한번 세포를 세척하고 완전 배지로 한번, 다양한 시간 (전형적으로 추가의 4 시간 동안의 BrdU의 부재 하에서 세포를 새로운 배지를 추가하고 성장할단계 2.1.2에 기재된 바와 같이 세포를 고정하기 전에 RPE1 세포)에 대한.
   주 : RPE1 전지, BrdU의 양성 세포의 대부분은 4 시간 후 체이스 늦은 S 또는 G2 상에있다. 이는 각각의 세포 유형에 대해 독립적으로 결정되어야한다.

4. 면역 염색

1. 30 분 동안 (1X PBS로 2 % BSA 및 0.1 % 트리톤-100)을 블로킹 완충액 200 μL의 고정 된 커버에 세포를 배양한다.
   1. 차 항체가 혼합 된 세포를 품어 가습 실에서 4 ° C에서 버퍼 O / N 차단에 희석 (일반적으로 한 토끼에서 제기하고 다른 마우스에서 제기).
   2. 가습 실을하려면 빈 1,000 μL 피펫 팁 상자의 아래쪽에 젖은 종이 타월을 넣어. 랙 파라 필름의 표면 상에 스트립을 마련하고, 배양 될 각 커버 슬립에 대해 파라 필름 상에 항체 용액의 액적 (15 ~ 20 μL)을 더럽힐. 항체 용액의 방울에 커버 슬립을 반전 (세포 몰입되도록) 및 close팁 상자의 뚜껑.
   3. 다시 된 커버 전환하고, 24 웰 접시에 그들을 다시 돌아갑니다. 된 커버를 세척 한 다음 실온에서 1 시간 동안 (녹색 형광 염료 복합 항 - 토끼와 붉은 형광 염료 복합 항 - 마우스가 버퍼를 차단에 희석 여기) 150 μL 차 항체 혼합물에서 그들을 품어. 커버 슬립을 세 번 씻으십시오.
      참고 : 형광 접합 차 항체 광 감응성. 단계에서 빛으로부터 샘플을 보호 4.1.3-5.1.2.
2. 단계 2.1.2에 기재된 바와 같이, 10 분 동안 -20 ℃에서 500 ㎕의 냉각 된 메탄올로 다시 염색 RPE1 세포를 고정함으로써 방지 BrdU의 염색을 위해 준비한다. 세 번 된 커버를 세척 할 것.
   주 :이 고정은 다음의 단계에서 산 가수 분해 과정에서 관심 단백질 (들)의 일차 및 이차 항체 표지를 고정.
   1. RT에서 30 분 동안 2 N 염산 200 μL에서 세포를 배양한다. 1 M 트리스 (CL)의 300 μL, pH를 8로 중화세포를 세척 완충제로 3 회 세척 좋아.
   2. 다시 RT에서 30 분 동안 블로킹 완충액 200 μL를 사용하여 세포를 차단.
   3. 가습 챔버 내에서 37 ° C에서 45 분 동안 (블로킹 완충액에 희석) 래트 항 BrdU의 항체로 세포를 배양한다. , 24 웰 접시에 다시 된 커버를 돌려 그들을 씻어 준 후 실온에서 1 시간 동안 24 잘 접시에 버퍼를 차단 150 μL에 희석 블루 형광 염료 복합 항 쥐 이차 항체 (에 품어.
3. 커버 슬립을 세 번 씻으십시오. 유리 현미경 슬라이드에 antifade 시약을 함유하는 용액의 장착 방울 (약 3-6 μL)를 스팟. 셀 측이 장착 솔루션에, 아래로 향하게하여, 커버 슬립을 반전. 부드럽게 부드러운 세정 티슈를 사용하여 슬라이드에 커버 슬립을 눌러 물기를 닦아주십시오. 현미경 슬라이드에 그것을 밀봉 커버 슬립의 가장자리를 따라 투명 매니큐어를 적용합니다.

