위한 도구로 리포좀 캡슐화 된 근적외선 형광의 형광 담금질<em&gt; 생체</em&gt; 광학 이미징

요약

The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity.

초록

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous number of imaging techniques currently available and the progress in instrumentation, there is still a need for highly sensitive probes that are suitable for in vivo imaging. One typical problem of available preclinical fluorescent probes is their rapid clearance in vivo, which reduces their imaging sensitivity. To circumvent rapid clearance, increase number of dye molecules at the target site, and thereby reduce background autofluorescence, encapsulation of the near-infrared fluorescent dye, DY-676-COOH in liposomes and verification of its potential for in vivo imaging of inflammation was done. DY-676 is known for its ability to self-quench at high concentrations. We first determined the concentration suitable for self-quenching, and then encapsulated this quenching concentration into the aqueous interior of PEGylated liposomes. To substantiate the quenching and activation potential of the liposomes we use a harsh freezing method which leads to damage of liposomal membranes without affecting the encapsulated dye. The liposomes characterized by a high level of fluorescence quenching were termed Lip-Q. We show by experiments with different cell lines that uptake of Lip-Q is predominantly by phagocytosis which in turn enabled the characterization of its potential as a tool for in vivo imaging of inflammation in mice models. Furthermore, we use a zymosan-induced edema model in mice to substantiate the potential of Lip-Q in optical imaging of inflammation in vivo. Considering possible uptake due to inflammation-induced enhanced permeability and retention (EPR) effect, an always-on liposome formulation with low, non-quenched concentration of DY-676-COOH (termed Lip-dQ) and the free DY-676-COOH were compared with Lip-Q in animal trials.

서문

리포좀 집중적으로 연구 및 임상 응용에 가장 ^1,2- 생체 의용 약물 전달 시스템의 하나로서 역할을하고있다. 이들은 주로 천연 세포막의 일부를 모방하는 화합물이다 생체 둘 콜레스테롤 및 인지질로 구성된다. 친수성 물질은 수성 내부에 혼입 될 수있는 반면, 친 유성 제제는 리포좀 인지질 이중층 ³ 내에 내장 될 수있다. 리포좀의 수성 내부 내에 캡슐화 물질의 생체 내에서 분해에 대한 보호 기능을 부여하고 또한 종양 세포 파괴를 목표로 화학 요법 제를위한 예시적인 질병의 치료에 사용되는 세포 독성 약물의 독성 효과로부터 호스트 시스템을 방지한다. 폴리에틸렌 글리콜 중합체와 같은 리포솜 표면의 변형 (PEG 화)를 더 인해 sterical 안정화 ^(4)에 생체 내에서 리포솜 혈액 순환 시간을 연장한다. Moreov어, 리포좀 단백질 ^{5, 6,} 친수성 물질 ^7,8 효소 ⁽⁹⁾ 등 여러 가지 물질의 높은 농도를 격리한다 수 있습니다. 그러므로 그들은 암 치료 ⁴ 독소루비신으로 세포 독성 약물의 전달을 위해 자신의 승인을받을만한 신뢰할 임상 치료 및 진단 도구를 제공합니다. 유연성이 있기 때문에, 리포좀은 또한 진단 및 영상 유도 수술 목적의 형광체와 함께로드 될 수있다.

