인간과 마우스의 뇌실 주위 조직의 측면 심실 및 조직 학적 특성의 3D 모델링

요약

Using MRI scans (human), 3D imaging software, and immunohistological analysis, we document changes to the brain’s lateral ventricles. Longitudinal 3D mapping of lateral ventricle volume changes and characterization of periventricular cellular changes that occur in the human brain due to aging or disease are then modeled in mice.

초록

The ventricular system carries and circulates cerebral spinal fluid (CSF) and facilitates clearance of solutes and toxins from the brain. The functional units of the ventricles are ciliated epithelial cells termed ependymal cells, which line the ventricles and through ciliary action are capable of generating laminar flow of CSF at the ventricle surface. This monolayer of ependymal cells also provides barrier and filtration functions that promote exchange between brain interstitial fluids (ISF) and circulating CSF. Biochemical changes in the brain are thereby reflected in the composition of the CSF and destruction of the ependyma can disrupt the delicate balance of CSF and ISF exchange. In humans there is a strong correlation between lateral ventricle expansion and aging. Age-associated ventriculomegaly can occur even in the absence of dementia or obstruction of CSF flow. The exact cause and progression of ventriculomegaly is often unknown; however, enlarged ventricles can show regional and, often, extensive loss of ependymal cell coverage with ventricle surface astrogliosis and associated periventricular edema replacing the functional ependymal cell monolayer. Using MRI scans together with postmortem human brain tissue, we describe how to prepare, image and compile 3D renderings of lateral ventricle volumes, calculate lateral ventricle volumes, and characterize periventricular tissue through immunohistochemical analysis of en face lateral ventricle wall tissue preparations. Corresponding analyses of mouse brain tissue are also presented supporting the use of mouse models as a means to evaluate changes to the lateral ventricles and periventricular tissue found in human aging and disease. Together, these protocols allow investigations into the cause and effect of ventriculomegaly and highlight techniques to study ventricular system health and its important barrier and filtration functions within the brain.

서문

뇌실막 세포 단층 선 뇌척수액 (CSF) 및 격자 간 유체 (ISF) ^1-3 간의 양방향 장벽 및 전송 기능을 제공하는 뇌의 심실 시스템. 이러한 기능은 뇌가 독성이없는 생리적 균형 ^2,3에서 유지하는 데 도움이됩니다. 부상 또는 질병을 통해이 안감의 일부의 인간 손실에서 다른 상피 라이닝에서 발견 회생 교체에 결과에 표시되지 않습니다; 오히려 뇌실막 셀 커버리지의 손실은 심실 표면에서 뇌실막 세포의 무 결함 영역을 커버하는 성상 세포의 메쉬 작업과 뇌실 주위 백질 as​​trogliosis 될 것으로 보인다. 중요한 CSF / ISF 교환 및 통관 메커니즘에 심각한 영향이 상피 층 ^1,2,4-7의 손실이 발생할 것으로 예상된다.

인간의 노화의 일반적인 기능은 측면 심실 (뇌실) 및 observ 등 관련 뇌실 주위 부종을 확대MRI 및 유체 감쇠 반전 회복 자기 공명 영상 (MRI / FLAIR) ^8-14에 의해 에드. 뇌실과 심실 라이닝의 세포 조직 사이의 관계를 조사하기 위해, 사후 인간의 자기 공명 영상 시퀀스는 측면 뇌실 뇌실 주위 조직의 조직 학적 제제와 일치했다. 뇌실 가지 경우에서, 신경교 증의 실질적인 영역은 측면 뇌실 벽을 따라 뇌실막 세포 커버리지를 교체했다. 뇌실 확장이 자기 공명 영상 기반 볼륨 분석에 의해 감지되지 않은 경우, 뇌실막 세포 안감은 그대로이고 신경교 증은 심실 라이닝 ^(6)에 따라 검출되지 않았다. 이 조합 방식은 부분의 wholemount 준비 또는 전체 측면 뇌실 벽과 심실 볼륨 ^(6)의 3D 모델링을 사용하여 측면 뇌실 내벽의 세포 무결성의 첫 번째 포괄적 인 문서 자세히 변경을 나타냅니다. 여러 질환 (알츠하이머 병, 정신 분열증)과 부상 (외상성 뇌 손상)초기 신경 병리학 적 기능으로 뇌실을 보여줍니다. 이에 뇌실막 세포 라이닝의 지역의 삭박 정상 뇌실막 세포 기능을 방해하고 CSF / ISF 유체 및 용질 교환 사이의 항상성 균형을 손상 할 것으로 예상된다. 따라서, 기본 또는 이웃 뇌 구조에 심실 시스템, 그것의 세포 구성하고, 결과에 대한 변경 사항에 대해 더욱 철저한 검사는 궁극적으로 뇌실의 확대와 관련된 신경 병리학에 대한 자세한 내용을 공개하기 시작합니다.

