<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 레이저에 의한 척수 손상 모델은 실시간으로 축삭 변성의 메커니즘을 평가하기 위해

요약

We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.

초록

부상 CNS의 축삭 재생과 자주 떨어져 부상 사이트에서 철회하지 못한다. 초기 부상을 아끼지 축삭 나중에 차 축삭 변성을 거칠 수있다. 척수 내에서 성장 콘 형성, 재생 및 추가 유수 축삭 돌기의 손실의 부족은 크게 손상 후 신경 학적 회복을 제한합니다. 척수의 유수 축삭 부상에 어떻게 반응하는지 중앙 평가하기 위해, 우리의 운명을 문서화하는 노란색 형광 축삭의 단백질과 초점과 재현성이 높은 레이저에 의한 척수 손상을 표현 형질 전환 마우스를 이용한 척수 모델을 살고 생체 개발 두 광자 여기 시간 경과 현미경을 사용하여 축삭과 시간에 수초 (친 유성 형광 염료 나일 레드). 급성 축삭 손상, 축삭 철회하고, 수초 변성 등의 동적 프로세스는 최고의 실시간으로 연구한다. 그러나, 타박상 기반의 부상과 운동 유물의 비 초점 자연 발생고해상도 현미경 도전하여 기본 및 보조 축삭 손상의 반응을 차별화 생체 척수 영상 메이크업 중. 여기에 설명 된 생체 척수 모델은 축삭 부종, 회전 타원체 형성, 축삭 절개, 실시간으로 이러한 역동적 인 과정을 연구하는 유용한 모델을 제공 붓기 근교의 축삭을 포함하여 임상 적으로 관련된 타박상 / 압축에 의한 축삭 병리의 여러 측면을 모방. 이 모델의 주요 장점은 직접 축삭 및 보조 부상 메커니즘을 상해를당한 차 모욕를 구별 할 수 있습니다 우수한 시공간 해상도입니다; 직접 관류 목욕 코드에 시약의 제어 주입; 환경 환경의 정확한 변경 (예를 들어, 칼슘, 나트륨 이온, 축삭 손상에, 거의 불가능에 가까운 영향을 미치는 것으로는 생체 내에서 조작 할 수있는); 그들이 시각화 할 수있는 기회를 제공하고 뮤린 모델로도 이점을 제공하며유전 학적으로 확인 된 세포 집단과 세포 내 구조를 조작 할 수 있습니다. 여기, 우리는 분리하고 이미지가 마우스의 생활 척수 급성 축삭 손상의 역학을 캡처하는 방법에 대해 설명합니다.

서문

축삭의 변성은 신경 외상, 뇌졸중,자가 면역 및 신경 퇴행성 질환 등 여러 가지 신경 학적 조건에 걸친 사망률의 저명한 원인이다. 말초 신경계 (PNS), 중추 신경계와는 달리 (CNS) 축색 돌기는 한 번으로 인해 본질과 비 본질 장벽 (즉, 수초 변성 동안 흉터 형성 동안 생산과 해방 축삭의 성장을 억제 분자) ⁽¹⁾ 모두에 부상을 재생하는 제한된 능력을 가지고 ^-7. 이러한 장벽의 여러 가지가 광범위하게 탐구되었지만, 목표로 치료 개입, CNS 축삭 변성을 방지 강력한 축삭 재생을 촉진하고, 기능 접속 식을 복원, 제한 상태로 유지됩니다.

한 번 자신의 소마 분리 축삭 축삭 부종, 회전 타원체의 형성과 ⁽⁸ 검토) 최종 조각이 특징입니다 Wallerian 변성로 알려진 변성에 박힌 과정을 겪는다. 에반면, 가로로 주변 축삭의 소마와 연속성을 유지 근위 루터 이후의 축삭 재생을위한 중요한 전제 조건이 필요, 그 말에 부종을 형성 다시 Ranvier의 가장 가까운 노드에 사망하고 성장 콘 형성을 시작할 수 있습니다 ^9-11. 반면에, 많은 중앙 축삭의 근위 축삭 엔딩, 특성 "endbulbs"또는 후퇴 전구를 형성 성장 콘을 형성하고, 대신 거리가 부상 ^12-15 후 몇 개월 동안 남아있는 부상 사이트에서 철회하지 못한다. 기본 축삭 손상뿐만 아니라, 추가 축삭 손상 / 손실은 크게 초기 부상에서 겪었던 축삭 발생할 수 있습니다. 처음 아끼지 축삭이 지연 축삭 손실은 보조 축삭 변성이라고한다. 부상 CNS 축삭이 고유 응답 기능 축삭 재생을 뇌와 척수에 달성하기 위해 훨씬 더 어려운 목표를 렌더링합니다.

