형광 기반 프라이머 확장 기술은 전사 시작 포인트 및 RNases의 쪼개짐 사이트를 확인하는<em&gt; 생체</em

요약

We here describe a fluorescence based primer extension method to determine transcriptional starting points from bacterial transcripts and RNA processing in vivo using an automated gel sequencer.

초록

형광 계 프라이머 신장 (FPE)는 전사 시작점 또는 RNA 분자의 프로세싱 사이트를 결정하기 위해 분자 방법이다. 이것은 특정 형광 표지 된 프라이머 및 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동을 변성하여 수득 된 cDNA 단편의 후속 분석을 이용하여 관심있는 RNA의 역전사에 의해 달성된다. 동시에, 전통적인 생거 시퀀싱 반응은 자신의 정확한 해당 기지의 cDNA 단편의 단부를 매핑 겔상에서 실행된다. 제품은 복제되어야 복수 후보 서열 5'-RACE (cDNA를 엔드 신속한 증폭), 대조적으로, 프라이머 신장에 의해 생성 된 cDNA 단편의 대부분은 동시에 하나 겔 실행에서 검출 할 수있다. 또한, (결과를 최종 분석에 역전사에서) 모든 절차는 하나의 작업 일에 완료 할 수 있습니다. 형광 표지 된 프라이머를 사용함으로써, 유해 방사성 동위 원소의 사용은 표지 된 시약을회피 할 수 있고, 제품은 전기 영동 과정에서 검출 될 수 있기 때문에 처리 시간이 감소된다.

다음의 프로토콜에서는 확실하고 신속 S.에서 (예를 들어, 독소 항독소 시스템 구성 요소) 시작점 및 RNA 프로세싱 사이트 전사을 추론의 RNA의 5 '말단을 검출하는 생체 내 형광 프라이머 신장 방법을 서술 구균, E. 대장균 및 기타 세균.

서문

프라이머 ^{신장도 1은} 하나의 기본 해상도까지 특정 RNA 분자의 5 '말단을 결정하기 위해 분자 방법이다. 이러한 5'-RACE (cDNA의 신속한 증폭이 종료 됨) 같은 다른 방법의 장점은 빠른 처리 시간을 용이 RNA 분자의 서로 다른 길이의 혼합물을 분석 할 수있는 능력이다.

이 방법은 RNA 분자가 특정 길이의 cDNA 단편을 생성하는 특정 형광 프라이머를 사용하여 전사 반응을 반대로 실시함으로써 작동한다. 이들의 cDNA 분자 변성 폴리 아크릴 아마이드 겔에 전통적인 생거 시퀀싱 ^반응이 함께 실행 의한 형광 표지 된 프라이머를 사용하여 그 형광을 검출 할 수있다. 된 cDNA 단편의 길이는 5 '말단 RNA의 맵핑을 허용 시퀀싱 사다리 비교에 의해 평가된다.

전통적으로, 프라이머 신장 반응을 함께 사용방사성 동위 원소와 X 선 필름에의 cDNA 분자들을 검출한다. 그들의 감도가 약간 낮다이라도 인해 건강 위험, 폐기물 처리 문제 및 취급의 용이성, 새로운 프로토콜은 자동화 된 시퀀서와 프라이머 신장의 검출을위한 형광을 이용한다. 형광 프라이머 (로모 손 년 이상) 장기간 안정적으로 형광 표지 된 프라이머를 사용하여 무선 표지 반복 절차가 생략 될 수있다.

우리는 여기에서 설명하는 방법은 자동화 겔 시퀀서를 이용하지만, 약간의 수정과, 모세관 시퀀서는 cDNA의 분리 및 검출 ^3에 사용될 수있다. 겔 분석 병렬 특성은 가능한 RNA 절단 또는 프로세싱 심지어 적은 양을 검출 할 수있다. 또 다른 이점은 검출 될 수 단말 절단 또는 심지어 하나의베이스 처리로서,이 방법의 고해상도이다.

