칩 서열 실험을 자동화하면 10,000 헬라 세포에 성적인 프로필을 생성합니다

요약

Methods for mapping in vivo protein-DNA interactions are becoming crucial for every aspect of genomic research but they are laborious, costly, and time consuming. Here a commercially available robotic liquid handling system that automates chromatin immunoprecipitation for mapping in vivo protein-DNA interactions with limited amounts of cells is presented.

초록

Chromatin immunoprecipitation followed by next generation sequencing (ChIP-seq) is a technique of choice for studying protein-DNA interactions. ChIP-seq has been used for mapping protein-DNA interactions and allocating histones modifications. The procedure is tedious and time consuming, and one of the major limitations is the requirement for high amounts of starting material, usually millions of cells. Automation of chromatin immunoprecipitation assays is possible when the procedure is based on the use of magnetic beads. Successful automated protocols of chromatin immunoprecipitation and library preparation have been specifically designed on a commercially available robotic liquid handling system dedicated mainly to automate epigenetic assays. First, validation of automated ChIP-seq assays using antibodies directed against various histone modifications was shown, followed by optimization of the automated protocols to perform chromatin immunoprecipitation and library preparation starting with low cell numbers. The goal of these experiments is to provide a valuable tool for future epigenetic analysis of specific cell types, sub-populations, and biopsy samples.

서문

차세대 시퀀싱 (NGS) 기술은 광범위하고 더 접근 가능 해짐에 따라, 지금 전사 인자의 발견을 가능하게 NGS 검출 (칩 SEQ), 다음 면역을 염색질되는 단백질 DNA 상호 작용의 게놈 넓은 매핑에 사용되는 기본 방법 히스톤 수정 사이트 또는 패턴을 결합. 칩 서열은 농축 된 DNA 단편의 측정에 의해 단백질 DNA 상호 작용의 정량적 분석을 위해 사용할 수있는 전체 게놈의 높은 데이터 처리량을 제공하는 것이 유리하다. 그러나, 이러한 서열 라이브러리를 생성하기에 충분한 재료를 얻는데 어려움 표준 칩 SEQ 실험에서 몇 가지 단점이있다.

칩 실험, 세포 용해 및 면역 복합체의 초음파에 의한 염색질 전단, 3) 형성을 포함 2) 샘플 준비 1) 가교 단백질 DNA 결합 영역 등 6 가지 기본 단계로 구분됩니다면역 복합체의 4) 침전, 면역 복합체의 5) 세척 및 qPCR에와 NGS에 의한 풍부한 재료 및 분석 6) 용출.

동종의 항원에 대한 항체의 제조 염색질 좋은, 원래 샘플 항원의 양, 및 특이성 및 친 화성 : 칩 분석의 성공은 세 가지 요인에 의존한다. 주요한 제한은 시퀀싱 라이브러리를 생성하기에 충분한 농축 DNA를 얻기 위해 세포 수를 시작 다량위한 요건이다. 이러한 생검 샘플이나 세포 하위 집단으로 제한된 샘플 양의 작업 과학자, 칩 서열 실험은 매우 도전이다. 셀 ^(1)의 낮은 ^양,이 작업시 최근 연구 칩 서열 분석이 수행 될 수 있음을 보여 주었다. Diagenode 셀의 수가 제한 시작할 때 완전히 칩 SEQ 실험을 자동화 할 수있는 로봇 액체 핸들링 시스템을 개발했다.

자동화 제공칩 서열 수동으로 시료를 준비 많은 장점이 인간의 오류를 감소로는 변동성을 줄이고, 실험 비용을 감소시킨다. 염색질 면역 침전 및 라이브러리 제조 반자동 프로토콜은보고되어 있지만, 저 세포 수를 ^{3, 4, 5, 6을} 사용하는 경우 이러한 연구 중에 데이터를 도시하지 않았다.

본 논문에서는 완전 자동화 된 워크 플로는 자기 비드 기반 기술을 사용하고이 프로토콜 최적화에 여러 매개 변수를 처리 할 수​​있는 로봇 액체 처리 시스템의 크로 마틴 면역 및 라이브러리 준비 분석 모두에 대해 설명한다. 여기서, 자동 칩 SEQ 실험 성공적 단순화 표준화 및 소세포 인구 후생 유전 학적 프로파일을 연구하는 신뢰할 수있는 솔루션을 제공하기위한 목적으로 세포의 제한된 수의 실시 하였다. 이 문서에 설명 된 자동화 된 칩 프로토콜은 특정 히스톤 항체 시약 B를 사용하여 헬라 세포에 최적화되어 있습니다UT 흐름을 최적화하는 실험을 대응하는 다른 세포주 및 항체로 구성 될 수있다.