하,하지만축삭 손상 (예를 들어, 회전 타원체 형성, 후퇴 전구)의 llmarks 잘 사후 조직 및 축삭 변성의 실험 모델에서 특성화되었다, 이러한 동적 프로세스를 기본 분자 메커니즘의 해명이 ​​제한되었습니다. 이러한 연구의 대부분은 본질적으로 시간이 지남에 따라 개별 축삭 반응을 포착하는 데 실패 정적 엔드 포인트 관찰에 의존했다. 비록 외생 축삭 추적자 정적 섹션에서 라이브 영상 중 축삭 반응을 규명하는 데 유용왔다 적용, 유전자 인코딩 된 축삭 마커의 가용성은 형광 현미경을 사용하여 실시간으로 축삭을 시각화하는 능력을 크게 향상했다. 실제로, Kerschensteiner 및 동료 정액 보고서는 먼저 척추의 등 열에서 자신의 전망을 보내 뉴런의 부분 집합에 녹색 형광 단백질을 인코딩 Thy1 -GFP-S 마우스를 사용하여 생체 내에서 축삭 변성 및 재생의 직접적인 증거를 제공코드 ^(16). 라이브 영상은 두 개의 광자 레이저 스캐닝 현미경 (TPLSM)를 사용하여 접근과 관심의 세포의 유전자 형광 단백질 표지는 축삭 변성, ^칼슘 신호, 축삭 재생, 성상 세포 생리학 많은 다양한 동적 프로세스에 직접 증거와 기계적인 통찰력을 제공하고 미세 아교 세포 생리학, 부상 ^{17 ~ 25에} 대한 응답.

축삭 대조적으로, 거의 실시간으로 부상 미엘린 응답의 공지되어있다. 미엘린은 PNS에서 CNS와 슈반 세포에서 희소 돌기 아교 세포에 의해 생산 및 유지 백질의 중요한 구성 요소입니다. 수초는 축삭의 표면의 99 %을 절연하고 그렇게함으로써 최근 Buttermore 등. ^(26)에 의해 검토 신속하고 효율적으로 도약적인 충동 전달을 지원하는 고 저항, 낮은 커패시턴스 보호 커버를 제공한다. 우리가 solvatochromic, 친 유성을 사용하여 부상 수초의 동적 응답을 캡처하려면형광 염료 나일 레드 ^(27). 이 중요한 얼룩의 solvatochromic 속성은 물리 화학적 환경 ^{(28, 29)에} 따라 자사의 발광 스펙트럼의 스펙트럼 변화를 할 수 있습니다. 이러한 속성은 axomyelinic 부상의 메커니즘에 대한 통찰력을 얻을 유용하고 적절하게 선택 dichroics 및 배출 필터를 사용하여 시각 또는 스펙트럼 현미경 ^(27)를 사용하여 해결할 수 있습니다. 예를 들면, 나일 레드의 발광 스펙트럼은 청색 시프트 등의 지방 세포 및 CNS의 정상 미엘린 (발광 피크 ~ 580-590 ㎚) ^{(27)에있는} 것과 같이 덜 극성 지질이 풍부한 환경에서이다. 반면에, ~ 625 nm의 축색 돌기로 형성 endbulbs의에서이 중요한 염료의 발광 스펙트럼의 피크는 축삭 dieback ^(27)를 받아야. 보통 수초 대 endbulbs에 특별히 이러한 스펙트럼 변화의 기초가되는 정확한 메커니즘은 불분명하지만, 이러한 스펙트럼 변화는 단백질의 축적 또는 해체로 이어지는에서 기본 변경을 표시 할 수있다소수성 결합 부위 ^(27)의 노출.