RNA 절단 또는 가공, t의 검출에 관련하여프라이머 확장 ypically 두 가지 종류가 구별된다. 다른 경우에, 처리가 생체 내에서 수행하고, 생성 된 RNA 정제 반면 한 경우, 효소 처리, 정제 된 RNA 정제 효소를 사용하여 시험 관내에서 수행된다. 프라이머 신장 시험 관내에서 수행에 두 경우 RNA가 RNA의 소스에 따라, 그러나, 실시되고, 상기 방법은 시험 관내 또는 생체 내 프라이머 신장이라고 하나. 여기 제시 프로토콜에서는 때문에 사용 용이성 (정제없이 필요한 단백질)과 동시에 전사 시작점 및 처리를 결정하는 가능성 단독 생체 프라이머 신장에 초점. 그러나, 시험 관내 프라이머 확장은 동일한 방법으로 설정 원칙적으로,이 프로토콜은 시작점을 제공 할 수있다.

여기에 예시 된 방법은 그것들이 높은 의무만큼 많은 세균 종에 적용될 수있다핵산의 순도 높은 수율 준비.

우리 실험실 연구 독소 항독소 (맞대기) 시스템 ^4,5, 프라이머 신장 방법은 광범위하게 사용되는 필드의 규정 범위에 초점을 맞춘다. TA-시스템은 안정적이고 내생 활성 독성 단백질과 독성 ^6,7 중화 대부분 불안정한 단백질 또는 RNA 항독소로 구성 원핵 생물의 게놈에 존재하는 작은 유전 적 요소입니다. 독소 활성은 때때로하는 RNase 활성 ^8,9 의해 대부분 복제, 세포벽 합성 또는 다른 메커니즘의 억제에 의해 발휘되지만. 일반적으로, RNA 분해 효소 특이성 프라이머 신장 방법 중 하나는 다른 테스트를 수행하여 결정된다. 벽개 및 전체 길이 단편의 혼합물을 동시에 그들의 5 '끝나는 결정하기 위해 분석 될 수있는 프라이머 신장 반응,이 애플리케이션에 매우 적합하다. 시험 관내 및 생체 프라이머 확장에 믹스를 사용하여,특정 독소의 RNase 절단은, 예를 들어, 서열 특이성 ^{10-13 결정될} 수있다.

. 프라이머 확장 절차 1. 개요 그림 세균 배양 실험의 필요에 따라 배양 및 처리됩니다. 총 RNA는 세포의 cDNA를 수득 대상 특정 형광 DNA 프라이머를 사용하여 역전사 반응에 DNA의 흔적을 제거하기의 DNase I로 처리하고 실시로부터 추출된다. 게놈 DNA 또는 플라스미드를 추출하여 이후의 cDNA 조각과 크기 비교를 위해 형광 생거 시퀀싱 반응에 사용된다. 프라이머 신장 산물은 변성 우레아 폴리 아크릴 아미드 겔상에서 생거 시퀀싱 제품을 함께 실행하고 자동화 레이저 현미경으로 분석한다. 라 cDNA를 밴드와 함께 선까지입니다 시퀀싱베이스세인트 5 '의 cDNA 끝 (파란색 화살표)의 기본. Fekete 추가 정보, 등. ⁽³⁾ 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

전체 프라이머 신장 절차의 개요는도 1에서 발견 될 수있다. 요약하면, 박테리아 세포 수확, 배양, 세포 펠렛을 용해 및 RNA 추출. 정제 된 RNA이어서 역전사 템플릿으로 동작 할 수있다 DNA 분자의 흔적을 제거하기의 DNase I로 처리된다. 특정 형광 프라이머는 관심 영역에 교배와 이후 단일 가닥 보완 DNA (cDNA를) 결과, 전사 역, RNA에 추가됩니다. 시퀀싱 사다리 형광 프라이머를 이용하는 전통적인 생거 시퀀싱에 의해 생성 및 프라이머 신장 된 cDNA 단편의 나란히 변성 폴리 아크릴 아미드 겔상에서 분리된다. 결과겔은 관심의 5 '말단의 식별을 허용 형광 밴드를 비교하여 분석된다. 전사 시작 지점 및 처리 사이트는 다음 서열 비교​​에 의해 개별적으로 평가된다.