프로토콜

1. 표준 칩 실험

1. 세포 수집 및 DNA 단백질 가교.
   1. 80 % -90 %의 합류에 헬라-S3 세포를 성장. 문화 매체를 제거 1X 인산 완충 식염수 (PBS)의 10 ml로 두 번 접시를 세척하고, 배양 판에 트립신 - EDTA (1 배)를 추가합니다. 접시에서 세포를 분리하기 위해 2 분 동안 배양 최대. 세포를 수집하고 10 ml의 PBS로 두 번 세척한다.
      참고 : 긴 배양 시간은 세포 손상으로 이어질 것입니다.
   2. 500 XG에서 5 분 동안 원심 분리 세포를 PBS 20 ㎖로 세포를 재현 탁. 세포를 계산 진행합니다.
   3. 500 XG에서 5 분 동안 세포를 원심 분리기 상층 액을 제거하고 PBS의 500 μl를 추가합니다. 정착 단계에 대한 세포의 최적의 수는 500 μL의 PBS 천만 세포 당이다.
   4. 세포 현탁액 500 ㎕를 각각 나누어에 신선한 37 % 포름 알데히드의 13.5 μl를 추가합니다. RT에서 8 분 동안 세포를 흥분시키는.
   5. 1.25 M 글리신 오디오 솔루션을 57 μl를 추가이온은 고정을 중지합니다. 부드러운 소용돌이에 의해 일정한 혼합과 실온에서 5 분 동안 품어. 이후이 지점에서 얼음에 작업 할 수 있습니다.
   6. 4 ° C에서 5 분 동안 500 XG에서 세포를 원심 분리기와 세포 펠렛을 방해하지 않고 상층 액을 제거한다.
   7. 1 ml의 PBS로 두 번 세포를 씻으십시오. 조심스럽게 뜨는을 취소하고 얼음에 세포 펠렛을 유지합니다.
2. 세포 용해 및 염색질 전단
   1. 세포 펠렛을 얼음 - 냉각 된 라이 시스 (Lysis) 완충액 (IL1) 10 ㎖를 추가 (1 백만 세포 용해 완충액 당 1 ㎖ 최적의 비율이다). 피펫까지 여러 번 아래로 부드러운 혼합으로 4 ° C에서 10 분 동안 품어.
   2. 500 XG에 5 분, 4 ° C에서의 해물을 원심 분리기. 상층 액을 제거한다.
   3. 해물에 차가운 얼음 용해 버퍼 IL2 10 ㎖를 추가로 pipetting 아래로 부드럽게 섞는다. 4 ° C에서 10 분의 해물을 품어.
   4. 500 XG에 5 분, 4 ° C 원심 분리 상층 액을 제거한다.
   5. 처리장IS1 전단 버퍼 200X 프로테아제 억제제 칵테일 (PIC)을 첨가 전체 전단 버퍼 재. 5 분 동안 얼음에 버퍼를 유지하고 나중에 얼음에서 작동합니다. 펠렛은 각 1000 만 셀에 완전한 IS1 전단 버퍼의 1 ML을 추가하고 부드럽게 피펫 아래로 섞는다. 10 분은 시료의 점도를 감소시키기 위해 초음파에 앞서 얼음 샘플을 배양한다.
   6. 10 사이클 각각 2~3 세트 수욕 초음파 처리기를 사용하여 초음파 염색질의 300 μL 분취 전단. 주기는 30 초 "ON"높은 전원 설정에 30 초 "OFF"로 구성되어 있습니다. 대안 적으로, 30 초 "ON"30 초 "OFF"의 5 내지 10 사이클까지의 짧은 시간에 초음파 피코 초음파 장치를 사용한다. 간단히 소용돌이는 실행 사이에 튜브를 회전합니다. sonicators 다른 형태를 사용하는 경우, 염색질 전단 위해 제조자의 지시에 따라 대응.
   7. 10 분 C 16,000 XG에서 전단 염색질을 원심 분리기IP 단계에서 바로 사용되는 상등액을 ollect. 또한, 향후 사용을 위해 최대 2 개월까지 -80 ° C에서 염색질을 저장합니다.
   8. 이전 1.5 % TAE 아가 로스 젤 또는 bionalyzer를 사용하여 면역 침전 단계에 염색질 전단 효율성을 분석 할 수 있습니다. 최적의 염색질 조각의 크기는 100 ~ 600 bp의 사이의 범위.

