다낭성 신장 질환의 가능한 제브라 피쉬 모델 :의 넉다운<em&gt; wnt5a</em&gt; Zebrafish의 신장의 낭종 원인

요약

We describe a method of generating a possible zebrafish model of polycystic kidney disease. We used Tg(wt1b:GFP) fish to visualize kidney structure. Knockdown of wnt5a was by morpholino injection. Pronephric cyst formation after wnt5a knockdown was observed in this GFP transgenic zebrafish.

초록

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The molecular mechanisms leading to cyst formation in PKD remain somewhat unclear, but many genes are thought to be involved. Wnt5a is a non-canonical glycoprotein that regulates a wide range of developmental processes. Wnt5a works through the planar cell polarity (PCP) pathway that regulates oriented cell division during renal tubular cell elongation. Defects of the PCP pathway have been found to cause kidney cyst formation. Our paper describes a method for developing a zebrafish cystic kidney disease model by knockdown of the wnt5a gene with wnt5a antisense morpholino (MO) oligonucleotides. Tg(wt1b:GFP) transgenic zebrafish were used to visualize kidney structure and kidney cysts following wnt5a knockdown. Two distinct antisense MOs (AUG - and splice-site) were used and both resulted in curly tail down phenotype and cyst formation after wnt5a knockdown. Injection of mouse Wnt5a mRNA, resistant to the MOs due to a difference in primary base pair structure, rescued the abnormal phenotype, demonstrating that the phenotype was not due to “off-target” effects of the morpholino. This work supports the validity of using a zebrafish model to study wnt5a function in the kidney.

서문

제브라 피쉬 (다니오 레 리오 (rerio)) 배아 신장 널리 개발 다낭성 신장 질환을 연구 모델로서 이용되어왔다. 가지 동물 모델로서 지브라 피쉬를 사용하는 많은 장점 : 유전 결합 연구의 타당성은, 단백질 녹다운 대한 안티센스 morpholinos (MO)를 사용하는 능력은, 기회 신속 배아 다수를 분석하는, 그리고 오르간 표현형을 쉽게 볼 애벌레 ^{한 생활.} pronephros는 척추 동물에서 개발 한 최초의 신장과 애벌레 제브라 피쉬 ^2에서 작동합니다. pronephros 지브라 피쉬의 구조는 포유류 metanephros 비교적 간단한 비교되고, 마지막 세 번째 신장 포유류 개발. 네프론 어려운 네프론 단일 구조를 관찰 할 수있어 네프론 500,000-1,000,000 ^3,4- 약 13,000 네프론 ^(5)를 각각 갖는 마우스 신장 사이 각각 함유 인간 신장과 신장의 작업 단위 In은 인간 또는 마우스 신장. 제브라 피쉬는 두 개의 네프론을 가지고 있으며, 각각의 제브라 피쉬 네프론은 사구체와 생쥐와 인간 ^(6)와 유사한 전문 신장 세포 유형의 세관에있는 모든 주요 구성 요소가 포함되어 있습니다. 이 닫힌 시스템 ^(7)을 가지고 있기 때문에 이러한 제노 같은 다른 척추 동물 모델에 비해, 제브라 피쉬 네프론보다 자세히 포유류 네프론을 닮았다.

최근, 제브라 피쉬 게놈 유전자 툴, 광범위한 돌연변이 자원, 제브라 피쉬 모델에서 트랜스 제닉 리포터 라인 모음 넓은 도입을 허용 서열화되었다. 12-72 시간 포스트 수정 (HPF) 간의 제브라 피쉬의 pronephros 양식은 투명 배아에서 쉽게 시각화 할 수 있습니다. Wilm의 종양 단백질 WT1 신장 개발을위한 필수적인 요소이다. wt1b 프로모터의 Tg의 통제하에 녹색 형광 단백질 (GFP)를 발현하는 형질 전환 제브라 피쉬의 선 (wt1b : GFP) GFP의 expre을 보여ssion는 특히 17 HPF ^(8)에서 시작, 제브라 피쉬 배아에서 pronephric 지역에 위치하고 있습니다. Nephronophthisis (NPHP), 상 염색체 열성 낭성 신장 질환, NPHP 유전자 ^(9)의 돌연변이에 의해 발생합니다. (wt1b : GFP) 모르 폴리 노에 의해 넉다운 NPHP4은의 Tg 낭종 형성 원인이되었다. 물고기를 ¹⁰ 따라서,이 형질 전환 어류 신장 개발하는 동안 신장의 구조와 낭종 형성을 관찰에 적합한 모델입니다. 중요한 것은, 개발 신장의 조절제의 영향은 시간 및 노동 효율적인 방법으로이 균주를 사용하여 조사 할 수있다.