생체 내 이미징 자신의 네이티브 환경에서 척수 축삭 손상 역학을 관찰 궁극적 인 메트릭이 있지만, 기술적으로 도전하고 실질적인 수술 전문 지식을 필요로하고, 자주 (예를 들어, 염증과 흉터를 실험 유물을 소개 할 수있다 등의 열을 노출하는 수술을 반복 형성). 또한, 고가의 장비는 종종 현미경 대물 렌즈 아래 그대로 동​​물의 현탁액 및 위치를 허용하도록 요구된다. 동물은 신중하게 체액이 보충되어 있는지 확인하고, 때문에 장시간 마취 이미징 세션에 저산소증의 징후가 없는지 확인하기 위해, 따뜻한 유지하기 위해뿐만 아니라 모니터링 할 필요가있다. 축삭과 수초가 절대적으로 생존을 유지하기 위해 지속적인 관류하고 적절한 산소 수준을 필요로 후자는 매우 중요하다. 그러나이 종종보고 또는 생체 내 연구에서 대부분의 모니터되지 않습니다날짜. 또한 인한 심박수 및 호흡 운동 아티팩트 (이소 플루 란 성인 마우스를 마취 ~ 분당 300-450 비트 (BPM)을 97~98% 산​​소 포화도 (정상 속도 ~ 632 BPM) 및 유지에 적합하다 ~ 55-65 호흡 분 당 불가피하게 이러한 움직임 될 수 있습니다 각각)) ^(30)는 심지어 가장 빠른 레이저 스캔에 도전 고해상도 형광 현미경을 사용하여 기본 및 보조 축삭 손상의 반응을 차별화 생체 척수 영상 메이크업 중 발생 (정상 속도는 ~ 163 분당 호흡이다) 유물. 웨이크 동물 뮤린 척수의 이미징을 허용 할 수 척추 이식 강성 프레임 윈도우와 결합 공진 초고속 스캐너 진보하지만, 빠른 스캔 시간은 필연적 잡음비 저하 화상 신호 품질을 감소시킨다. 현재와​​ 같은 뇌 영상에 사용되는 척수 이미징 기술의 추가 개선이 많은 장애물을 극복하고 INA에 의해 도입 된 잠재적 인 혼동을 제한 할 수있다dequate 조직 관류, 예를 들어, ^{31 ~ 33.}

백질 생리학과 백질 손상의 메커니즘에 대해 알려진의 대부분은 시험관 또는 시신경, 말초 신경, 척수 백질 ^34-41의 스트립에서 흰색 물질의 체외 준비에 사용하여 결정되었습니다. 이 환경 요인의 변화, 조직 생활에서 약물 및 시약의 제어 응용, 전기 생리학을 사용하여 기능성 평가 및 축삭의 직접 형광 현미경 관찰과 수초를 제어 허용 이러한 준비는 백질 손상 메커니즘에 대한 지식을 사전에 계속. 그러나, 일부 이전 방식은 불가피 밀접하게 반대 축삭의 응답에 영향을 미칠 수 제거 단계에서 표면 축삭 손상 척수 등의 열 스트립 또는 복부 백질 스트립에서 축색 돌기를 관찰한다. 위의 실험 조작에 투자하고는했습니다의 손상을 방지하려면이 코드의 등 측면의 직접 접촉을 방지로 조사중인 공예 섬유, 우리는 생체 자궁 경부 척추 모델을 사용하고 있습니다. 따라서, 피아 교인 인접 표면 등의 열 축색 돌기의 구조는 분리시 실행 가능하고 교란 남아있다.

손상 후 10 + 시간 - 여기에서 우리는 동적으로 최대 8 실시간으로 초점 부상으로 응답으로 중앙 유수 축삭의 직접 시각화 할 수있는 비교적 간단한 방법을 설명합니다. 레이저에 의한 척수 손상 (LiSCI) 모델은 공간적으로 시간이 지남에 제약이 남아 기본 병변 (절제 사이트)와 같은 기본 및 보조 축삭 손상 메커니즘 사이의 차별화를 할 수 있습니다. 오픈 목욕 영상 챔버는 치료 적 개입, 시약 전달, 환경 조작에 액세스 할 수 있습니다. 추정 axomyelinic 보호제 빠르게 조직 프로세스와 관련된 비용과 시간이 소요 실험 대 직접 관찰하여 실시간으로 평가 될 수있다ING 따라서, 면역 염색, 화상 캡쳐 및 분석하여 절편과 살아있는 동물 실험에서 에이전트를 테스트하기 전에 급성 반응과 보호 조작을 평가하는 유용한 대리 모델을 제공한다.