2. 낮은 셀 칩 실험

1. 세포 수집 및 DNA 단백질 가교
   1. 80 % -90 %의 합류에 헬라-S3 세포를 성장. 문화 매체를 제거 1X 인산 완충 식염수 (PBS)의 10 ml로 두 번 접시를 세척하고, 배양 접시에 1X 트립신 - EDTA를 추가합니다. 접시에서 세포를 분리하기 위해 2 분 동안 배양 최대.
      참고 : 긴 배양 시간은 세포 손상으로 이어질 것입니다.
   2. 1 ml의 원심 분리 튜브에 혈청을 함유하는 1 ml의 배지를 첨가하여 세포를 수집한다. 세포를 계산합니다.
   3. X 500 g에서 5 분 동안 세포를 원심 분리기. 휴대폰 번호를 가져 오기고정 용 배지 1 ㎖ 당 10000 세포.
   4. 고정 각 튜브에 36.5 % 신선한 준비 포름 알데히드의 27 μl를 추가합니다. 튜브를 두세번 전환 및 RT에서 10 분 배양한다.
   5. 튜브를 반전, 시료에 두세번 1.25 M 글리신 용액 115 μl를 첨가하고, RT에서 5 분 동안 배양한다. 이후이 지점에서 얼음에 작업 할 수 있습니다.
   6. 4 ℃에서 10 분 동안 300 XG에서 세포를 원심 분리기. 천천히 상층 액을 버린다.
   7. PIC (200X, 최종 농도 1 배)로 1 ml의 얼음 차가운 HBSS와 세포를 씻으십시오. 39 ° C에서 10 분 동안 300 XG에 세포를 재현 탁하고 원심 분리하는 튜브를 두세번 전환. 조심스럽게 뜨는을 취소하고 얼음에 세포 펠렛을 유지합니다.
2. 세포 용해 및 염색질 전단
   1. 10,000 세포 당 완전 용해 버퍼 TL1 (용해 버퍼 TL1 + PIC) 25 μl를 추가하고 세포를 재현 탁 수동으로 튜브의 바닥을 선동. 5 분 동안 얼음에서 인큐베이션.
   2. 전체 HBSS의 75 μl를 추가 (HBSS + PIC)는 10,000 세포를 포함하는 각 나누어지는로 버퍼.
   3. 5 사이클 각 5 세​​트에 대한 초음파 10,000 세포 100 ㎕ 분주 전단. 주기는 30 초 "ON"과 높은 전원 설정에 30 초 "OFF"로 구성되어 있습니다. 대안 적으로, 30 초 "ON"30 초 "OFF"의 5주기보다 짧은 시간 초음파 처리와 함께 사용 피코 초음파 장치를 사용한다. 최적의 염색질 조각의 크기는 100 ~ 600 bp의 사이의 범위. 염색질 준비, 세포 유형과 다른 sonicators 별도의 전단 최적화 실험을 필요로합니다.
   4. 원심 분리기 10 분 뜨는을 불용성 물질을 폐기하고 수집하는 14,000 XG에서 전단 염색질은 IP 단계에서 즉시 사용할 수 있습니다. 또한, 향후 사용을 위해 최대 2 개월까지 -80 ° C에서 염색질을 저장합니다.
   5. 1.5 % TAE 아가 로스 젤을 사용하여 이전에 면역 침전 단계에 염색질 전단 효율성을 분석하거나bionalyzer. 종래의 RNase 대한다 전단 샘플의 시각적 평가를 향상시키기 위해 겔 분석을 아가 로스. 최적의 염색질 조각의 크기는 100 ~ 600 bp의 사이의 범위.