프로토콜

1. 고수익 RNA 준비

1. RNA 분리
   참고 : 총 RNA의 높은 농도는 프라이머 확장 반응에 필요하다. 스핀 컬럼 키트는 대개 필요한 RNA의 양을 생성하지 않는 (~ 5-16 μg의 5 ㎕의 부피). 따라서 산 구 아니 디늄 티오 시아 네이트 - 페놀 - 클로로포름 추출 방법을 사용하여 정제는 아래에 설명, 권장합니다.
   참고 : 페놀, 발암 독성 및 부식성. 물질 안전 보건 자료를 읽고 적절한 보호 흄 후드를 이용하세요!
   1. 원하는 수확 4,600 × g에서 10 분 원심 분리 및 4 ℃로 같은 박테리아 세포 (이 예에서는 황색 포도상 구균이나 대장균)을 성장 또는 치료. 참고 : 일반적으로 우리는 20의 ₆₀₀ 총 OD 수확 - 70 세포 펠렛은 -20 ° C에서 몇 주 동안 저장 될 수 있습니다.
   2. 산 구 아니 디늄 티오 시아 네이트 - 페놀 - 클로로포름 용액을 1 ml의 세포 펠렛을 재현 탁하고 편입2 ml의 0.1 mm 유리 지르코늄 / 실리카 비드 0.5 ㎖의 컵을 포함하는 스크류.
   3. 를 Lyse 세포 각 실행 한 후 5 분 동안 얼음에 샘플을 냉각 3 라운드 30 초 동안 6.5 m / 초에서 빠른 준비 / 비드 비터에 세 번. 주의 : 샘플을 균질화 몇 주 동안 -80 ° C에서 저장 될 수있다.
   4. RT에서 5 분 동안 해물을 품어 다음 클로로포름 200 μL를 추가합니다.
   5. 흔들어 또는 RNA를 추출하기 위해 30 초 동안 샘플을 소용돌이.
   6. 15,000 × g에서 4 ° C - 후 13,000에서 15 분 동안 원심 분리하여 3 분 동안 실온에서 품어. 참고 : 용제 (흰색 DNA를 포함), (핑크, 단백질을 포함) 낮은 유기 상에 계면 분리 및 상부 수상 (클리어, RNA를 포함)입니다.
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   7. 적절하게 신선한의 RNase가없는 1.5 ml의 반응 튜브, 라벨을 준비하고 거의 같은 VO를 사용 (100 %의 RNase 무료 이소프로판올 각의 약 500 μl를 추가LUME) 이전에 튜브 성상 등.
   8. 각도로 튜브를 잡고의 RNase에게 무료 정보를 사용하여 제조 한 튜브 수성 상 (약 500 μL)을 전송. 간기를 방해하지 마십시오.
   9. 수회 반전하고 RT에서 10 분 동안 인큐베이션하여 RNA를 침전.
   10. 15,000 × g에서 4 ℃, 피펫 또는 흡인 (워터 제트 펌프와 먹이 병)에 의해 뜨는을 제거 - 13,000에서 15 분 동안 원심 분리. 맨 아래에있는 흰색 투명 RNA 펠렛을 방해하지 마십시오.
   11. 씻어 70-80%의 RNase 무료 에탄올 (하지 소용돌이)의 1 ML을 추가합니다. 주 : 에탄올 RNA는 -20 ° C에서 몇 주 동안 저장 될 수있다.
   12. 7,500 × g에서 5 분, 4 ° C 원심 분리 피펫 또는 바람직하게 흡인하여 상층 액을 제거한다.
   13. 흄 후드에서 30 분 - 15 공기 건조 RNA 펠렛. overdry하지 마십시오, 그렇지 않으면 펠렛 재용하기 어려울 수 있습니다.
   14. (5)의 펠렛을 재현 탁된 RNase 자유 DDH ₂ O 또는 RNA 저장 버퍼 0 μL.
   15. microvolume 자외선 - 마주 분광 광도계 또는 석영 큐벳 (기존 광도계)와 RNA 농도를 측정하고 DNase의 I 소화를 진행합니다.