프로토콜

참고 : 모든 동물 절차가 연방 규정을 준수, 루이스 빌 대학의 기관 동물 케어 및 사용위원회가 설정 한 지침에 따라 수행 하였다.

낮은 칼슘 ^{2 +} 2 mM의 ^칼슘 인공 뇌척수액 (ACSF) 1. 준비 관류

1. 표 1에 기재된 바와 같이 2 배 낮은 ^칼슘 (0.1 mM)을 스톡 C 완충액 배 정상 ^칼슘 (2 mM)을 스톡 완충액 및 2 × B 버퍼를 준비한다. 개개의 스톡 솔루션 이온 함량의 수정을 허용 (예를 들어, 낮거나 제로 ^칼슘) 1 개월까지 4 ° C에 저장할 수 있습니다.
2. 해부 동안 심장 내 관류를 들어, 1 배 낮은 칼슘 ^{2 +} ACSF를 만들기 위해 플라스틱 병에 2 배 낮은 칼슘 ^{2 +} 주식 C 100 ㎖와 2 × B 100 ㎖를 추가합니다. 혼합하고 4 ℃에서 하룻밤 저장하거나 신선한합니다.
3. IMAG 동안 생체 척수의 관류ING는 1X ACSF를 생성하도록 한 L 유리 병에 배 정상 ^칼슘 스톡 500 ㎖의 2 × 500 B를 가하여. 혼합하고 실온에서 밤새 저장하거나 신선한합니다.
4. 7.4 ACSF 버퍼의 산도를 조정합니다. 실온에서 ACSF 유지하면서, 얼음에 저 ^칼슘 ACSF을 배치하고 버블 carbogen 가스와 양쪽 모두의 버퍼 (95 % O _2, 5 % CO ₂₎ 30 분 동안 종래는 관류 동안 연속적으로 사용하는.

예 생체 이미징 회의소 2. 준비

1. ACSF 병 주위에 가열 담요합니다 (자동 차단 해제)을 감싸 저 / ​​중간 설정에 열을 조정합니다.
2. 도 1a에 도시 된 바와 같이 바이폴라 온도 제어기 및 피드백 온도 프로브에 의해 제어되어 히터 관류 펌프와 인라인 접속 병에 전용 ACSF 관류 라인을 삽입한다.
3. 2 광자 여기 / conf의 평평한 현미경 단계 삽입 (152 X 102mm)를 연결합니다개 지역 현미경 스테이지는 유출 용기 장착.
4. 대형 오픈 목욕 관류 실을 배치 (가로 x L x 높이 12 X 24 X 8mm) 유출 용기에 (적절한 예는 그림 1B를 참조 수용하고 생체 척수에 신선한 산소 ACSF의 지속적인 흐름을 제공하는 ) 챔버 디자인을 생체 내 영상화.
5. 적절한 배관을 사용하는 생체 촬상 챔버 인라인 히터 금속의 출력 포트를 연결한다. 영상 중에 버퍼 / 조직의 온도를 유지하는 데 도움이 생체 영상 실 아래에 얇은 흡수 패드를 놓습니다.
6. 이동식 스티커 압정을 이용 스필 컨테이너 / 스테이지 인서트의 바닥에 생체 촬상 챔버 접착. 점착성의 끈적 순응성 대물의 광로가 조직 표면에 수직 있도록 필요한 챔버가 조절 될 수 있도록한다. 필요한 경우, 챔버를 조정하는 불스 아이 레벨을 사용한다.
7. 보안챔버 유체 흡입구 근처 인라인 히터 피드백 온도 프로브 및 챔버의 진공 출구 라인에 연결된 스테인리스 흡입관. 자기 테이프와 적절한 마이크로 피펫 홀더는이 점에서 유용하다. 진공 원을 켭니다.
8. 산소 ACSF과 영상 실을 작성 시작 관류 펌프를 켭니다. 분 당 1.5 ml의에 관류 펌프를 설정합니다.
9. 진공 라인을 조정함으로써 촬상 ACSF 챔버의 체적을 제어한다. 이것은 척수 세그먼트를 커버하고 물 찍기 대물과 조직 표면 사이에 충분한 거리를 작동 할 수 있도록 결상 ACSF 챔버 내에 충분히 존재하는 것이 중요하다. 조직 세그먼트가 완전히하는 실험에 의한 아티팩트를 선도하는 신선한 산소 ACSF에 잠겨 있지 않은 경우 수초 및 축삭 해로운 영향을받을 수 있습니다.
10. 촬상하는 관류 챔버 내의 온도가 상온이되도록 인라인 히터 온도 컨트롤러를 조정.