3. 염색질 면역 침전 및 도서관 준비

1. 표준 자동화 칩 실험
   1. 염색질을 전단 100 μL 칩으로 버퍼 H (에 칩 버퍼 H + PIC)의 120 μl를 추가합니다. IP 200 μl를 사용하여 입력 샘플로 20 μL 2 μl를 유지합니다.
   2. 자동화 기기의 자동화에 칩을 200㎕ 프로토콜을 선택합니다. 프로토콜의 처리량은 실행 당 1 ~ 16 샘플입니다.
   3. 염색질은 1-2000000 세포, 안티 H3K79me3의 1-2 μg의에 해당하는 사용하여 자동화 된 칩 실험을 실행 -H3K27me3, -H3K4me3, -H3K4me2, -H3K9ac, -H3K9 / 14ac, -H3K36me3과 H3K9me3 칩 서열 등급 토끼 클론 항체. 최적의 항체 금액은 히스톤 수정 및 친 화성 및 사양에 따라 달라집니다해당 항체의 ificity.
      1. 이소 타입 대조군 항체와 같은 비 - 면역 토끼 IgG를 동일한 양을 사용한다. 또한, 코팅 구슬 또는 칩 컨트롤과 같은 특정 차단 항체를 사용합니다. 각각의 반응 단백질 코팅 자석 구슬의 20 μl를 추가합니다.
   4. 안티 H3K79me3 및 -H3K4me2 클론 항체와 자동화 된 칩 실험을 수행 할 수있는 자동화 된 히스톤 칩 서열 키트 시약을 사용합니다. 안티 H3K27me3, -H3K4me3, -H3K9ac와 -H3K9 / 14ac, -H3K36me3 및 -H3K9me3을 칩 실험을 수행 할 수있는 이상적인 칩 서열 키트 시약을 사용합니다.
   5. 자동화 장치에 구현 된 소프트웨어의 지시에 따라 자동화 된 칩 프로토콜을 선택합니다. 항체 코팅 단계 4 시간 및 면역 침전 단계에 대한 15 시간에 칩 실험 매개 변수를 설정합니다. 역 가교 단계는 4 시간 동안 65 ° C에서 자동화 기기에서 일어난다.
   6. 자동화 시스템에서 역방향 가교 DNA를 정제. 선택 AUT프로토콜 또는 키트는 자기 비드 기반의 DNA 정제 사용에 DNA 정화 omated 프로토콜을 지원합니다. 물 25 μL의 DNA를 용출시켰다.
   7. 면역 DNA의 10 %를 추출하여 면역 DNA를 정량화. DNA 면역 침전 수율은 염색질 항체, 세포의 종류 및 대상 히스톤 변형의 품질에 의존한다. 제조업체의 지침에 따라 분석 키트를 사용하여 DNA 정량화.
   8. 적어도 (1)​​ 및 포지티브 한 음성 대조군 게놈 영역에 대해 프라이머를 사용한 정량적 PCR에 의해 면역 침전 DNA의 품질을 분석한다. 부화 칩을 평가 총 면역 DNA의 10 % 이상을 사용하지 않는다.
      1. qPCR의 반응을 준비합니다. 배 SyberGreen qPCR의 마스터 믹스 10 μL, 프라이머 믹스 1 μL, 면역 또는 입력 DNA 20 μl의 최종 반응 부피 멸균 최대의 1-5 μl를 추가합니다. qPCR의 프로그램은 95 ° C에서 초기 변성 단계를 포함5-10 분 동안의 Taq 중합 효소 공급자에 따라 어닐링 온도는 선택된 프라이머에 따라 설정되어야한다.
   9. 칩 DNA뿐만 아니라 같은 염색질 준비에서 저장된 입력 DNA를 모두 사용하여 라이브러리를 구축 할 수있는 상업적으로 이용 가능한 일루미나 칩 서열 라이브러리 준비 시약과 호환 사용 자동 라이브러리 준비 프로토콜. 라이브러리 준비를위한 각 항체의 면역 DNA의 10 ~ 20 NG를 사용합니다. 실행 당 16 자동화 라이브러리까지 준비합니다.
   10. 라이브러리 순서와 일루미나 제조업체의 지침에 따라 클러스터를 생성합니다. 표준 Illumina의 파이프 라인, 필터 다음과 같은 주요 생물 정보학 분석 (클러스터 필터링,베이스 호출 등)을 수행하고,이 롯데 얼라이 (현재 버전 GRCh38입니다) 최신 인간 게놈 어셈블리에 대한 읽기 맞 춥니 다. 피크 통화를 SICER ⁷ MACS ^(8)을 사용하여 와트 피크의 다운 스트림 분석을 수행i 번째 호머 ⁹ BEDTools ¹⁰ 선호하는 소프트웨어.
2. 낮은 세포 수 자동 칩 실험
   1. 염색질을 전단 100 μL에 완전한 칩 버퍼에 T (에 칩 버퍼에 T + PIC)의 120 μl를 추가합니다. IP 200 μl를 사용하여 입력으로 20 μl를 유지합니다.
   2. 자동화 시스템의 자동화에 칩을 200㎕ 프로토콜을 선택합니다. 프로토콜의 처리량은 실행 당 1 ~ 16 샘플입니다.
   3. 낮은 염색질 수량에 작동하도록 최적화 자동화 된 칩 시약 및 칩 학년 항체를 사용하여 자동화 된 칩 서열 실험을 실행합니다. 10,000 세포와 10 만 셀, 안티 H3K27me3 0.5 μg의, 0.25 μg의 -H3K4me3, 0.1 μg의 -H3K27ac, 0.25 μg의 -H3K9me3 토끼 프리미엄 칩 서열 학년 토끼 폴리 클로 날 항체에 해당 염색질을 사용합니다. 최적의 항체 금액은 히스톤 수정 및 대응하는 항체의 친화력과 특이성에 따라 다릅니다.
      1. 비 면역 RAB의 동일한 양을 사용하여이소 타입 대조군 항체로서 비트의 IgG. 또한, 코팅 구슬 또는 칩 컨트롤과 같은 특정 차단 항체를 사용합니다. 각각의 반응 단백질 코팅 자석 구슬의 10 μl를 추가합니다.
   4. 자동화 장치에 구현 된 소프트웨어의 지시에 따라 자동화 된 칩 프로토콜을 선택합니다. 항체 코팅 단계 4 시간 및 면역 침전 단계에 대한 15 시간에 칩 실험 매개 변수를 설정합니다. 역 가교 단계는 4 시간 동안 65 ° C에서 자동화 기기에서 일어난다.
   5. 제조업체의 지침에 따라 물을 25 μL 6 μL에서 권 용출 스핀 열을 사용하여 역방향 가교 DNA를 정화.
   6. 분석 상업용 키트를 사용하여 DNA 정량화. qPCR의 칩의 품질을 평가하기 위해 양 및 음의 제어 영역에 대한 프라이머를 사용하여 결과를 분석한다.
   7. 낮은 DNA의 콴과 라이브러리를 준비하기 위해 최적화 된 라이브러리 준비 시약 도서관 준비 키트를 사용하여tities. 30 페이지 및 라이브러리 준비를위한 (각각 10,000과 100,000 세포 실험에 해당) 칩이 DNA의 300 페이지를 사용합니다. 라이브러리 준비 시약과 호환 자동화 된 프로토콜을 사용하여 라이브러리를 준비합니다. 자동화 라이브러리 준비 처리량은 실행 당 1-48 라이브러리입니다.
   8. 이중 가닥 DNA 템플릿의 단부 수리 후, 시퀀싱 프라이머 부위를 포함하는 분해성 스템 - 루프를 결찰 어댑터. DNA 확장 단계에이어서, 라이브러리 준비 키트 프로토콜에 기재된 고 충실도 증폭 방법으로 시료를 증폭한다.
   9. 도서관 증폭 한 후, 정량화 및 라이브러리 준비 키트의 지침에 따라 라이브러리를 정화. 정화가 필요하지 않습니다 후 그 크기를 선택합니다.
   10. 라이브러리 순서와는 제조업체의 지침에 따라 클러스터를 생성합니다. 다음 스탠드 차 생물 정보학 분석 (클러스터 필터링,베이스 호출 등)를 수행하여ARD 제조 업체 파이프 라인, 필터, 그리고이 롯데 ⁷ 얼라이 (현재 버전 GRCh38입니다) 최신 인간 게놈 어셈블리에 대한 읽기 맞 춥니 다. , BEDTools ^10, 또는 선호하는 소프트웨어를 피크 통화를 SICER ⁸ MACS ^(9)를 사용하여 호머와 피크의 다운 스트림 분석을 수행합니다.