2. RNA의 DNase의 I 소화 DNA의 흔적을 제거합니다
   NOTE : DNA는 역전사 (프라이머 신장) 반응에서 스퓨리어스 주형으로서 작용할 수 있기 때문에,이 샘플로부터 제거되어야한다. RNA 솔루션에서 DNA를 제거하기위한 다양한 방법은 일반적으로 DNase의 소화에 의존하는 수 있습니다. DNA 제거를위한 간단하지만 효과적이고 비용 효율적인 방법은 아래에 설명되어 있습니다.
   1. 37 ℃로 예열 물 목욕.
   2. 1.5 ml의 반응 관에, 표 1에 나열된 화합물을 섞는다.
   3. 수욕에서 37 ° C에서 1 시간 동안 혼합물을 인큐베이션하고, 페놀 / 클로로포름 추출로 직접 진행. 참고 :의 DNase I의 열 불 활성화하지 않는 것이 좋습니다,이 RNA를 저하 될 수있다.
3. DNase의 I 소화 후 RNA의 페놀 / 클로로포름 추출
   참고 : RNA를 DNase의 I 소화에서 무료로 뉴클레오티드, DNA 조각과 버퍼 구성 요소를 제거하기 위해 정제해야합니다. 페놀 / 클로로포름 추출 RNA 샘플의 높은 회복과 집중이 가능하기 때문에 아래에 설명되어 있습니다. 그들은 이러한 요건을 만족하는 경우 RNA 정제하는 다른 방법도 사용될 수있다.
   1. 내가 소화 500 μL의 DNase를 2 ml의 반응 튜브에서 두 250 μL 샘플로 혼합 분할합니다.
   2. 산성 P / C가 / I 솔루션의 1 볼륨 (250 μL) (: 24 : - 5 (1), pH를 4.5 물 포화 페놀, 클로로포름, 펜탄에, 25의 비율)를 추가합니다.
      참고 : P / C / I 솔루션, 발암 독성과 부식성. 물질 안전 보건 자료를 읽고 적절한 보호 흄 후드를 이용하세요!
   3. 3 분 - 1 소용돌이로 교반 플랫폼에 적극적으로 소용돌이 또는 장소.
   4. 15,000 ×의 g 및 4 ℃ - 13,000에서 30 분 동안 원심 분리기.
   5. 상단 (수성) 단계를 수집하고 신선한 튜브 (250 μL)에 전송합니다.
   6. 3 M 아세트산 나트륨의 pH 5.2의 1/9 용량 (28 μL)를 추가합니다.
   7. 순수 에탄올 (700 μL)의 2.5-3 볼륨을 추가합니다.
   8. 3 시간 - 30 분 동안 또는 2 -20 ° C에서 -80 ° C에서 곧 제자리로 소용돌이로 섞는다. 필요한 경우, -20 ° C에서 RNA O / N를 저장합니다.
   9. 15,000 ×의 g 및 4 ℃ - 13,000에서 60 분 - 30 원심 분리기.
   10. 피펫 또는 흡인에 의해 뜨는을 제거합니다.
   11. 펠렛에 70 % 에탄올 1 ㎖를 첨가하여 워시 펠릿. 소용돌이 샘플하지 마십시오.
   12. 15,000 × g에서 4 ° C - 13,000에서 5 분 동안 원심 분리기 샘플.
   13. 피펫 또는 흡인에 의해 뜨는을 제거합니다.
   14. 흄 후드 아래 공기 건조 펠렛. 필요 -20 ° CO에서 / N 경우 펠렛을 저장합니다.
   15. 2 분 동안 볼 텍싱에 의해 H ₂ O 처리 30 μL의 DEPC에서 펠렛을 용해하고, 체육을 용해하기 위해이 솔루션을 사용샘플 당 대응하는 제 2 튜브의 llet (하나 추출 쌍 당 30 μL 용액).
   16. RNA 농도를 측정하고,이 평균적으로 표현의 mRNA의 프라이머 확장에 사용되는 1 ㎍ / μL를 초과 달성 할 수 있도록 지원합니다.
   17. 필요한 경우, 몇 달까지 몇 주 동안 -20 ° C에서 RNA를 저장합니다.