3. 성인 설치류 경부 척수의 해부

1. 복강 내 주사를 통해 마취 펜 토바 비탈 나트륨 (200 ㎎ / ㎏)의 과다 복용을 주입하여 성인 6~10주 된 thy1 -YFP 형질 전환 마우스 (신경절 (dorsal root ganglion)의 신경 세포에 형광 단백질 발현가 사용 적절한 변형)를 안락사.
2. 일단 마취의 적절한 수준 (예를 들어, 발가락 핀치와 깜빡임의 손실에 더 반응), 신중하게 수술 가위와 척수와 뇌를 덮는 피부를 면도하지 미만. 베타 딘 및 70 % 에탄올을 사용하여 패드 피부를 정화.
3. 70 % 에탄올로 가슴 / 복부 영역을 스프레이 한 후 냉장, carbogen - 버블 낮은 칼슘을 사용하여로 transcardially 주제를 관류 ²⁺ ACSF을. (그림 1C 제안 해부 벤치 위에 설정).
4. 간이 다지기 같이 작은 클립을 사용하여 심장 내로 관류 바늘을 고정. 의 면도 등쪽에 액세스 할 주제를 뒤집어제목과는 70 % 에탄올로 면도 영역을 닦습니다.
5. 뇌와 척주 (그림 2A)를 노출 해부 가위를 사용하여 엉덩이에 코에서 시작하여 중간 선을 따라 등의 피부 절개를합니다. 코와 엉덩이에 핀을 배치하여 준비를 고정합니다.
6. 이 지점에서 해부 현미경을 사용하여 단단히 후각 전구의 수준에서 두개골의 등쪽 표면을 가로 질러. 절개의 측면 가장자리에 가위 팁 중 하나를 삽입하고 양측 소뇌까지 skullcap의 가장자리를 따라 잘라.
   참고 :이 해부를 통해 척수에서 상부 조직을 들어 나중에 필요할 때 완전히 skullcap을 절제하지 마십시오 (그림 2B 참조).
7. 뇌를 노출 skullcap를 들어 올립니다. 조심스럽게 (소뇌에 있음) interparietal 뼈의 좌우 가장자리를 잘라 (뇌간 / 척수를 노출 꼬리 쪽 다시 그림 2C를 당겨 ).
8. 테이블 표면에 45도 각도에서 개최 뾰족한 가위를 사용하고 후방 신경근에 좌우 단지 열등 척추를 잘라.
   주 : 밝은 흰색 등의 컬럼과의 접촉을 피하십시오. 이 섬유는 (그림 2D) 이미지를 만들 쉽게 손상 될 수있는 것들이다.
9. 인하 척수를 노출 만들어 짐에 따라 부드럽게 한 조각 위에 놓인 조직을 당겨, 뾰족한 집게와 척주의 skullcap과 등의 표면을 들어 올립니다. 이후 영상 (그림 2E)의 자궁 코드의 1-2 CM 구간을 분리 상부 흉부 수준으로 척추 절단 계속합니다.
10. 열 아래에있는 척추와 맑은 조직에 조직 / 뼈 평행하게 절단 가위를 사용합니다. 가능한 수준으로 이러한 상처를 확인합니다. 그것은 코드가 영상에 대한 수준이되도록 조직 챔버에 평평하게하는 것이 매우 중요합니다.
11. 과거 (뇌 줄기를 가로로 쪼개다하기 # 11 메스를 사용하여날씬한 다발 섬유)과 자궁 경부 척수 세그먼트를 분리하는 상부 흉부 수준에서 종료 () 그림 2 층을 참조하십시오. 이 같은 두 지점에서 조직 / 뼈를 잘라 가위를 사용합니다. 분리 된 조직은 꼬리 뇌간, 자궁 경부 확대, 상부 흉부 척수 (그림 2G)를 포괄하는 척추의 2/3이 포함되어야합니다.
12. carbogen 버블 링, 냉장 낮은 칼슘의 페트리 접시 ²⁺ ACSF에 고립 된 척추를 놓습니다. 필요한 경우는 접시에 평평해질 때까지, 척추 아래에있는 조직을 잘라.
13. 생체 촬상 챔버 격리 척주 옮기고 36 서서히 1 시간에 걸쳐 온도를 증가 관류 - 37 ° C. 이미징 동안이 온도를 유지한다.