IP 스타 컴팩트에서 자동화 된 칩 실험을 설정하는 방법을 보여주는 소프트웨어 그림 1. 스크린 샷.이 소프트웨어는뿐만 아니라 주요 실험 변수 (항체 코팅, IP 및 세척을 변경으로 실행 당 샘플의 양을 선택할 수있는 유연성을 제공합니다 ) 연구자의 필요에 따라. 자동화 된 절차는 병렬로 서로 다른 조건 (즉, 다른 종류의 항체의 양, 다른 종류의 세포의 양, 심지어 다른 t을 테스트 할 수 있습니다씨네마 스테이션과 같은 실행에 자석 구슬의 양. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 자동화 시스템의 라이브러리 키트를 사용하여 차세대 시퀀싱을위한 자동화 된 라이브러리 준비를 설정하는 방법을 보여주는 소프트웨어의 2 스크린 샷. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

결과

8 개의 서로 다른 히스톤 표시 문자에 대해 자동화 된 칩 서열 실험을 최적화

성공적으로 개발하고 이전에 수동 칩 서열 번호 실험에서 검증 된 자동화 된 프로토콜 칩, 칩 등급 서열 항체를 확인하기 위해 선택되었다 (데이타 미기재). 안티 H3K79me3, -H3K27me3, -H3K4me3, -H3K4me2, -H3K9ac, -H3K9 / 14ac, -H3K36me3 및 -H3K9me3 다음 칩 서열 수준의 항체는이 연구를 위해 선택되었다. 모든 칩 등급 서열 항체의 특이성은 이전 도트 블랏, 펩티드 배열 및 웨스턴 블롯 실험에 의해 확인 하였다 (데이터는 보이지 않음). 증가하는 양의 항체와 칩 qPCR의 파일럿 실험은 항체 (도 3)의 감도를 결정하기 위해 수행되었다. 두 개 이상의 긍정적이고 두 대조군의 대상과 qPCR에 분석 하였다 높은 음의 목표를 통해 긍정적 인의 부화와 프로파일은 다섯 배 시퀀싱 EXPER 자격 것보다 iments. 이는 전단 염색질의 고품질 칩 및 칩 SEQ 실험을 수행하는 것이 중요하다. 이 책에 표시된 모든 칩 실험은 신선한 크로 마틴을 사용하여 수행 하였다. 그것은 -80 ° C에서 고정 된 세포를 동결하고 다른 날에 염색질 준비와 전단을 진행하는 것도 가능하다. 그러나, 염색질 갓 준비 염색질 따라서 초음파 조건이 각 염색질 준비를 위해 최적화 될 필요가있다 다르게 작동 할 수 있습니다 냉동 고정 된 세포에서 준비했다. 다른 종류의 세포로 작업 할 때, 다른 세제 조성물 (SDS)와 전단 버퍼를 사용할 수 있습니다. 이러한 현탁액에서 성장 일차 세포주 또는 세포 등의 세포 유형이 곤란 세포가 전단 및 헬라가 낮은 SDS 농도 (0.1 %)을 요구할 것이다 같은 전단 쉬운 세포주 높은 반면 SDS 농도 (1 %)이 필요하다 전단 버퍼.

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그림 자동화 시스템을 사용하여 칩 학년 항체의 3. 검증. 칩은 안티 H3K79me3, -H3K27me3, -H3K4me3, -H3K4me2, -H3K9ac, H3K9 / 14ac, 실시 하였다에서 전단 염색질에 -H3K36me3 및 -H3K9me3 토끼 폴리 클로 날 항체 히스톤 변형에 따라 100 만 헬라-S3 세포. 200 μL 작업 볼륨 자동화 된 칩 프로토콜 항체 적정 실험 자동화 기기에 사용 하였다. 1, 2, 5 및 10 μg의 항체의 양 칩 실험에 따라 테스트 하였다 2 μg의 IgG를 각 실험에서 음성 대조군으로 사용 하였다. 부화는 qPCR에 의해 평가되었다. 결과가 입력 % (qPCR에 분석 후 입력 DNA에 비해 면역 DNA의 상대적 양)로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

검증 및 최적 조건을 결정 후 칩 등급 항체의 L 량이 자동화 시스템에 사용되는 자동화 된 칩 SEQ 실험은 각 히스톤 변형 예 (도 4)에 대한 순서 정보를 생성하기 위해 수행되었다.