5. 면역 형광 이미지 Acquisition 및 분석

1. 상온에서의 BrdU 양성 RPE1 세포의 이미지를 획득 (1.4 개구 수) 100X 계획 아포 오일 침지 목표를 사용합니다.
   1. 디지털 이미징 할 수있는 카메라에 부착 된 현미경 (장비 참조)에 슬라이드를 넣습니다. 각각의 형광의 경우, 수동으로 실험의 모든 샘플을 검사하여 (일반적으로 300 - 1,000 밀리 초 사이) 적절한 노출 시간을 결정합니다. 셀의 이미지를 획득하기 전에 수동으로 Z 축 (일반적으로 0.2 μm의 스텝 크기)에 따라 적절한 상단과 하단에 초점면을 결정합니다. 디지털 현미경 이미징 소프트웨어 패키지를 이용하여 Z 축을 따라 서로 다른 형광 물질에 대해 동일한 노출 시간을 사용하여 분리 된 커버에 서로 다른 샘플의 이미지를 수집.
2. Z 축을 따라 취득한 모든 화상 스택 (아니오 이웃 알고리즘을 사용하지 않고 이러한 경우) 디콘 볼 루션을 수행한다.
   1. 따라서 각 이미지 스택의 총 강도 투영을 구하는Z 축.
3. 중심체가 (두 중심체 사이의 거리가 2㎛ 미만이다) 가까이있는 세포에서 두 중심체 주위에 작은 사각형 (측면 당 일반적으로 20 ~ 30 픽셀)를 그리는 선택 영역을 표시합니다.
   1. 첫 번째 광장을 둘러싼 더 큰 정사각형 (측면 당 일반적으로 24 ~ 35 픽셀)를 그려 큰 사각형의 선택 영역을 표시합니다.
   2. 면적 (A)과, 각 박스의 각 형광 물질의 총 형광 강도 (F)을 얻었다 (S 작은 박스를 나타내고, L은 큰 상자를 나타낸다).
   3. . 하웰 등 ^(29)에 의해 설명 된 공식을 사용하여 각 형광의 배경 보정 형광 강도를 분석 : F = F _S - [(F의 _L - F _{S)는 S} / (A _L를 - _S) ×].
   4. 그 FL의 배경 보정 형광 강도의 비를 계산함으로써 관심 (여기 VDAC3 또는 Sas6)의 단백질의 정규화 형광 강도를 구하는(여기에 γ-tubulin에, Sas6 또는 Cep135) 선택 내부 표준에 사용되는 형광의 그것과 uorophore.
4. 중심체가 잘 분리되는 경우 세포 분석의 경우, 두 개의 분리 된 박스의 도면 세트를 각각 별도로 분석 중심체 (두 중심체 사이의 거리가 큰, 2㎛ 이상이다). 각 중심체 주위에 작은 사각형 (측면 당 일반적으로 15 ~ 25 픽셀)를 그려 선택 영역을 표시합니다. 첫 번째 광장을 둘러싼 더 큰 정사각형 (측면 당 20 ~ 30 픽셀)를 그려 선택 영역을 표시합니다.
   1. 면적 (A)과, 각 박스의 각 형광 물질의 총 형광 강도 (F)를 얻어, 단계 5.3.3에서 설명 된 바와 같이, 각각의 중심체 별도로, 각 형광 물질의 배경 형광 농도 보정을 계산한다.
   2. 그 셀에서 해당 단백질의 총 centrosomal 레벨을 얻기 위해 두 중심체에서 각 단백질의 배경 형광 농도 보정 수확기.
   3. 취득내부 표준 물질의 총 centrosomal 강도 총 centrosomal 강도의 비율을 계산하여 관심 단백질 정규화 강도.
5. 각 실험 조건에 대해 적어도 15-25 세포를 분석하여 스프레드 시트의 그래프를 플롯.

6. 웨스턴 블로 팅을 사용하여 총 단백질 분석

1. 50mM 트리스 - 염산 pH를 8, 150 mM의 염화나트륨, 1 % Nonidet P-40, 1 % 나트륨 데 옥시 콜레이트, 0.1 % 나트륨 도데 실 설페이트 (SDS)를 포함하는 (RIPA) 버퍼 radioimmunoprecipitation 분석에서 세포를 재현 탁하고 얼음 위에서 10 분 동안 인큐베이션 용균.
   1. 10 분 동안 10,000 XG에서 혼합물을 원심 분리하여 펠릿 분획으로부터 해물을 분리 bicinchoninic 산 (BCA) 분석 키트를 사용하여 각 분해물의 총 단백질 농도를 측정한다.
2. 4X SDS-PAGE 로딩 완충액 (50 mM Tris-CL, pH가 6.8, 2 % SDS, 10 % 글리세롤, 100 mM의 디티 오 트레이 톨, 0.1 % 브롬으로 40 μg의 해물 믹스) 블루 ophenol.
   1. 10 분 동안 샘플을 비등 200 V.의 정전압으로 SDS-PAGE 변성 12.5 %의 샘플을 실행할
3. (냉간에서 1 시간 90 V의 정전압) 웨스턴 블로 팅 기법을 사용하여 니트로 셀룰로오스 막 상으로 SDS-PAGE상에서 분리 된 단백질을 전송.
   1. 1X PBS에서 3 % 무 지방 우유 멤브레인을 차단 한 다음 1 (이 경우 토끼 방지 VDAC3, 토끼 반 γ-tubulin에와 마우스 항-α-tubulin의)에 희석 차 항체의 솔루션을 막을 배양 실온에서 시간.
   2. 멤브레인을 PBS-T 완충액 3 회 (진탕 각 5 분 인큐베이션) 세척 한 후 (1X PBS 및 0.2 %의 트윈 -20), 근적외선 (IR​​) 형광 염료 공액 항 - 토끼의 혼합물에 막을 부화 1 시간 동안 (PBS-T에 희석) IR 형광 염료 공액 항 - 마우스 이차 항체.
   3. 막 세 번 세척 한 후 적외선 F를 사용하여 대역을 분석 막을 검색면역 검출에 적합한 luorescence 촬상 시스템.