함께 학적 조직 샘플에 대응하는 액세스가 제한된 조영 데이터의 부족, 특히 길이 데이터 시퀀스에서, 인간의 뇌 병리 분석 어렵게 만든다. 인간의 노화 또는 질병에있는 모델링 표현형은 종종 마우스 모델을 달성 할 수있는 동물 모델은 인간의 질병 개시 및 진행에 대한 질문을 탐구하기 위해 최선의 방법 중 하나가. 의 여러 연구건강한 젊은 마우스는 좌우 심실 벽의 cytoarchitecture 및 기본 줄기 세포 틈새 ^4,7-15을 설명했다. 이들 연구는 ^{-6,15- 노화} 통해 좌심실 벽의 3D 모델링 및 세포 분석을 포함하도록 확장되어왔다. 마우스는 비교적 강력한 subventicular 영역 (SVZ) ^{-6,15- 라이닝} 그대로 뇌실막 세포에 세포 틈새 바로 아래 줄기 표시 오히려 뇌실 주위 백질 신경교 증이나 뇌실 어느 쪽도, 세 생쥐에서 관찰된다. 따라서, 타격 종 특이 차이 ^{-6,15- 노화} 과정에서 일반적인 관리 및 뇌실 라이닝의 무결성에 모두 존재한다. 따라서, 인간에서 발견 조건을 심문하는 것이 가장 사용 마우스로 두 종 사이의 차이가 특징으로 적절 어떤 모델링 패러다임에서 고려 될 필요가있다. 여기, 우리는 모두 인간과 M의 측면 심실에 길이 변화와 관련된 뇌실 주위 조직을 평가하는 절차를 제시여러개. 우리의 절차는 세포의 조직과 구조 모두의 특성을 3D 렌더링 및 마우스와 인간의 심실 모두의 용적 측정, 및 뇌실 주위 조직의 전체 마운트 준비의 면역 조직 화학 분석의 사용을 포함한다. 이러한 절차는 함께 심실 시스템의 변화와 연관된 뇌실 조직을 특성화하는 수단을 제공한다.

프로토콜

참고 : 동물 절차 IACUC 코네티컷 대학의 승인을 NIH의 지침을 준수 하였다. 인간의 조직 및 데이터 분석 및 절차를 준수했고, 코네티컷 IRB 대학의 승인을 NIH 가이드 라인을 준수합니다.

1. 마우스 : 뇌실의 뇌실 주위 세포 무결성 및 3D 모델링 분석

마우스 뇌실 벽 전체 마운트 1.1) 준비

1. 면역 조직 화학 (IHC)에 대한 마우스 측면 뇌실 전체 마운트 준비는 이전에 ^{16, 17을} 설명했다.

측면 뇌실 분석을위한 1.2) 면역 조직 화학

1. 이전 ^{18, 19 설명} 된대로 수정하고 섹션 마우스 뇌 조직.
   1. 기관은 (옅은 채색으로 표시) 삭제 될 때까지 간단히로 transcardially 정상과 같은 높이 마우스는 실온 식염수, 실온 4 % 파라 포름 알데히드 다음조직까지 0.1 M 인산염 완충 생리 식염수에 (PFA) (PBS)를 보강했다.
   2. 두개골에서 뇌를 제거합니다. 시상 봉합 따라 두개골의 기지에서 잘라 홍채 해부 가위를 사용합니다.
   3. 두개골을 노출하고 집게로 머리를 제거합니다. 밤새 4 ℃에서 4 % PFA 정착액의 뇌를 담가. 그 후 PBS로 20 분 동안 3 회 반복한다.
2. 면역 조직 화학 및 볼륨 분석을위한 시리얼 섹션을 준비합니다.
   1. 미세 수술 메스를 사용하여, 플로팅 부분을 면역 염색시 우반구에서 좌반구의 식별을 허용하도록 세로 좌반구의 피질 따라 작은 절개를.
   2. vibratome 단면 동안 추가 구조 지원을 위해 3 % 아가로 오스의 머리를 고정 싸는. 증류수에서 따뜻한 3 % 아가로 오스는 (W / V)까지는 완전히 마이크로파 또는 핫 플레이트를 사용하여 용해시켰다.
   3. 면도날로,와 소뇌의 뇌의 꼬리 부분을 제거평평하고 심지어 표면을 떠나 관상 컷. 조직 단계에 강력 접착제를 적용하고 위로 향 후각 전구에 새로 절단 표면에 두뇌를 놓습니다.
   4. 액체 아가로 오스 용액이 닿지 그냥 따뜻한 온도로 냉각되면, 완전히 뇌 전체를 싸는 뇌에 균일하게 적용됩니다. 아가로 오스가 응고하도록 허용합니다.
   5. 아가 로스 부분은 순차 순서를 유지하기 위해 PBS를 함유하는 24- 웰 플레이트로 순차적으로 배치 된 부분과, 50 ㎛의 섹션으로 vibratome coronally 뇌에 쌌다.
      참고 : 일반적으로 12 우물이 잘 A1로 시작하는 측면 심실의 출현을보고 B6을 통해 수치 적으로 이동하고 다시 A1에 순환에 앞서 5 절을 시작하는 조직의 모음으로, 하나의 뇌에 사용됩니다. 이 같은 뇌의 여러 부분으로 구별이 동일한 웰 내에서 처리 할 수​​있다. 뇌실 부피 분석을 위해, 조직 수집이 중단 될 때를 뇌실의 잘 당 약 3 절 36 절 총의 결과로 제 3 뇌실 병합.
   6. 부동 섹션 실수로 흡입되지 않도록 20 ~ 200 μL 마이크로 피펫 팁이 부착 된 전송 피펫을 사용하여 PBS를 대기음. 블록 10 % 혈청 부유 섹션 Permeabilize 하시려면, 0.1 %, 실온에서 1 시간 동안 PBS에 트리톤 X-100 (TX) (PBS-TX). 24 웰 플레이트에없는 부동 조직 섹션을 포함하고 흔들 접시에 섹션의 모든 배양을 수행하기 위해 잘 당 용액 300 μl를 사용합니다.
   7. 차단 솔루션을 대기음, 4 ℃에서 PBS-TX 하룻밤 (최소 12 시간)에서 일차 항체와 섹션을 품어. 관상 섹션을 사용하여 뇌실 볼륨 추적의 경우, 뇌실막 세포에 라벨을 방지 S100β 항체를 사용합니다.
   8. 대기음 차 항체 용액과 함께 PBS-TX 부 10 분 동안 3 회 씻는다.
   9. 객실 템페라에서 1 시간 동안 어둠 속에서 섹션을 품어1의 농도로, 형광 이차 항체와 진짜야 : 1,000 10 % 혈청, PBS-TX를. 나머지 모든 인큐베이션 단계를 어둠 속에서 섹션을 유지합니다.
   10. 대기음 차 항체 용액과 5 분 세포 핵을 Counterstain과위한 PBS 4 ', 6-diamidino -2- 페닐 인돌 (DAPI, 10 μg의 / ml)로 배양 섹션. DAPI 솔루션을 기음과 PBS로 섹션을 10 분 동안 3 회 씻어.
   11. 대뇌 피질의 마크를 사용하여 슬라이드 위에 직렬 마운트 섹션은 오른쪽 반구 방향에 비해 왼쪽 유지하려면. 부드럽게 슬라이드에 장착 미디어의 얇은 층을 적용에 의해 어두운 다음 coverslip에 공기 건조 섹션 상단에 유리 커버 슬립을 배치합니다. coverslipped 슬라이드는 실온에서 하룻밤 건조하도록 허용합니다.