그림 4. 히스톤 칩 서열 프로파일은 자동화 된 칩 서열 실험에 의해 생성. 그림은 H3K4me3, H3K9ac 및 H3K9 / 14acH3K4me2 H3K79me3 및 H3K36me3 다른 게놈 영역에서의 칩 서열 프로파일을 보여줍니다. 4A는 전체 X를 따라 피크 분포를 보여줍니다 -chromosome 및 4b GAPDH 유전자를 둘러싼 75킬로바이트 지역에 분포. 4c는 MYT1 유전자를 둘러싼 500킬로바이트 지역에서 H3K27me3, H3K36me3과 H3K4me3의 프로필을 보여주고 4D는 200킬로바이트 지역 주변 ZNF12에 H3K9me3의 분포를 보여줍니다.large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

유전자 발현과 관련된 여섯 가지 히스톤 수정에 대한 히스톤 후생 유전 학적 프로파일 (H3K4me3, H3K9ac, H3K9 / 14ac, H3K4me2, H3K79me3 및 H3K36me3)가 생성되었다. 그림 4a는 다른 히스톤 마커 염색체 X를 따라 칩 서열 프로파일을 보여줍니다. 6 다른 히스톤의 프로파일을 관찰 높은 피크 상관 관계는 정확하고 신뢰할 수있는 데이터를 생성하는 자동화 된 시스템의 성능을 나타낸다.도 4B, 4C 및 4D는 구체적인 게놈 영역에서 다른 히스톤 변형 대 피크 분포를 나타낸다.

200 세포에 이르기까지 자동화 된 염색질 면역 침전 실험

칩의 실험에 이용 될 수있는 셀의 최소량은 염색질의 품질에 따라, specificit(Y)과 항체 연구 히스톤 수정 또는 단백질의 풍부한 감성. 제한된 양의 시료 및 시약 및 최적의 다른 캐리어의 선택 작업 DNA 복구의 효율성을 개선하고 칩 실험의 성공에 기여하면 좋은 칩 등급 항체 서열을 선택하는 것은 중요하다. 구체적 염색질의 낮은 양에서 작동하도록 최적화 된 칩 시약을 사용하여 IP 스타 자동화 시스템에서 시험 하였다 자동화 칩 프로토콜을 처리 할 수​​있는 세포, 염색질 항체 및 자성 비드의 상이한 수량의 최소한의 양을 결정한다.

프로토콜에 설명 된대로 첫째, 10,000 세포에서 염색질 초음파 처리 하였다. 칩 결과는 음성 대조군 지역에서 H3K4me3의 양성 대조군 지역에서 항체 무시할 신호에 중요한 부화를 보여줍니다 qPCR에 (그림 5A)에 의해 확인되었다. 비교 및 일관성의 증거, additiona 들어10,000 개의 세포를 이용 H3K27ac, H3K9me3 얻어진 L 데이터 및 H3K27me3 항체가 제공된다.

자동화 칩 실험 H3K4me3 동일한 항체를 이용하여 세포의 낮은 양 작동하도록 자동화 된 시스템의 기능을 설명하기 위해 다음을 수행 하였다. 자동화 된 칩은 재현과 수동 칩 결과 (그림 5B)와 매우 비슷했다 십 IP의 일련의 반응에 의해 입증, 잘 수행. 수동 및 자동화 된 실험을 수행하고, 자동화 프로토콜의 장점은 변화 (그림 5C)를 실험하는 실험을 감소 보였다.

그림 5. 수동 칩 실험 10,000 세포에 수행 된 10,000 세포 칩과 자동차에 칩 실험의 최적화 및 H3K4me3 0.25 μg의, H3K27ac 0.1 μg의, H3K9me3 0.2 0.5 μg의를 사용하여H3K27me3 항체의 5 μg의. 토끼의 IgG는 동일한 양의 대조군으로 사용 하였다. qPCR에 두 개의 양의 궤적과 각 칩 분석을위한 두 음의 궤적을위한 프라이머를 수행 하였다. 그림 5a는 복구가, 입력의 비율 (qPCR에 분석 후 입력 DNA에 비해 면역 DNA의 상대적 양)으로 표현이다. 5B 쇼 그림 10 칩 반응은 0.25 μg의 H3K4me3 폴리 클로 날 항체와 토끼 IgG를 0.25 μg의 부정적인 제어 항체를 사용하여 IP 스타 컴팩트에서 실행됩니다. 이어서 qPCR의 분석은 양의 궤적 EIF4A2 GAPDH 프로모터 및 TSS 네거티브 궤적 마이오글로빈의 exon2 및 SAT2 용 프라이머로 수행 하였다. 그림은 복구를 표시, 입력 (qPCR에 분석 후 입력 DNA에 비해 면역 DNA의 상대적인 양)의 백분율로 표시. 그림 5c는 10 자동화 된 칩 실험에 비해 10 사용 설명서 칩 실험 H3K4me3 칩 데이터를 보여줍니다. 오차 막대는의를 나타냅니다 10 회 반복 각각의 tandard 편차. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

자동화 된 프로토콜 칩의 감도를 이해하기 위해서는, 실험 IP 100,000 200 다운 세포로부터 원거리 세포 량을 사용하여 수행 하였다. 그것은 매우 일반적인 히스톤 변형 그대로 항 H3K27me3 항체를 사용 하였다. 다른 히스톤 또는 비 히스톤 항체의 사용은 에피토프 풍부와 항체의 품질에 따라, 어느 정도 세포를 필요로 할 수있다. 실험은 정량 PCR에 의해 확인되었다 그리고 구슬과 실험에서 항체 배경의 양을 줄여 적은 200 세포 항체 (그림 6) 성공적인 칩 qPCR의 결과를 가능하게 감소되는 것을 관찰 하였다.