2. 뇌관 확장 반응

1. 프라이머 디자인
   참고 : 프라이머 확장 실험을 위해 프라이머를 설계 할 때, (수동은이 문서에서 더 많은 정보와 토론 섹션에 대한 자동화 된 젤 시퀀서를 동반 참조) PCR 프라이머 디자인의 일반 지침을 준수하십시오.
   1. 즉, 프라이머는 (i) 염기의 런을 포함하지 않도록, (ii) 상기 3 '말단에 G 또는 C, 소지 (ⅲ) 균형 GC있다 : 비로, (ⅳ) 약의 어닐링 온도를 가지고 55 - 관심 영역의 하류 60 ° C 및 (V) 바인드 적어도 50 BP, 더 나은 100 BP는 선명한 이미지를받을 수 있습니다.
2. 프라이머 확장 반응
   참고 : 프라이머 확장 반응 (cDNA 합성은) 템플릿 RNA의 높은 금액을 필요로한다. 사용 된 RNA의 양은 로우로 선택되는 경우, 신호를 감지하기에 너무 낮을 수있다! 상기 한 바와 같이 따라서 우리는 RNA의 정화를 추천합니다.
   참고 :주의 : 사용 된 RNase 무료 시약 및 플라스틱 제품을!
   1. 95 ° C의 온도로 열 사이 클러를 데우고 사용 및 재현성 쉽게 열 사이 클러 모든 상기 배양 단계를 수행한다.
   2. 각각의 RNA 시료에 대한 PCR 튜브에 표 2에서 화합물을 혼합.
   3. 95 ° C에서 1 분 동안 샘플을 변성.
   4. RNA는 프라이머를 교배 5 분 동안 얼음과 진정에 튜브를 놓습니다.
   5. 47 ° C에 PCR 기계를 설정합니다.
   6. 표 3에 기재된 바와 같이 한편 역전사 마스터 믹스를 제조.
   7. 각각의 혼성 RNA에 역전사 마스터 믹스 4 μl를 추가샘플.
   8. 47 ° C에서 1 시간 동안 튜브를 품어. 주 : AMV RT위한 최적 온도는 42 ° C이며, 그러나보다 높은 온도는 RNA 분자의 이차 구조를 극복하는 데 도움.
   9. 2 분 동안 95 ° C로 샘플을 가열하여 반응을 정지.
      참고 : 포름 아미드, 부식성 독성 및 태아에 유해 할 수 있습니다. 재료 안전 데이터 시트를 읽을 취급에주의하고 적절한 보호구를 착용하십시오!
   10. 어둠 속에서 -20 ° C에서 O / N 및 저장 2 주 (/ V) 브로 모 페놀 블루 W 0.05 % (95 % (V / V) 탈 포름 아미드, 10 mM의 EDTA) 포름 아미드 로딩 염료의 6 μl를 추가합니다.

연속 사다리 3. 준비

참고 : 순서 사다리 반응은 플라스미드 또는 게놈 DNA의 많은 양의 적당한 양의를 필요로한다. 가능하다면, 시퀀스 반응에서 플라스미드의 사용으로 인해 단리 및 높은 SIG의 용이성 권장최종 강도. 다른 경우에, 우리는 일상적 E.로부터 게놈 DNA를 제조 Marmur ^5,14에서 채택한 방법을 사용 대장균과 S. 필요없이 구균 세포는 페놀을 사용한다. 원칙적으로 높은 양의 게놈 DNA의 순도를 얻을 수있는 방법이 사용될 수있다.

1. 게놈 DNA 분리
   1. E. 10 ml의 성장 대장균 또는 S. 구균 세포 O / LB, BM ⁵ 또는 TSB 배지에서 N.
   2. 15 ㎖의 팔콘 튜브에 4,600 × g에서 10 분 동안 원심 분리하여 수확 세포.
   3. 일부 미니 준비 키트에 발견 2 ml의 버퍼 (P1)에 재현 탁 펠렛 (50 mM 트리스 - 염산의 pH 8.0, 10 mM의 EDTA, 100 ㎍ / ㎖의의 RNase A).
   4. 40 μL의 lysostaphin (-20 ° C에서 0.5 ㎎ / ㎖, 저장) - (20) 60 분 - 45를 Lyse 세포. 참고 : E. 들어 콜라이 세포 효소 전처리를 생략 할 수 있거나, 라이소자임 사용.
   5. 서스펜션과 incubat에 (45 % 에탄올) 포화 SDS-용액 100 μl를 추가37 ℃에서 5 분 동안 전자.
   6. 650 ㎕의 5 M 차아 염소산 나트륨 ₄ 간략 소용돌이 세포를 추가합니다.
      NOTE : 클로로포름 발암 잠재력이다. 물질 안전 보건 자료를 읽고 적절한 보호 흄 후드를 사용하십시오!
   7. 혼합물에 (1 비율 24)과 적어도 60 초 동안 흔들어 클로로포름 / 펜탄의 3 ML을 추가합니다. 참고 : 액체가 균일 한 화이트 에멀젼으로 설정해야합니다.
   8. 상을 분리하기 위해 10 분에서 4,600 ×의 g 및 RT에 대한 샘플을 원심 분리기.
   9. 조심스럽게 새로운 튜브에 명확한 상단 (수성) 단계를 전송할 수 있습니다. 용액이 혼탁이면, 클로로포름 / 펜탄 추출을 반복한다. DNA 용액의 부피를 측정하고 에탄올 (100 %)의 2 볼륨으로 신선한 튜브를 준비한다.
   10. 천천히 캔트 또는 튜브를 함유하는 에탄올로 DNA 용액을 피펫. 참고 : DNA가 바닥하거나 완전히 탈수 떠있는 하얀 클러스터와에 투명, 조밀 한 코일을 침전한다.
   11. D 검색NA 유리 파스퇴르 피펫 (그림 2)에서 만든 후크를 사용하여 1 ml의 70 % 에탄올의 개별 튜브에 담가 두 번 각각의 샘플을 씻는다.
   12. 랙에 똑바로 후크를 놓고 공기를 60 분 동안 펠렛을 건조. 필요한 경우, 실온에서 며칠 동안 건조 된 DNA를 저장합니다.
   13. 500 μL의 DDH ₂ O - DNA 커버 유리 고리를 끊고 (100)를 포함하는 2.0 ml의 반응 관에 배치하여 DNA를 용해 1500 NG / μL - 1000의 최종 DNA 농도에 볼륨을 조정합니다. 게놈 DNA의 18 μg의 - 하나의 염기 서열 반응의 경우, 10을 사용합니다.