형광 이미징는 비용 효율적이며 그러나, 기본적인 요건을 요구 생체 진단 도구에 비 침습적. 이 생체 내 이미징을위한 가장 적합한 형광 색소가 빛을 분산 및 산란뿐만 아니라 물에서 발생하는 조직의자가 형광과 헤모글로빈이 낮은 범위의 특성 흡수 및 배출 최대 값이 있는지 입증 할 수있다. 따라서, 이러한 프로브는 650 nm의 ¹⁰ (900) 사이에서 자신의 복근 / EM 최대 값을 가지고있다. 옵 소닌과 신속한 간극이 크게 생체 내 이미징 ^{(11)을위한} 그들의 적용을 제한 할 수 있으므로,이 외에, 시험 관내 및 생체 내 형광 색소의 안정성이 매우 중요하다. 불량한 안정성과 낮은 감도 또는 인도 사이 아닌 그린 (ICG) ^12-16으로 볼 때 표적 장기에 세포 독성 효과와 같은 다른 효과는 원치 않는이며, 생체 내 이미징 프로브를 설계 할 때 고려되어야합니다. 이러한 관찰은 여러 임상 근적외선 형광 색소, 나노 입자뿐만 아니라 염증 반응, 암의 생체 내 이미징 및 영상 유도 수술 ^{17 ~ 20를위한} 새로운 기술의 적극적인 개발을 주도했다. 대부분의 전임상 NIRF (근 적외 형광)의 안정성에도 불구 염료 시험관, 간과 신장을 통해 빠르게 관류 및 클리어런스가 질환 및 염증 과정의 생체 내 이미징 광학의 사용을 방해.

ntent은 "> 따라서 우리는 다음과 같은 형광 색소의 캡슐화 프로토콜을 제시 잘 특징 근적외선 리포좀에 상대적으로 높은 농도 ^(21)에 자기 담금질에 그 경향이 알려져 형광 염료 DY-676-COOH. 높은 농도에서 H- 이량 체 형성 및 / 또는 파이 - 적층, 형광 분자 증가 사이 저농도. 스페이스를 형광 색소 분자 사이 포스터 공명 에너지 전이 (FRET)에 서로 포스터 반경 결과에 위치한 형광 분자 사이의 상호 작용을함으로써, 파이 - 스태킹 상호 작용을 방지하고 H-이량 체 형성 및 높은 형광 방출의 결과. 높고 낮은 농도 및 첨부 형광 소광 및 활성화 사이의 스위치는 광학 영상 ^(22)에 대해 이용 될 수 유망한 전략이다. NIRF 염료 고농도의 이러한 관점에서, 캡슐화 리포좀의 수성 내부에서 DY-676-COOH 더 파이다무료 염료에 비해 생체 내 이미징 vorable. 방법의 과제는 높은 농도의 염료를 캡슐화 인한 이득의 검증에서, 둘째 올바른 밀봉에 우선하고있다. 염료의 농도가 낮은 비 켄칭 리포솜 제형으로도 자유 염료의 켄칭 리포좀의 결상 특성을 비교하는 것은 필수적이다. 우리는 리포좀의 DY-676-COOH의 담금질 농도의 캡슐화가 가능하다 대체 동결 및 해동 사이클과 함께 간단하지만 매우 효과적인 필름 수화 및 압출 프로토콜을 보여줍니다. 이러한 역상 증발 법 ^(23)뿐만 아니라, 에탄올 주입법 ²⁴ 리포좀을 제조하는데 사용하는 다른 방법은 많은 친수성 물질에 대한 높은 캡슐화 효율이 리포좀 제제를 사용. 그러나, 물질의 성질은 포위 효율에 영향을 미칠 수있는 캡슐화. 사실상여기에 제시된 필름 수화 및 압출 프로토콜은 DY-676-COOH의 캡슐화 가장 높은 효율을 밝혔다. 몇 시간 내에 염증 과정의 연구를 허용 DY-676-COOH, 자이 모산 - 유도 부종 모델의 리포좀 캡슐화의 장점을 설명하기 위해 사용되었다. 여기서, 캡슐화 DY-676-COOH 고농도 리포좀은 자유 염료 또는 낮은 염료 농도 비 켄칭 리포좀 제형보다 염증 과정의 생체 내 광 이미징 전신에 더 적합하다는 것을 입증한다. 따라서 기본 프로토콜은 형광 켄칭 리포좀 시험 관내 및 생체 내 활성 및 그들의 촬상 전위의 유효성을 생성하는 간단하고 빠른 방법을 제공한다.

프로토콜

참고 : 모든 절차가 지역 동물위원회 및 동물의 윤리적 사용에 대한 국제 지침에 따라 승인됩니다.