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그림 6. 200 세포 칩 분석을 자동화. -S3 헬라 세포 및 항체에 대해 유도 H3K27me3. 염색질은 1 백만 세포 칩 반응을 당 하였다 (10 만 200 셀에 해당하는)이 크로 마틴의 연속 희석에서 전단되었다. 단백질 코팅 자석 구슬 1 H3K27me3의 μg의 10 μl의 H3K27me3 0.5 μg의 1 만 1,000 세포에 구슬의 10 μL 및 H3K27me3 0.25 μg의 500 및 200와 구슬의 5 μL, 10 만 세포 실험에 사용 하였다 세포. 10 만 셀 각각 1,000 세포 실험을 수행 할 때 1 μg의 토끼의 IgG μg의 0.5은 음성 대조군 항체를 사용 하였다. 6A는. 입력 % 이상에서 TSH2B와 GAPDH 유전자의 점유율을 보여줍니다 6b는 부정적인 GAPDH 제어 대 TSH2B의 상대적 점유율을 보여줍니다 게놈 영역입니다.

에 칩 서열 결과의 다운 스트림 분석10,000 세포

10,000 HeLa 세포 및 칩 실험 H3K4me3 항체 0.25 μg의 함께 칩 - 서열 분석을 수행 하였다 자동화 세포의 낮은 초기 번호 자동화 칩 SEQ 실험 전체 품질을 평가하기 위해 100,000 헬라-S3 세포를 사용 하였다에 실험에 긍정적으로 제어하는​​ 것을들 수있다. 자동화 라이브러리는 낮은 DNA의 양의 준비 라이브러리에 적응 미크로 라이브러리 준비 키트 시약을 사용하여 제조 하였다. 가능하더라도 10,000 미만 세포를 성공적으로 자동화 된 칩 실험을 수행 할 수 있습니다, 아래로 당겨 DNA의 양이 키트 시약을 사용하여 라이브러리를 준비하기에 충분하지 않습니다. 클러스터 생성 및 시퀀싱은 제조자의 지시에 따라 수행 하였다. 생물 정보학은 낮은 세포 수의 칩 샘플에서 시퀀싱 쇼 뛰어난 결과 후 분석한다. 30 페이지의 데이터 세트 (출발 물질의 10,000 대응하는 셀 )는 낮은 소음과 출발 물질의 10 만 셀에 해당하는 300 페이지의 데이터 세트 ()와 외부 참조로 사용 된 ENCODE 프로젝트 브로드 연구소 (Broad Institute)에 의해 생성 된 H3K4me3 데이터 세트 모두 확정 신뢰성이 높은 농축 피크를 포함하고있다. 두 개의 데이터 셋 최고 40 %의 적어도 80 % 오버랩가 비교하면 칩 서열이 재생 가능한 것으로 간주되는 ENCODE ¹¹ 프로젝트에 사용되는 표준 방법을 말한다 상위 40 랩률 데이터를 주목하는 것이 중요하다 유의 점수에 의해 순위가 피크. PG (300) 데이터 셋 (그 피크뿐 아니라 모든 최고 40 %를 고려) 및 브로드 연구소 데이터 (표 1)과 비교할 때 모두 30 PG 데이터 세트가 이러한 기준을 충족. 300 페이지의 데이터 세트는 98 % 최고 40 오버랩 비율 (그림 7)와 브로드 연구소 (Broad Institute)의 데이터와 거의 동일 피크를 보여줍니다.

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세포 10,000 칩 SEQ 실험 7. 칩 분석법도 및 라이브러리 생성 H3K4me3 항체 (/ μL 0.25 μg의)을 사용하여 10,000 내지 100,000 인 HeLa-S3 세포에서 생성 하였다. 35 bp의 태그는 롯데 얼 라이너와 인간 게놈에 매핑되었다. SICER 안정적으로 낮은 세포 수에서뿐만 아니라 세포의 수백만에서 부화를 식별 할 수 호출 이후 피크시. 데이터 집합을 분석하고 서로 브로드 연구소에 의해 생성 기준 데이터와 비교 하​​였다. 낮은 세포 샘플은 일관성이 매우 높은 유사성을 가지고있다. 30 페이지 샘플 충족 ENCODE 기준 ¹¹ (분. 피크의 최고 40 %의 80 %가 중복한다). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1.