나일 레드와 이미징 회의소 미엘린 라벨에 생체 외 척수 4. 배치

1. 조심스럽게 난에 척추를 고정적절한 피팅 슬라이스 maging 실이 아래로 잘 라이크라 스레드로 구성된 수직 그리드 플랫폼을 수정 개최 (;도 3a를 참조 척수를위한 공간을 허용하는 그리드 플랫폼의 중간 스레드를 제거).
2. (DMSO에 5 mM의 재고 및 필터링 0.22 μm의는 4 ° C, 또는 어둠 속에서 -20 ° C에서 6 개월 1 개월 저장 될 수 있습니다) 나일 레드 나누어지는을 녹여. 다만 촬상 챔버에 나일 레드를 첨가하기 전에, 관류 펌프의 유량을 감소시키고 챔버 내의 유체가 항상 척수 커버되도록 진공 라인을 조정한다.
3. 코드 (그림 3B)의 꼬리 끝 부분에서 영상 실에 5 ~ 10 μL 나일 레드 주식 솔루션을 추가합니다. 부드럽게 챔버를 통해 나일 레드를 믹스 1 ML의 피펫을 사용합니다. 나일 레드 후, 1 ~ 2 분 동안 챔버에 머물 다시 진공 라인을 배치하고 지속적으로 척수를 관류하는 분 당 1.5 ml의 관류 펌프를 조정할 수 있습니다.
4. 조심스럽게 현미경 스테이지를 제기수침 목적은 챔버 내의 ACSF의 표면으로부터 약 10mm가 될 때까지 및 척수 분절의 중심과 등쪽 내측 기둥 위에 정렬 대물. 이 부드럽게 ACSF의 표면에 닿을 때까지 천천히 목표를 가지고 현미경 노즈 초점 휠을 사용합니다. 시야 (그림 3C)에 지느러미 열을 집중 epifluorescent 광원을 사용합니다.

TPLSM 및 레이저에 의한 척수 손상과 마우스 척수 5. 생체 외 이미징 (LiSCI)

주 : 후방 정맥 날씬한 다발 섬유와 같은 조직을 중앙에 유용한 마커를 제공가 (후근 신경절 세포 본체에서 발생하고 T6에서 올라 아래 척수의 중간 선을 따라)이 혈관에 평행을 실행합니다. 두꺼운 YFP + 자궁 후근 돌기는 또한 섬유 올라가면 유용한 마커를 제공하고, Y 측 방향으로 하강직경이 작은 FP + 날씬한 다발 섬유.