용 재료 및기구 1. 준비

1. 자발적으로 형성된 소포 분산액의 제조 (SFV)
   1. 다음과 같은 인지질의 재고 솔루션을 녹여 준비 : 214 ㎎ / ㎖ 계란 포스파티딜콜린 (EPC), 134 ㎎ / ㎖ 콜레스테롤, 122 ㎎ / ㎖ 1,2- distearoyl- SN -glycero-3-phosphoethanolamine- N - [메 톡시을 (폴리에틸렌 글리콜) -2000 (암모늄 염) (MPEG -DSPE ₂₀₀₀₎ 및 2 ㎎ / ㎖의 1,2- dioleoyl- SN -glycero -3- phosphoethanolamine- N - (7- 니트로 2-1,3-benzoxadiazol -4- 유리 병에 클로로포름 및 저장소 일) (암모늄염) (NBD-DOP​​E).
   2. 둥근 바닥 플라스크에 대략 3 ㎖ 클로로포름 퍼니 및 EP 이루어진 리포좀을 제조하는 둥근 바닥 플라스크에 인지질 스톡 용액의 적절한 용적을 전송할C : 3 : Chol을 0.5 : 6.5의 몰비가 mPEG ₂₀₀₀ -DSPE. 리포좀의 이중 형광 라벨은 지질 용액에 0.3 몰 % NBD-DOP​​E를 추가합니다.
   3. 회전 증발기를 사용하여 55 ° C에서 감압 (300 밀리바) 하에서 유기 인지질 용액으로부터 클로로포름을 증발시켰다.
   4. 균질 인지질 막을 형성 한 후, 잔류 클로로포름 퇴적물을 제거하기 위해 1 ~ 2 시간 동안 10 mbar의 압력을 감소시킨다.
   5. 클로로포름이 증발되는 동안, 10 mM 트리스 버퍼 pH 7.4에서 DY-676-COOH (6.181 μM)을 녹여 액체 질소 듀어 용기를 입력합니다. 초음파 목욕에 전환하고 50 ° C로 설정.
   6. DY-676-COOH (6.181 μM) 자발적으로 형성 소포 (SFV) 분산이 형성 될 때까지 건조 인지질 막과 격렬하게 소용돌이를 수화하는 둥근 바닥 플라스크에 솔루션의 적절한 볼륨 (0.5 ml)에 전송합니다. 인지질의 모든 지질 손실을 방지하기 위해 분산되어 있는지 확인합니다.
   7. 조심스럽게 TRAnsfer 환저 액체 질소로 SFV 분산액을 함유하는 플라스크를 3-5 분 동안 분산 물을 동결. 다음 분산을 해동 1-2 분 동안 격렬하게 분산 와동 50 ° C에서 초음파 목욕에 둥근 바닥 플라스크를 놓습니다. 일곱 동결 및 해동 사이클의 총을,이 절차를 여섯 번 반복합니다.
2. SFV의 압출 균질 리포솜 소포를 형성
   1. 1 ML의 주사기 (주사기)에 SFV 분산을 전송하고 주사기-B에 LiposoFast - 기본 압출기를 사용하여 100 nm의 폴리 카보네이트 막을 통해 분산을 돌출.