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결과

우리의 최근의 연구 VDAC3, 미토콘드리아 porins ^{16, 28} 중 하나의 새로운 centrosomal 현지화 및 기능을 확인했다. VDAC3 특이 항체를 이용한 RPE1 세포를 포함한 여러 포유 동물 세포의 면역 염색 띄는 centrosomal 염색 비교적 약한 미토콘드리아 염색을 보여 주었다. 우리는 또한 centrosomal VDAC3이 우선적으로 어머니 중심 소체 및 내인성 모두의 centrosomal 풀과 연관된 및 ectopically VDAC3이 저하 ^(16)에

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토론

세포 생물학의 양적 현미경은 일반적으로 고정 된 다른 양적 현미경 분석을 개발하고 세포 생물학의 성장 사례가있다, 그러나 등 (FRAP) 광표백 후 같은 형광 공명 에너지 전달 (FRET), 형광 복구와 같은 라이브 세포 이미징 분석과 연관된 최근 몇 년 동안 ^27,34-36 세포. 중요한 것은, 중심체 생물학을 이해 진행은 종종 centrosomal 풀을 다른 풀과 다르게 조절 될 수있다 단백질의 중심체 특?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fibronectin	Sigma	F8141	Stock of 1 mg/ml in water
DMSO	Sigma	D2650
MG115	Sigma	SCP0005	Stock of 10 mM in DMSO
BrdU	Sigma	B5002	Stock of 10 mM in DMSO
Anti-γ-tubulin (mouse monoclonal, clone GTU 88)	Sigma	T 6557	1:200 in IIF blocking buffer
Anti-VDAC3 (rabbit polyclonal)	Aviva Systems Biology	ARP35180-P050	1:50 in IIF blocking buffer, 1:1,000 in WB blocking buffer
Anti-Sas6 (mouse monoclonal)	Santa cruz biotechnology	sc-81431	1:100 in IIF blocking buffer
Anti-Cep135 (rabbit polyclonal)	Abcam	ab-75005	1:500 in IIF blocking buffer
Anti-BrdU (rat monoclonal)	Abcam	ab6326	1:250 in IIF blocking buffer
Alexa Fluor 350 Goat Anti-Rat IgG (H+L)	Life technologies	A21093	1:200 in IIF blocking buffer
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody	Life technologies	A21202	1:1,000 in IIF blocking buffer
Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody	Life technologies	A21203	1:1,000 in IIF blocking buffer
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody	Life technologies	A21206	1:1,000 in IIF blocking buffer
Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody	Life technologies	A21207	1:1,000 in IIF blocking buffer
Anti-γ-tubulin (rabbit polyclonal)	Sigma	T5192	1:1,000 in WB blocking buffer
Anti-α-tubulin (mouse monoclonal, DM1A)	Sigma	T9026	1:20,000 in WB blocking buffer
Alexa Fluor 680 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Life technologies	A10043	1:10,000 in WB blocking buffer
Mouse IgG (H&L) Antibody IRDye800CW Conjugated	Rockland antibodies	610-731-002	1:10,000 in WB blocking buffer
SlowFade Gold Antifade Reagent	Life technologies	S36936	Mounting media
Round coverslips 12CIR.-1	Fisherbrand	12-545-80
Olympus IX-81 microscope	Olympus
Retiga ExiFAST 1394 IR camera	QImaging	32-0082B-238
100X Plan Apo oil immersion objective	Olympus		1.4 numerical aperture
Slidebook software package	Intelligent Imaging Innovations
Odyssey IR Imaging System	Li-cor Biosciences
Bicinchoninic acid (BCA) assay	Thermo Scientific	23227
U-MNU2 Narrow UV cube	Olympus	U-M622	Filter
U-MNU2 Narrow Blue cube	Olympus	U-M643	Filter
U-MNU2 Narrow Green cube	Olympus	U-M663	Filter