유전자 변조 후 신장 낭종 형성을 시각화하는 모델로 물고기 : 우리의 종이는 Tg가 (GFP wt1b)의 사용에 대해 설명합니다. 우리는 제브라 피쉬의 wnt5a 유전자를 허물고 시작 - 및 스플 라이스 - 사이트 안티센스 수법의 살인을 사용했다. Wnt5a 각종 장기 및 세포 생후의 개발에 중요한 역할이 Wnt 계열의 비정규 분비 된 당 단백질기능 ^11. Wnt5a은 신 세뇨관 신장 동안 지향 세포 분열에 중요한 역할을하는 것으로 확인되었습니다 평면 셀 극성 (PCP) 경로를 포함하여 비정규의 Wnt 경로를 통해 작동합니다. Wnt5a 더함으로써 Vangl2 안정성 ^12을 촉진 VANGL 평면 셀 극성 단백질 2 (Vangl2)와 복합체를 형성함으로써 Wnt5a 시그널링을 transduces 티로신 키나제와 같은 수용체 (RYK)과 복합체를 형성함으로써이 Wnt / PCP 경로를 조절한다. PCP 경로의 결함은 임의의 세포 분열을 초래할 신장 낭종 형성의 원인이 될 수 있습니다. wnt5a 최저 다음 신장 낭종 형성을 관찰하는 제브라 피쉬 라인 : 우리는 Tg가 (GFP wt1b)을 사용했다. Tg는 (wt1b : GFP) 제브라 피쉬 모델은 라이브 이미징 및 신장 구조의 적시 관찰 할 수 있습니다. wnt5a 최저 후, 신장 낭종 형성은 24 HPF에서 시작 발견되었다; 72 HPF에서 낭종은 사구체 근위 세뇨관에서 볼 수 있습니다. 이 방법은 또한 (S)에 사용될 수있다신장 낭종 형성 발생할 수 있습니다 creen 다른 유전자.

프로토콜

참고 : 윤리 선언문 : 모든 제브라 피쉬 실험 동부 버지니아 의과 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.

1. 모르 폴리 노 준비

1. (그림 1A) 제조업체의 지침에 따라 관심의 유전자에 대한 설계 및 합성 번역 차단 ((behavior)을 증대) 및 스플 라이스 억제 (Splice-) 안티센스 모르 폴리 노 (MO) 올리고 뉴클레오티드. 표 1에서 제조업체의 정보를 참조하십시오.
   참고 : 수법의 살인은 유리 병에 동결 건조 된 주식으로 제공됩니다.
2. 25 ㎍ / μL의 최종 농도 수법의 살인을 다시 중단 유리 병에 고급 멸균 물을 추가합니다. 올리고 뉴클레오티드가 완전히 용해되어 있는지 확인합니다. 일부 고체 남아있는 경우, 5 짧게 분 소용돌이 (10)에 65 ° C에서 주식 올리고 뉴클레오티드 솔루션을 포함하는 유리 병을 가열한다.
3. RT에서 MO 주식 솔루션을 저장합니다. 4 ° C 또는 -20 ℃에서 보관하지 마십시오; C 낮은 온도는 MO 올리고 뉴클레오티드가 용기 벽에 바인딩하는 원인이 될 수 있기 때문이다. 분광 광도계를 사용하여 원액의 농도를 측정 새로운 MO의 원액 때마다 (표 1 참조).
4. 원하는 용량에 높은 수준의 멸균 수와 원액을 희석하여 주입 당일 MO 작업 솔루션을 준비합니다. 0.05 %의 농도에 도달하기 위해 0.5 % 페놀 레드를 추가한다. 예를 들어, 15 NG / 거리 nL의 농도와 5 μL 작업 솔루션을 만들기 위해, 3 μL MO 원액 0.5 μL 0.5 % 페놀 - 빨간 물 1.5 μL를 추가.
   참고 :이 작업 농도, 주입의 각 드롭 (500 PL)는 MO의 7.5 NG를 포함하고 두 방울 MO의 15 NG가 포함되어 있습니다.