   2. 다시 주사기로, 주사기-B의 분산을 돌출, 다음 사이클을 열 번 반복합니다. 때문에 압출, 시간이 명확한 분산에 흐릿한 모습에서 주사기 변화의 솔루션입니다. 열 사이클 (스물 단일 압출 단계) 장치로부터 주사기-B를 제거하고 멸균 주사기 내로 직접로부터 최후에 분산액을 압출 한 후1.5 ml의 반응 관.
3. 리포좀의 정제 무료 염료에서 DY-676-COOH를 캡슐화
   1. 10 mM 트리스 버퍼 pH 7.4 (컬럼 길이 28cm, 직경 0.8 cm)에 침지 G25 구슬을 이용한 겔 크로마토 그래피 컬럼을 준비한다.
   2. 겔 매트릭스에 샘플 드레인 겔 침대에 압출 소포 분산의 0.5 ml의 이동 및하자.
   3. 10 mM 트리스 버퍼 pH 7.4 (그림 1A)와 리포좀을 용출 및 열에서 완전히 무료 염료 배수 될 때까지 열을 씻는다. 필요하다면, 수집하고 제조업체의 지침에 따라 탈염 탈수하여 무료 염료를 재활용합니다.
   4. 다음 10 멸균 mM 트리스 버퍼 pH 7.4의 적절한 볼륨을 분산 초 원심 분리 (200,000 XG, 8 ° C에서 2 시간)에 의해 용출 된 리포좀을 집중.
4. 캡슐화 된 DY-676-COOH 농도의 정량화
   1. DY-676-COOH (0, 82, 124을 용해하여 검량선을 작성,10 mM 트리스 완충액 247, 494, 988 nM의)은, pH가 0.1 ~ 7.4 % 트리톤 (Triton) X100을 포함.
   2. 소포를 파괴하고 캡슐화 된 염료를 해제하는 1 % 트리톤 (Triton) X100을 포함하는 100 ㎕의 트리스 완충액에서 실온에서 5 분 동안 리포좀 2 μL (50 밀리몰 / L 스톡 100 nmol의 최종 지질)을 녹인다. 이어서 0.1 %의 트리톤 X100 최종 농도 10 mM 트리스 완충액, pH를 7.4으로 시료를 희석 (V / V) 1 ml의 총 부피를 만드는. 중복의 모든 샘플을 준비합니다.
   3. 여기 λ = 645 nm의 방출 λ = 700 nm에서 흡수 및 배출 모든 샘플 (무료 DY-676-COOH 트리톤 - X100 처리 리포좀)을 측정한다. 정하고 캡슐화 염료의 농도를 결정하는 자유 염료의 검량선을 사용한다.
5. 리포좀 특성
   1. 동적 광산란에 의한 리포좀의 크기와 제타 전위를 결정합니다. AC 멸균 필터 (0.2 μm의) 10 mM 트리스 버퍼 pH 7.4 리포좀 샘플을 희석100 ~ 300 μM (지질)의 oncentration. 저용량 일회용 큐벳으로 희석 샘플을 전송하고 제조자의 지시에 따라 샘플을 측정한다.
   2. 표준 프로토콜에 따른 리포솜 소낭들의 크기, 완전성 및 균질성을 입증하기 위해 전자 현미경에 의해 특성화 리포좀.