토론

순서 다음에 염색질 면역 이제 표준 절차입니다. 여기에 출발 물질의 적은 10,000 세포 염색질 후생 유전 학적 프로파일을 생성 할 수 있습니다 자동화 된 칩 서열 프로토콜이 제공됩니다.

칩과 라이브러리 준비 분석을 자동화하면 칩의 최적화 절차를 표준화하고 실험적인 변동성을 줄일 수 있습니다. 여기에 제시된 액체 처리 시스템은, 시간에 30 분을 손 감소에 칩과 관련된 매뉴얼 절차의 많은을 제거 샘플 손실을 최소화하고, 도서관 입력의 몇 피코 그램으로 정확한 칩 서열을 할 수 있습니다. 성공적인 자동화 칩 SEQ 실험을 달성하기 위해, 또한 각 실험 시스템에서 고품질 전단 염색질 제제 및 칩 SEQ 급 항체를 사용하는 것이 중요하다 자성 비드 기반 기술을 사용하며, 이러한 인큐베이션 같은 메인 실험 매개 변수를 변경할 수있는 유연성을 구비 항체 코트 시간면역 침전 단계 또는 칩 서열 최적화를 위해 필요한 모든 실험을 수행 할 연구원을 허용 세척 조건의 수정 보내고와. 자동화 된 시스템은 각각의 세포주 및 항체 실험 조건의 최적화를 위해 병렬로 여러 시약의 비교를 할 수 있으며 다양한 종류와 염색질의 농도, 다른 항체 및 자기 심지어 다른 종류의 직접 비교를 가능하게하는 "열기"플랫폼입니다 구슬.

자동화 된 시스템의 한계 중 하나는 5 내지 200 μL μL의 범위 권 모든 프로토콜을 자동화의 필요성이다. 그러나,이 자동화 플랫폼 실험의 소형화는 시약의 비용을 절약 할 수 있습니다.

이 연구에 기술 된 프로토콜들 외에도, 시스템은 적응하며 또한 면역 침전과 같은 다른 마그네틱 비드 기반 애플리케이션의 다양한 자동화차 메틸화 된 DNA (MeDIP 및 MethylCap 기술), hydroxylmethylated DNA (hMEDIP), 순차적 인 크로 마틴 면역 (ReChIP), RNA의 면역 (RNA-IP), 중아 변환의 면역 및 DNA 정화 분석의 캡처.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS	Life technologies	14190-094
Trypsin-EDTA	Sigma	T3924-100ML
Formaldehyde 37%	Sigma	F8775-25
1.25 M Glycine Solution	Diagenode	C01020010	Component of the ideal ChIP-seq kit
Lysis Buffer iL1	Diagenode	C01020010	Component of the ideal ChIP-seq kit
Lysis Buffer iL2	Diagenode	C01020010	Component of the ideal ChIP-seq kit
Shearing Buffer iS1	Diagenode	C01020010	Component of the ideal ChIP-seq kit
Protease Inhibitors Mix (200x)	Diagenode	C01010130	Component of the Auto True Micro ChIP kit
HBSS (no calcium, no magnesium, no phenol red)	Life technologies	14175-053
Lysis Buffer tL1	Diagenode	C01010130	Component of the Auto True Micro ChIP kit
ChIP Buffer tC1	Diagenode	C01010130	Component of the Auto True Micro ChIP kit
ideal ChIP-seq kit	Diagneode	C01010051
ChIP-Buffer H	Diagenode	C01010020	Component of the Auto Histone ChIP-seq kit
Auto Histone ChIP-seq kit	Diagenode	C01010020
Auto True Micro ChIP kit	Diagenode	C01010130
H3K79me3 polyclonal antibody-Classic	Diagenode	C15310068
H3K27me3 polyclonal antibody-Classic	Diagenode	C15410069
H3K4me3 polyclonal antibody-Classic	Diagenode	C15410030
H3K4me2 polyclonal antibody-Classic	Diagenode	C15410035
H3K9ac polyclonal antibody-Premium	Diagenode	C15410004
H3K9/14ac polyclonal antibody-Premium	Diagenode	C15410200
H3K36me3 polyclonal antibody-Premium	Diagenode	C15410058
H3K9me3 polyclonal antibody-Premium	Diagenode	C15410193
Rabbit IgG	Diagenode	C15410206
Protein-A coated paramagnetic beads	Diagenode	C01010020
Auto IPure	Diagenode	C03010010
MicroChIP DiaPure columns	Diagenode	C03040001
Universal SyberGreenMaster Mix 1.25 ml	Diagenode	DMMLD2D100
Quant-IT dsDNA	Invitrogen	Q32854
Illumina Sample Preparation kit fro Genomic DNA	Illumina	FC-121-3001
Illumina True-seq kit ChIP library Prep kit	Illumina	IP-202-1012
MicroPlex Library Preparation Kit	Diagenode	C05010010
Agencourt AMPure XP beads	Beckman Coulter	A63881
Illumina Library prep Quantification kit	Kapa Biosystems	KK4844
IP-Star Compact  Automated System	Diagenode	B03000002
Bioruptor Plus	Diagenode	B01020001
Bioruptor Pico	Diagenode	B01060001
Qubit system	Invitrogen	Q32857
Illumina Hiseq systems	Illumina