사출 장치의 제조 2

1. 구매 유리 (자세한 내용은 표 1 참조) 바늘을 미리 뽑아. 대안 적으로, 유리 주사 바늘 WI 당겨바늘 풀러를 토륨.
2. 공기 압축기의 전원을 켜고 50 PSI에 압력 설정을 조정합니다. 해부 현미경 광원과 피코 마이크로 분사 펌프를 켜고 다음과 같이 설정을 조정 : 압력 20 psi의를 개최, 압력 10​​ psi의 게이팅, 2.5 100 마이크로 초 범위의 기간 값을 꺼냅니다.
3. 주입 액 5 μL와 유리에게 미리 뽑아 바늘을 넣고 끝이 아래로 가리키는 수직으로 바늘을 배치합니다. 모든 솔루션은 눈에 보이는 공기 방울 바늘 끝을 도달 할 때까지 기다립니다. 현미경 옆에 적절한 위치에 바늘 홀더를 놓고 홀더에 유리 바늘을 삽입합니다. 45도까지 분사 각도를 조정합니다.
4. 높은 단계 떨어져, 현미경으로보기에 바늘 끝을 가지고, 그리고 팁의 얇은 지역에 초점을 맞추고있다. 좋은 점 핀셋으로 바늘 끝을 끊다.
5. 통치자와 현미경 측 0.15 mm 측의 내경 모세관을 배치;액주 있도록 모세관 튜브의 일단에 용액을 주입. 1mm 길이 액체 열 당 각 17 방울에 도달하는 배출 시간을 조정 한 후 한 방울의 부피는 1 NL 액주의 = π X 반경 ^{2 ×} 길이 (드롭 볼륨 () 방울 / 수 ()입니다.
   주 : 0.1 mm의 직경을 갖는 약 500 드롭 (PL)의 주입량 (방울 부피 = 4/3 X X π 반경 ³⁾ 준다.

Morpholinos 3. 수정란 제브라 피쉬 배아의 준비 및 주입

1. 표준 제브라 피쉬 사육 및 유지 보수에 대해 게시 된 프로토콜에 따라 형질 전환 제브라 피쉬의 번식 쌍 : Tg는 (GFP wt1b)를 설정합니다. 자연 산란 후 배아를 수집하고, E3의 물이 가득 10cm 페트리 접시 (5mM의 염화나트륨, 0.17의 KCl, 0.33 mM의 염화칼슘 _(2), 0.33 mM의 _황산)에 보관하십시오. 바로 ¹³ MO 주입을 시작합니다. 현미경으로 배아 형태를 모니터링하고 있는지 확인 MO 주입은 원 -에있다세포 단계 또는 4 셀 단계 이하 버전 이상이 필요합니다.
   1. 와 10cm 페트리 접시에 배아를 전송 골짜기 한천 쐐기 모양. 여분의 E3 물을 대기음 부드럽게 골짜기로 배아를 누릅니다.
   2. 해부 현미경 1 세포 단계의 배아를 시각화하기 위해 마이크로 피펫으로 배아를 조작 할 수 있습니다. 노른자 (1 방울 = 500 PL)에 MO 중 하나 또는 두 방울을 주입 할 수있는 융모막 노른자를 침투. E3 물 10cm 페트리 접시에 주입 된 배아를 전송하고 28.5 ° C에서 배양한다.
2. 주사 후, 죽은 배아를 제거하고 주입 된 배아의 수를 기록한다. 접시마다 24 ~ 48 시간의 E3 물을 교체합니다.