2. 형광 담금질의 확인 및 준비 리포좀의 활성화

1. 형광 소광 활성화 및 물리 화학적 분석
   1. 립-Q에 대한 두 개의 1.5 ml의 튜브와 무료 DY-676-COOH 2 튜브를 준비합니다. 전송 100 nmol의 총 지질 튜브에 대응 (캡슐화 DY-676-COOH 138 ㎍ / ㎖를 함유하는 42 밀리몰 / L-Q 립 스톡 용액 2.38 μL). 립-Q의 색소 함량 (138 ㎍ / 1,000 μL 사용 립-Q μL X 2.38에서 예를 들어 결과 0.38 μg의) 무료 DY-676-COOH 상당을 전송합니다. 하나의 욕조를 품어4 ° C에서 각 프로브의 전자 및 -80 ° C 하룻밤 (16 시간)에서 제 2 튜브를 동결.
   2. 30 ° C까지 가열 블록을 가열. 짓 눌린 얼음 냉각 상자를 채우고 실온에 10 mM 트리스 완충액 pH 7.4의 나누어지는 평형.
   3. 4 ° C에서 프로브를 제거하고 5 분 동안 30 ° C에서 -80 ° C에서 프로브 (빛으로부터 보호하기 위해 알루미늄 호일에 싸서) 신속하게 해동 실온에서 평형. (또한 빛으로부터 보호하기 위해 알루미늄 호일에 싸서) 실온에 전송하기 전에 1 분 동안 얼음에 해동 프로브를 진정.
   4. 100 ㎕의 최종 부피로 각각의 프로브 10 mM 트리스 완충액 (pH 7.4)를 첨가하고, 실온에서 10 분 동안 평형을 모든 프로브.
   5. 피펫 80 저용량 유리 큐벳 각 프로브의 μL 및 분광기상에서 400 내지 900 nm의 각 프로브에서의 흡수를 측정한다. 그에 상응하는 튜브에 프로브를 돌려줍니다.
   6. 적당한 유리 큐벳에 각 프로브의 80 μl를 전송674 nm에서 흥미로운 프로브에 의한 분광에 형광 방출을 측정하고 694-800 nm의에서 형광을 측정.
2. 세포 흡수 및 형광 활성화
   1. 표준 상태 (37 ° C, 5 % CO ₂ 95 % 가습 분위기)에 따라 해당 문화 미디어 다음 세포주를 얻고 문화. 여기서, 뮤린 대식 세포주 J774A.1를 이용 (둘 베코 이글 배지를 10 % (v / v) 소 태아 혈청이 보충 된 수정 된), 인간 뇌종양 세포주 U-118MG (필수 비타민 및 10 %를 함유하는 MEM (V / ⅴ) 소 태아 혈청)와 인간 섬유 육종 세포주, HT-1080 (5 % FCS로 RPMI).
   2. 폴리 -L- 리신으로 코팅 8- 웰 챔버 슬라이드 (각 웰에 100 ㎕의 0.001 % 폴리 -L- 리신을 추가하고 10 분 동안 37 ° C에서 배양한다. 대기음 용액 챔버 슬라이드 적어도 4 마르기하자 무균 작업대에 실온에서 시간. 챔버 슬라이드를 씻어 3필요할 때까지 200 μL 행크 완충 식염수 용액으로 시간 후 39 ° C에서 파​​라핀, 알루미늄 호일 및 저장으로 그들을 밀봉.
   3. 챔버 슬라이드가 건조하는 동안 필요한까지, 4 ° C에서 리포좀과 염료 용액 및 저장을 필터 소독.
   4. 생체 NIR 형광 이미징 시스템에서의 전신 흡수 프로브와 분석을 위해 시험 3 세포주의 각각에 대한 5 작은 배양 플라스크 (총 15 주 형틀)을 제조. 시드 2 × 10 ⁶ J774A.1, U-118MG과 (quintuples)에서 각각의 배지 5 ㎖와 문화 플라스크 당 HT-1080 세포는 16 ~ 24 시간 동안 성장한다. 상기 배양 플라스크에 평행하게 각각 챔버 슬라이드 2 웰에 각각의 세포주 (J774A.1 및 HT-1080) 또는 20,000 세포 (U-118MG) 30,000 세포를 시드 및 16-24 시간 동안 500 ㎕의 배양 배지에서 성장 .