그림 DNA 낚싯대를 만드는 방법 2. 명령어. 분젠 버너의 불꽃에 유리 파스퇴르 피펫의 끝을 잡고. 이 t에 작은 고리를 만들어, 몇 초 후에 녹는 시작하는 유리의 원인그는 끝. 신속하게 불꽃에서 제거하고 1 분 동안 식힌다.

2. 플라스미드 분리
   1. 표준 미니 준비 키트를 사용하여 플라스미드를 준비하고 용출 버퍼 (10 mM 트리스 - CL, 산도 8.5)에 용해. 하나 시퀀싱 사다리 대해 500 ng의 플라스미드 - 플라스미드 크기에 따라, 100을 사용.
3. 생거 시퀀싱 반응
   참고 : 프라이머 확장의 목적을 위해 잘 작동 7 아자 dGTP를 가진 형광 표지 된 프라이머 시퀀싱 키트를 사용하는 간단한 프로토콜 아래에서 보라. 자세한 내용은 시퀀싱 키트 설명서를 참조하십시오. 시퀀싱 반응이 동일한 길이의 제품을 만들기위한 프라이머 확장 반응과 동일한 프라이머를 사용하셔야합니다.
   1. 1 μL DMSO 1 μL 형광 표지 된 프라이머 (/ μL 2 pmol의)와 - (15 μg의 ~ 10) 게놈 DNA의 12 μl를 섞는다.
   2. 네 개의 염기 서열 반응 혼합물 (A, C, G 또는 T)의 각 1 μL로, DNA / DMSO / 프라이머 믹스의 3 μl를 추가합니다.
   3. PCR 기계로 샘플을 놓고, 다음과 같은 PCR 프로그램을 실행시킵니다 2 분 동안 95 ° C를; 20 초, 20 초 동안 54 ° C, 30 초 동안 70 ° C, 95 ° C의 35주기; 4 ° C에서 영원히 유지.
   4. 실행 후, 컴퓨터에서 샘플을 제거 주에 몇 일 동안 얼음 (단기) 또는 -20 ° C에서에 로딩 염료 및 저장의 6 μl를 추가합니다.

4. 젤 설정 및 장치 실행

NOTE : 시퀀싱 겔 장치의 조립 방법에 관한 상세 정보는, 겔을 제조하는 방법과 겔이 실행은 제조사 프로토콜에서 찾을 수있다.

1. 준비
   1. 표 4에 표시된대로 10 배 TBE를 준비합니다.
   2. 겔 런의 날 초순수 DDH ₂ O.와 1X TBE 완충액 1 L를 조제
   3. 10 % (W / V) APS를 준비합니다. 주 : 몇 달 동안 -20 ° C에서 200 ㎕의 분취 액에 저장 될 수 있지만, 시간이 지남에 따라 활성이 저하 될 <./ 리>
2. 겔 주조 챔버 어셈블리
   1. 유리판 사이에 먼지와 보풀을 피하십시오. 물티슈를 사용 따라서 철저하게 청소 작업 표면.
   2. 유리판의 내측에 대해 이소프로판올 후 양측에 일회용 종이 타월과 증류수를 사용하여 25cm의 유리판 쌍을 청소하고.
   3. (그림 3) 후면 유리 접시에 0.25 mm 스페이서를 배치하고 상단에있는 노치 유리판을 낮 춥니 다.
   4. 홈 부분을 유리판 위를 향 레일 항목 조종사의 양쪽에 젤 레일을 부착하고 가볍게 손잡이를 조입니다.