4. 표현형 구조 실험

1. 구출 용 MO에 내성 때문에, 다른 기본 염기쌍 구조 (일반적으로 3-7 염기쌍 불일치)을 가지고 있으며, 또 다른 종으로부터 orthologue을 선택. 예를 들어,이 실험에서, 우리는 선택한마우스 Wnt5a 마우스의 mRNA 서열은 서열 지브라 피쉬 다르기 때문에.
2. 정방향 프라이머가 번역 사이트와 mRNA의 코딩 영역의 끝 가까이에있는 역 프라이머로 시작하는 프라이머 세트를 디자인합니다. 정방향 프라이머 서열의 5'- 말단에 T7 프로모터 서열을 추가한다. 이 실험에서는 다음의 프라이머를 사용하여 서열; 앞으로 : 5'-TAA 전술 GAC TCA CTA 태그 GGA CTA TGA TGC TGC TGA AGC TGA A-3 '및 역방향 : 5'-TCA CTT GCA GAC GTA CTG gtc- 3'.
3. 상기 설계된 프라이머 세트 (각 프라이머의 0.5 μM)과 다음 PCR 프로그램 마우스 Wnt5a cDNA 서열 함유 0.1 μg의 주형 DNA와 50 μL 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)을 수행 : 5 분 동안 95 ° C에서 1 사이클; 95 ° C (30 초), 58.5 ° C (30 초), 72 ° C (1 분)의 35주기; 최종 확장 단계 7 분 72 ° C에서.
4. t을 마친 후그는주기, 밴드가 적당한 크기인지 확인하기 위해 1 % 아가로 오스 겔에 PCR 제품의 2 μl를 실행합니다. 제조업체의 지시에 따라 PCR 정제 키트와 PCR 생성물을 정제 하였다. 분광 광도계로 DNA 농도를 확인합니다. -20 ℃에서 정제 된 PCR 생성물을 저장하거나, 다음 단계에서 직접 캡핑 RNA 전사에 사용한다.
5. 제조업체의 지시에 따라 캡핑 RNA 합성 키트와 함께 캡핑 된 mRNA를 in vitro에서 합성한다. 20 μL의 RNase없는 물에 희석시키고 mRNA의 농도를 결정한다. -80 ° C에서 RNA 및 저장 나누어지는.
6. 주사 당일의 RNase없는 멸균 수와 mRNA를 작동 용액을 제조 하였다. 40 페이지가 RNA의 비특이적 독성 효과가 발생하지 않는 가장 높은 R​​NA 량은 일반적으로합니다. 얼음에 작업 솔루션을 유지합니다. MO와 배아 다음 구조의 mRNA를 주입하거나 함께 모두 공동 주입. 예를 들면, mRNA의 농도 위해 준비각 주입 단계 4.5 ED는 0.08 ㎍ / μL의 최종 농도를 만들기 위해의 RNase 무료 물 4.33 μL로의 mRNA (0.4 μg의)의 0.67 μl를 추가, 0.6 ㎍ / μL이고, 다음 한 방울 (500 PL)은 40 페이지를 포함 의 mRNA. 3 단계에 설명 된대로 MO를 준비합니다.