1. 척수 조직이 적절하게 정렬되면, 레이저 스캐닝 모드로 전환하여 상승 날씬한 유수 섬유 다발의 기준선 촬상을 수행한다. 모두 YFP 나일 레드 (Nile Red)를 여기하기 위해, 형광 발광을 분리하는 950 nm 파장 (~ 25 배, 1.1 NA 대물 렌즈의 출구에서 측정 된 17 Mw)은 적절한 dichroics (DM) 및 대역 통과 필터로 튜닝 이광자 레이저 소스를 사용 형광의 (우리는 노란색 - 오렌지 및 확장 빨강 채널 각각에 YFP, 그리고 나일 레드를 분리, 50분의 525의 DM560, 60분의 600의 DM640 및 70분의 685를 사용).
   1. 축삭의 3 % 이상이 기준 영상 (30 ~ 60 분) 동안 축삭 타원체를 표시하는 경우, 때문에 실험에 의한 유물에 준비를 폐기합니다.
2. 30.3X로 시야를 확대하여 LiSCI을 유도 (~ 20 μm의 직경 절제를 만들 수 있습니다). 조정은 800 nm의 레이저 및 1 ~ 110 메가 와트의 레이저 전력을 증가샘플. 섬유가 완전히 가로로 보장하기보기 레이저 스캔의 5 완전한 필드를 허용합니다.
3. (샘플, 2.08X에서 950 나노 미터, 17 Mw)이 영상 설정으로 레이저 설정을 변경하여 LiSCI을 확인하고 절제를 시각화하는 조직을 검사합니다. 절제의 직경을 확인하고 차 절제 축삭이 완전히 가로로됩니다 (그림 3D 참조). 부상 후 8-10 + 시간까지 부상으로 축삭과 수초의 동적 응답을 기록 Z 캡처와 함께 현미경에 시간 경과 설정을 사용합니다.
   참고 : 절제가 불완전하면 (즉, 섬유의 불완전 절개), 혼동 될 기본 및 보조 부상 메커니즘의 결정으로, 준비를 폐기합니다. 또한, 고립 된 척수 세그먼트는 LiSCI 독립적 인 조직 손상을 완화하기 위해 경증과 24 시간 후 LiSCI까지 이미지화 할 수 있습니다.

결과

적절한 가능성을 격리 유지하기 위해 설정 실험실 및 이미지의 세부 사항은 생체 척수는도 1에 도시된다. 현미경 가변 펄스 펨토초 레이저, 적절한 dicroics 및 배출 필터 및 물 구비해야 높은 개구 수 대물 렌즈를 침지 (≥1.0). 해부시 척수의 생존을 보장하기 위해, 과정은 절연 축삭 멤브레인 ^42을 밀봉 할 ²⁺ 충분한 칼슘을 허용 냉장 산소화 둘러 ACSF ^칼슘의

토론

우리는 표면의 영상 생체 척수 유수 축삭 (즉, 날씬한 다발)은 시간이지나면서 모두 기본 및 보조 유수 축삭 변성의 동적 진행을 연구하기 위해 레이저에 의한 척수 손상과 함께. 생체 내 이미징 방법을 설명 척수 모션 아티팩트 및 장시간 촬상 세션 동안 실험자 저산소증 유발 전위 생체 이미징과 관련된 합병증의 많은 것을 극복한다. 이 프로토콜은 산소 관류 낮은 칼?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Large bath chamber with slice supports	Warner Instruments	RC-27L	For ex vivo imaging chamber
Standard Slice Supports	Warner Instruments	SS-3	For ex vivo imaging chamber
Plastic Slice hold-down for RC-27L and RC-29 chambers	Warner Instruments	SHD-27LP/10	For ex vivo imaging chamber
Suction Tube, Series 20 Classic Design, left handed	Warner Instruments	ST-1L	For ex vivo imaging chamber
Solution In-line heater/cooler	Warner Instruments	SC-20	To regulate perfusate temperature during imaging
Bipolar temperature controller	Warner Instruments	CL-100	To regulate perfusate temperature during imaging
Liquid Cooling System	Warner Instruments	LCS-1	To regulate perfusate temperature during imaging
Cable assembly for heater controllers	Warner Instruments	CC-28	To regulate perfusate temperature during imaging
Replacement bead thermisitor for CC-28 cable	Warner Instruments	TS-70B	To regulate perfusate temperature during imaging
Magnetic holder with suction tubing	Bioscience Tools	MTH-S	To hold the stainless steel vacuum suction tubing
Adjustable holder	Bioscience Tools	MTH	To hold the temperature probe
clear silicone sealant			For ex vivo imaging chamber
superglue			For ex vivo imaging chamber
thin plexiglass strips			For ex vivo imaging chamber
nile red	Life Technologies	N-1142	For labeling myelin