도 3은 겔 전기 영동 유리판 분해도. 유리 플레이트 방향성으로 사용되어야한다. 내측 유리판의 내측과 외측을 향하도록 조심바깥쪽으로.

도 4 겔 조립 장치의보기. 겔 용액을 주입 한 후, 포켓 스페이서 유리판 사이의 용액에 배치된다. 주조 플레이트는 전면 유리판과 겔 사이에서 슬라이드 레일과 레일 손잡이를 조임으로써 고정된다.

3. 젤을 캐스팅
   주 : 비 중합 된 아크릴 아마이드는 신경 독성입니다! 물질 안전 보건 자료를 읽고 적절한 보호하고 사용하십시오!
   1. 비커에 표 5에 열거 된 화합물을 추가하고 교반 막대와 자석 교반기를 이용하여 혼합한다.
   2. 즉시 APS와 TEMED를 추가 한 후, 50 ML의 주사기에서 겔 용액을 차지 끝에 0.45 nm의 필터를 배치합니다.
   3. 어느 한 손으로 유리 기판의 위쪽 가장자리를 잡거나 sandwic를 배치20 ° - 젤 캐스팅 시간 10 기울어 진 경사를 만들 서있다.
   4. 천천히 연속적으로 다른 한쪽에서 주사기 팁을 이동시키면서 유리 플레이트 사이 겔 용액을 조제하고, 겔 용액 하단부를 만족하면 정지.
   5. 측면으로 이동하거나 완전히 거품 후크를 사용하여 형성된 거품을 제거합니다.
   6. 홈 부분에서 유리판 사이 겔 포켓 스페이서 (0.25 mm)를 밀어, 겔 용액에 담그고 주조 플레이트를 장착하여 고정한다.
   7. 고정시킵니다 상부 레일 나사를 가볍게 (완전 조립 장치에 대한 그림 4 참조).
   8. 2 시간 - 1 젤 세트를 보자.
   9. 캐스팅 판과 주머니 스페이서를 제거하고 소금과 젤 잔류 물에서 주머니를 청소합니다.
   10. DDH ₂ O 헹군 후 조직의 논문 과잉 솔루션을 닦아주십시오.
4. 실행과 젤을 시각화
   NOTE : 시퀀싱 겔 직접하면서 이미 저 겔에서 전기 영동을 실시형광 동시에 레이저 현미경에 의해 검출된다. 겔을 먼저 실행 한 후 염색 가시화 종래의 겔 전기 영동, 대조적으로, 상기 검출 유닛은 고정되고들이 레이저 통과 실시간 대역을 스캔한다. 최신 버전으로 채택 될 수 개략되어 OS / 2 ImagIR 데이터 수집 소프트웨어에 대한 절차 이하. 자세한 내용은 사용자 설명서를 참조하십시오.
   1. 전면 유리 접시에 젤 레일에 버퍼 탱크 홀더를 밀어 넣고 손잡이를 조입니다.
   2. 가열 플레이트에 대한 자동화 된 젤 화상 카메라의 하단 젤 탱크에 젤을 놓고 장치 브래킷에 레일 항목 파일럿을 밀어 고정합니다.
   3. 전원 코드를 사용하여 전력 상부 버퍼 챔버 하부 버퍼 챔버를 닫고 연결 하부 및 상부 겔 버퍼 챔버로 1X TBE 버퍼를 채운다.
   4. 존재하는 경우, 반복적으로 주머니에 버퍼를 피펫 팅에 의해 소금 잔류 물에서 젤 주머니를 청소합니다.
   5. 상부 버퍼를 사용하여 뚜껑 상부 버퍼 탱크 챔버를 닫고.
   6. 기계의 문을 닫고 열 화상 카메라와 컴퓨터를 켜고 자료 ImagIR 데이터 수집 소프트웨어를 시작합니다.
   7. 새 프로젝트 파일 (파일 -> 새로 만들기 ...)을 작성, 프로젝트 파일 이름을 입력 적절한 레이저 범위 (700 또는 800 nm의)를 선택하고 OK 버튼을 눌러 확인합니다.
   8. 옵션 -> 자동 이득 ... 상단 이미지 메뉴에서를 선택, 자동 이득 측정을 시작하고 확인을 클릭하여 설정을 적용하려면 자동을 클릭합니다.
   9. 초점 ... 스캐너 제어 메뉴에서 자동 버튼을 클릭하고 확인을 클릭하여 설정을 승인 -> 옵션을 선택하여 레이저 초점을 맞 춥니 다.
   10. 새로 초점 영역으로 조정하는 자동 이득의 절차를 반복합니다.
   11. 설정이 설정에 따라 스캐너 제어 : 2,000 V, 35mA, 45 W, 45 ° C, 검색 필터 : 3, 스캔 속도 : 3.
   12. 20 분 동안 빈 젤 (선택 전압 ON하고 Enter 키를 누릅니다 Prerun ).
   13. 한편, 후, 90 ° C로 2 분 동안 PCR 기계에서 시퀀싱 사다리와 프라이머 신장 산물을 가열 얼음 냉각.
   14. , 전기 영동을 중지 자동화 젤 시퀀서를 열고 상단 버퍼 탱크 덮개를 제거합니다.
   15. 유리판 사이에 상어 치아 빗를 삽입하고 약간 상어 이빨을 가진 젤을 관통 (그림 5 참조).