형광 이미징 주입 된 배아 5. 준비

1. 28.5 °에서 배양 후 CO / N은, 형광 현미경을 이용 pronephros 구조의 관찰을 melanization 영향을 방지하기 위해 E3 물 0.003 % N-페닐 티오 (PTU)를 추가한다. 그것은 초기 배아 발달에 영향을주기 때문에 그러나, 낭 배기 전에 PTU를 추가하지 않습니다.
2. 48 HPF에서 수동으로 미세 핀셋으로 배아를 d​​echorionate. 빛 해부 현미경으로 48, 72 HPF 배아의 이미지를 가져 가라.
   참고 :이 사진을 마취없이 촬영할 수 있습니다.
3. , 형광 현미경 이미징에 넣어서 배아를 마취 약 10 분 전에160 ㎍ / ㎖의 버퍼 Tricaine을 포함 10cm 페트리 접시. 5 ~ 10 분 동안 기다린 후 가볍게 움직이지 않게 때문에 마취가 작동하는지 확인하기 위해 제브라 피쉬를 터치합니다.
4. 배아가 마취 후 (표 1 참조) 3 % ​​메틸 셀룰로오스를 장착하고는 해부 현미경 하에서 발생하기 쉬운 위치에 방향.
5. 형광 현미경 pronephros 구조를 관찰한다 (표 1 참조) 및 다른 배율 (10 배 및 20 배)에서 사진을 찍을.

결과

Wnt5a 노크 번역 MO 차단을 도입하여 달성되었다 (AUG-MO) 또는 하나의 셀 단계에서 제브라 피쉬 배아에 엑손 / 인트론 경계 스플 라이스 MO (스플 라이스-MO). 월 - MO 따라서, 두 모자 접합체 wnt5a 메시지를 억제, 개시 코돈을 대상으로합니다. MO-접합부는 제 스플 라이스 공여 부위를 표적으로 wnt5a (도 1A)만을 전사 접합체를 억제한다. (behavior)을 증대하고 splice- morphants 곱슬 꼬리?...

토론

다낭성 신장 질환 (PKD)는 인간에서 말기 신장 질환의 주된 원인 중 하나이며, 프로그레시브 낭종 형성, 신장 확대 및 비정상적인 세관 ^(14)에 의해 발전을 특징으로한다. 상 염색체 우성 PKD (ADPKD)은 유전 질환 인 중 하나 PKD1의 돌연변이, polycystin-1 (PC1), 또는 PKD2를 인코딩 polycystin-2 (PC2)를 인코딩, 다낭성 신장의 결과. 다른 많은 유전자, 차 섬모에있는 단백질을 코딩 특히는, 신장 낭종의 개발...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5% Phenol-Red	Sigma	P0290	Color indicator for injection
Morpholino	Genn Tools, LLC	(customized)	Customized designed to the gene of interest
Pre-pulled needle	Tritech Research	MINJ-PP	If large amount of needle is required, you can also purchase a needle puller and prepare the needle in the lab
T7 mMessage Kit	Ambion	1344	For in vitro transcription to make capped mRNA for rescue experiment
N-Phenylthiourea	Sigma	P7629	For prevention of melanization
Tricaine	Sigma	A5040	Also called ethyl 3-aminobenzoate, for zebrafish anesthesia
Methyl Cellulose	Sigma	M-0387	For position of zebrafish
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28104	For purification of PCR product for cap RNA synthesis.
dNTP mix	Promega	U1511	For PCR
Tag DNA Polymerase	Invitrogen	10342-053	For PCR
NanoDrop spectrophotometer	Thermo Scientific	ND-1000	For measure morpholino and RNA concentration
Air Compressor	Werther International, Inc.	Panther Compact 106	Air source for injection
Pico micro-injection pump	World Precision Instruments Inc	PV830 Pnematic PicoPump	Other types of microinjection system can be used.
Micro-manuplator	World Precision Instruments Inc	MMJR	Right-handed (MMJL for left handed)
Needle holder	World Precision Instruments Inc	5430-ALL	To hold needle for micromanipulation
Dumont Tweezers	Fine Surgical Tools	11253-20	For breaking off the needle tip
Dissecting microscope	Leica M205C		For observing and imaging zebrafish embryos
Fluorscence microscope	Zeiss Axio Obserer D1m		For imaging zebrafish pronephros
Capillary tube (I.D. 0.15 mm)	VitroCom	CV1525Q-100	For measure the volume of each injected drop