   5. 다음날, 세포 라인 당 챔버 슬라이드 각 세포주의 한 웰에 두 플라스크 립 Q-100 nmol의 (최종 지질 량)을 추가한다.즉시 1 ~ 4 ° C에 세포주 당 플라스크 인큐베이터에 두 번째 플라스크를 전송합니다.
      주 : 챔버 슬라이드에 집중하게 프로브 부피 플라스크에 첨가하고, 챔버 슬라이드를 동일한 10 배 이상 (5 ml를 500 ㎕의 배양 배지이다). 미세한 검출 플라스크로부터 세포 펠릿 결상 NIR 형광 이미징 시스템보다 덜 민감하기 때문에 필요하다.
   6. 세포주 당 챔버 슬라이드 각 세포주의 한 웰에이 플라스크에서 세포 립-Q의 염료 함량 농도 상당액 자유 DY-676-COOH를 추가 한 다음 즉시 세포주 당 한 플라스크를 전송할 4 ° C의 (에너지 고갈) 및 인큐베이터에 챔버 슬라이드와 함께 다른 플라스크에. 해당 조건에서 24 시간 동안 모든 세포를 품어. 프로브없이 플라스크의 세포는 치료를받지 않은를 제공합니다.
3. NIRF 이미징 및 반 정량 분석
   1. 24 시간 배양 기간 후 행크스와 세포를 2 회 세척 플라스크에서 세포를 수확 500 μL 튜브 소금 용액 (HBSS) 다음 원심 분리 (200 XG에 5 분) 500 μL HBSS에 세포 펠렛을 긁어 버퍼링.
   2. 여기 (615-665 ㎚) 및 배출 (> 700 nm의에서 컷)의 세포 펠렛 (및 HBSS) NIRF 이미 저와 이미지를 사용하여 필터로 튜브를 놓습니다.
   3. 자가 형광 공제 및 제조업체 지침에 따라자가 형광 대 대상의 강도를 평가합니다. 이것은 측정치들이 서로간에 비교할 수 있도록, 노광 시간, 카메라 이득 비닝 및 비트 깊이 스케일링 후에 카운트 레벨을 나타내는 평균 신호로서 형광 강도 (스케일링 계수 / 초)의 반 정량적 수준을 줄 것이다.
4. 공 초점 현미경 분석
   1. 24 시간 배양 후, 500 μL HBSS로 2 회 세척 챔버 슬라이드에 세포를 수확.
   2. 가전​​ 수정200 μL HBSS 실온에서 30 분 동안 3.7 % (v / v)의 포름 알데히드를 포함와 재편.
   3. 고정이 진행되는 동안, DNA 얼룩 장착 솔루션, 훽스트 (Hoechst)-33258 1:50 희석.
   4. 고정 후, 다음 HBSS와 세포 2 번 씻어 유리 슬라이드에서 챔버를 분리합니다. 챔버 슬라이드의 우물에 해당하는 각각의 자리에서 DNA 얼룩을 포함하는 50 μl를 장착 솔루션을 추가합니다. RT (어두운)에 투명 매니큐어 및 자연 건조 10 분으로 가장자리를 밀봉, 커버 글라스와 세포를 커버.
   5. 적합한 형광 현미경 공 초점 현미경 이미지 세포. 핵 (훽스트-33258 : 여기 405 nm의, 방출 420-480 nm의) 해당 구성 요소의 시각화를위한 다음 여기 및 방출 설정을 사용합니다. NBD-DOP​​E (리포좀 지질 : 여기 488 nm에서 530 ㎚). DY-676-COOH (NIR 형광 염료 : 여기 633-645 nm의 방출 650-700 nm의).
      주 : 확인이 형광 현미경로만 제공은 더 높은 630 나노 미터보다 파장의 여기 및 방출을 허용 적절한 필터가 장착되어 있습니다.