그림 5. 확대 상어 치아 빗과 젤의보기. 샘플 (보라색)는 상어 이빨 사이에 적용된다.

16. 피펫 중 1 - (상어 이빨에 의해 형성) 각 젤 주머니에 확장 제품 또는 순서 사다리 반응 프라이머의 2 μL.
17. 모든 포켓이 필요한 경우에 방지하기 위해 로딩 염료 빈 주머니를 채우기일관된 실행 동작.
18. 겔 시퀀서의 버퍼 탱크와 문을 닫습니다.
19. 전기 영동을 시작하고 레이저 (선택 전압 및 레이저 ON를 눌러 켭니다 ) 키를 누르십시오.
20. 관심의 영역은 레이저를 통과하면 전기를 중지합니다.

결과

도 6에 도시 된 바와 같이, 프라이머 신장 반응 관심 사체의 전사 시작 포인트를 결정하는데 사용될 수 있고 (통상적으로 -10 -35 원소로 식별 됨) 프로모터 영역을 추론 할 수 있습니다. 최상위 (가장 긴)의 cDNA 단편의 mRNA의 5 '말단을 나타내며, 따라서 시퀀싱 사다리에 비해 용이하게 매핑 될 수있다.

토론

형광 프라이머 신장은 TSP- 또는 RNA 이차 가공 식별 어느 쪽의 RNA의 5 '말단을 결정하기위한 간단하고 신속한 방법이다. 때문에 형광 프라이머의 사용, 반응이 설정 될 수 있으며, (방사성 표지 된 프라이머 경우와 달리) 추가 보안 조치없이 실행합니다. 샘플은 형광으로 검출되는 바와 같이 전기 영동 X 선 필름은 일반적으로 사용되는 방사성 방법에 비해 신속한 분석을 허용 진행되는 동안, 이들...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
AMV Reverse Transcriptase (20-25 U/µl)	NEB / Roche	NEB: M0277-T / Roche: 10109118001
DNase I (RNase free)	Ambion (life technologies)	AM2222
FastPrep-24 Instrument	MPBio	116004500
Fluorescently labeled primers	Biomers	n/a	5’ DY-681 modification of “ordinary” DNA oligonucleotides. Compatible dyes such as the LICOR IRDye 700/800 are also available from other suppliers such as IDTdna.
Li-Cor 4200 Sequencer incl. ImagIR Data collection software	Li-Cor		Product discontinued
NanoDrop 2000	Thermo Scientific
Nuclease free water	Ambion (life technologies)	AM9915G
Plasmid mini preparation kit	QIAGEN	12125
RapidGel-XL-40% Concentrate	USB	US75863
RNA STORAGE BUFFER	Ambion (life technologies)	AM7000
Roti-Aqua-P/C/I	Carl Roth	X985.3	Alternative: “Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)” from Ambion (AM9720)
SUPERase•In RNase Inhibitor	Ambion (life technologies)	AM2696
Thermo Sequenase fluorescently labelled primer cycle sequencing kit with 7-deaza-dGTP	GE Healthcare	RPN2538
TRIzol reagent	life technologies	15596-026
Zirconia/Silica Beads 0.1 mm	BioSpec	11079101z