3. 염증의 생체 형광 이미징에서 리포솜 기반

1. 동물 및 재료의 제조
   1. 하우스 8~12주 된 물과식이 표준 조건에서 약 36g 무게 남성 NMRI 마우스.
   2. 세븐 일 전에 실험의 시작, 조직자가 형광을 줄이기 위해 모든 쥐에게 낮은 페오 포비 다이어트를 제공합니다.
   3. 24 시간 각 실험의 시작하기 전에, 원하는 영역에서 마우스 면도 (예, 뒷 다리 부종의 촬상이 요구되는 경우에이면의 전체 면적).
   4. 동물의 무게를 측정 및 프로브의 양을 계산 립-Q 사용의 내용을 염색 무게와 무료 DY-676-COOH (해당하는 kg 당) 10 μmol (지질 농도 마우스 (립-Q와 립 dQ를 당 주입한다) .
   5. 이미지 동물세포 펠릿에 사용 된 것과 동일한 설정을 사용하여 전신 NIR 형광 이미 저. 이 측정은 동물의자가 형광을 제공합니다.
   6. 1 ml의 등장 성 식염수를 10 mg을 모산-A를 용해하고 4 ℃에서 하룻밤 저장합니다.
2. 염증 및 생체 내 NIRF 이미징의 유도
   1. 다음과 같은 솔루션이 포함 된 마우스에 3 주사기를 준비합니다. 50 μL 모산-A 용액 (10 ㎎ / ㎖) 50 ㎕를 등장 성 식염수와 두 번째 주사기와 하나의 주사기를 입력합니다. 제어 동물 용 립-Q와 립 dQ를 (10 μmol / kg 체중 (지질)가) (립-Q에서와 같이 농도) 시험 동물 무료 DY-676-COOH를 위해 지정되어있다 프로브와 세 번째 주사기를 입력합니다. 프로브는 150 μl의 최종 볼륨에 무균 HBSS로 희석되어 있는지 확인합니다.
   2. (건조를 방지하고 깊은 잠까지 2 % 이소 플루 란과 동물을 마취하고 발에 터치시 반응하지 않는하기 위해 동물의 눈에 아이 크림을 적용이)은 약 2 분 소요됩니다.
   3. (아직 마취) 따뜻한 매트에 마우스를 놓고 오른쪽 뒷다리에있는 모산-A 솔루션 피하 왼쪽 뒷다리에 식염수를 주입. (t 0 시간을 =로) 주입 / 측정 기록 시간을 즉시 정맥 프로브를 삽입 한 후 이후 이미지 동물을. 이미지 큐브 같은 결과 이​​미지를 저장하고 다른 모든 동물과 각각의 프로브에 대해 위 단계를 반복합니다.
   4. 이미지 동물 측정 챔버의 단계 (예를 들어, 아래 따뜻한 매트를 배치하여) 따뜻한있는 것을 확인하고 매 10 시간 게시 주사 2 시간 후에서 24 시간 후 주입, 저​​체온증을 방지하기 위해. 각 측정 한 후, 음식과 물을 광고 무제한으로 새장에 동물을 배치하고 온화한 동물 실에서 케이지를 배치합니다. 동물이 더 이상 터치에 반응하지 트면, 5-10 분 동안 이산화탄소 안락사 만드는 2 % 이소 플루 란 마취 제 의한 동물을 안락사반드시 동물이 완전히 호흡을 중지하고 엄격 경직이 발생.
   5. 표준 온라인으로 평가 될 수있다 프로토콜 (http://www.freebookez.com/mouse-dissection-lab-report/) 및 이미지 기관에 따라 쥐를 해부하다.
   6. 먼저 동물 (unmixing) (식염수로 뒷다리 왼쪽) 형광도에 대한 관심과 염증이 영역의 목표 형광 (모산-A와 오른쪽 뒷다리)의 다음 할당 영역의 전체 형광을 차감 한 제조업체의 지시에 따라 측정 결과를 평가합니다.

결과

이러한 리포좀의 수성 내부에 여기에 사용 NIRF 염료 DY676-COOH와 같은 형광 염료의 고농도의 캡슐화는 형광 소광의 하이 레벨로 이끈다. 형광 급냉, 고농도 많은 형광체와 함께 볼 현상은, 대상 지역의 높은 감도 및 신뢰성있는 검출이 요구되고 생체 내 이미징 애플리케이션의 여러에서 이용 될 수있다. 리포좀의 사용은 또한 생체 내 (in vivo) 적용을위한 필수 불가결 염료의 보호?...

토론

리포좀은 또한 형광 염료 전달​​ 시스템에 대한 역할을 할 수 있기 때문에, 그것들은 대상 질환의 촬상을 가능하게한다. 이러한 NIRF 염료, 여기서 사용 DY676-COOH, 형광 염료 등의 고농도의 캡슐화는 포획 염료의 형광 소광의 하이 레벨로 이끈다. 형광 급냉, 고농도로 많은 형광체와 함께 볼 현상은 대상 영역의 높은 감도 및 신뢰성있는 검출이 요구되는 생체 내 이미징 애플리케이션에서 여...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials and equipments for preparation of liposomes
egg phospahtidylcholine	Avanti Polar Lipids	840051P	Dissolve in chloroform and store in glass vials (214 mg/ml)
cholesterol	Sigma	C8667	Dissolve in chloroform and store in glass vials (134 mg/ml)
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt)	Avanti Polar Lipids	880120P	Dissolve in chloroform and store in glass vials (122 mg/ml)
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (ammonium salt)	Avanti Polar Lipids	810145P	Dissolve in chloroform and store in glass vials (2 mg/ml)
Sartorius MC1 (d = 0.01 mg)	Sartorius AG	Research RC 210 P	used for weighing the phospholipids
Rotavapor	Büchi Labortechnik AG	R-114	used for hydration of phospholipid film
Waterbath	Büchi Labortechnik AG	R-481	used for hydration of phospholipid film
Vacuum Controller	Büchi Labortechnik AG	B-720	used for hydration of phospholipid film
Vacobox	Büchi Labortechnik AG	B-177	used for hydration of phospholipid film
Circulation Chiller	LAUDA DR. R. WOBSER GMBH & CO. KG	WKL 230	used for hydration of phospholipid film
DY-676-COOH	Dyomics GmbH	676-00	Dissolve in 10 mM Tris and store stock at -20°C
Tris-(Hydroxymethyl)-aminomethan	Applichem	A1086	buffer 10 mM, pH 7.4
Trichlormethan	Carl Roth GmbH + Co. KG	Y015.2	used for liposome preparation
Sonicator	Merck Eurolab GmbH	USR 170 H	used for liposome preparation
Vortex Genie 2 (Pop-off Cup, No. 146-3011-00)	Scientific Industries Inc.	SI-0256	used for liposome preparation
Sephadex G25 medium	GE Healthcare Europe GmbH	17-0033-01	used for liposome purification
Triton X100	Ferak Berlin GmbH	505002	used to destruct liposomes  for dye quantification
LiposoFast-Basic	Avestin Inc.		used for the extrusion of liposomes
Polycarbonate filter membrane, 100 nm (Whatman Nucleopore Trans Etch Membrane, NUCLEPR PC 19 MM, 0.1 U)	VWR		used for the extrusion of liposomes via LiposoFast-Basic
Fluostar Optima	BMG Labtech		used for dye quantification
Zetasizer Nano ZS	Malvern		used for the determination of liposome size and zetapotential
Ultracentrifuge	Beckmann Coulter GmbH	XL 80	used for concentration of the samples
Rotor	Beckmann Coulter GmbH	SW 55 TI	used for concentration of the samples
Materials and equipments for the evaluation of liposome and optical imaging
Zymosan-A from Saccharomyces cereviciae	Sigma	Z4250-250MG	used for induction of inflammation
Isotonic Saline (0.9%)	Fresenius GmbH	PZN-2159621	used for the dilution of Zymosan-A
Isoflurane vaporizer	Ohmeda Isotec 4		used for anesthesizing animals
Isoflurane	Actavis GmbH	PZN-7253744	anesthesia
Thermo Mat Pro 20 W	Lucky Reptile	61202-HTP-20	used to keep animals warm during anesthesia
Omnican-F (1 ml injection)	Braun	PZN-3115465	used for subcutaneous and intravenous application of probes
Panthenol eye cream	Jenapharm	PZN-3524531	used to prevent dryness of the eyes of animals during anesthesia
Hanks buffered saline solution	PAA Laboratories /Biochrom AG	L2045	w/o Mg2+, Ca2+ and phenol red. For dilution of probes and for washing of cells
8-Well chamber slides	BD Biosciences	354108	used for cell culture followed by microscopy
Cell culture flasks	Greiner BioOne
Cell culture media	Gibco (life technologies GmbH)
Fetal calf serum	Invitrogen
Poly-L-Lysine solution (0.01%, 50 ml)	Sigma	P4832	used to coat cell culture chamber slides
Mountant Permafluor	ThermoScientific	S21022-3	Mounting solution for microscopy
Hoechst-33258	AppliChem		DNA stain for microscopy
Hera-Safe	Heraeus Instruments		sterile work bench used for cell culture
HERA cell	Heraeus Instruments		Incubator used for cell culture
LSM510-Meta	Zeiss		used for confocal microscopy
Maestro-TM in vivo fluorescence imaging system	CRi, Woburn		used for whole body fluorescence imaging of small animals
Spectrophotometer (Ultrospec 4300 pro UV)	GE Healthcare		used for measurement of absorption
Spectrofluorometer (Jasco FP-6200)	Jasco		used for measurement of fluorescence emission
Animals
NMRI mice (8-12 weeks old, male)	Elevage Janvier, France		used for inflammation trials