3D 재건 1.3) 측면 뇌실 분할

참고 : 수직 표면 형광 microsco에 매핑 소프트웨어를 사용하여 측면 심실의 추적을 수행자동 스테이지 및 형광 검출을위한 디지털 CCD 카메라로 퍼가기.

1. 형광 현미경 장비의 전원을 켜고 형광 모드에서 매핑 소프트웨어를 실행합니다. 열기 '표시 옵션은'추적에 필요한 적절한 도구 모음 및 도킹 도구 패널을로드합니다. 옵션> 표시 옵션> 액세서리 및 '홈페이지'와 '마커'도구 모음을 선택합니다. 같은 메뉴에서 '카메라 히스토그램', '멀티 채널 제어', '카메라 설정', 이하 '이미지 인식'선택 '도킹 도구 패널을.'
2. 측면 뇌실 라인 뇌실막 세포 레이블 강한 S-100β 형광에 기초하여 심실의 시작을 관찰한다. 측면 심실을 포함하는 조직의 첫 번째 부분을 확인합니다.
3. 새로운 데이터 파일을 만들고 왼쪽 측면 뇌실 위의 이미지 창에서 클릭하여 단계 운동에 대한 기준점을 지정합니다. 작은을 찾습니다절개 오른쪽 반구에서 왼쪽 방향을. 시리얼 재건에 대한 윤곽을 가져올 때 도움이 파일을 추적을 통해 측면 심실에 일관된 상대적인 위치에 기준점을 유지합니다.
4. 예를 들어, 드롭 다운 메뉴 형상으로부터 적절한 사전 윤곽 유형을 선택 '왼쪽 측면 뇌실.' 왼쪽과 오른쪽 측면 뇌실 트레이싱 각각의 고유 한 색상을 사용합니다. 윤곽 이름과 색상의 변화가 필요한 경우, '윤곽 유형을 추가'후 윤곽 색상의 이름을 수정하거나 선택한 옵션> 디스플레이 환경 설정> 윤곽로 이동합니다.
5. '왼쪽 뇌실'윤곽이 선택으로, 추적 윤곽을 시작 뇌실막 라이닝의 혀끝의 표면을 따라 클릭합니다. 혀끝의 표면을 따라 연속적으로 클릭하여 계속하여 심실을 추적합니다.
   1. 더 기교를 요구하는 불규칙한 지역을 클릭하고 무료 손을 추적하기 위해 마우스 왼쪽 버튼을 누르고 있습니다. Ctrl 키를 누르면 + Z, 또는 이동 TO 옵션> 이전 윤곽 ​​점을 취소 취소합니다. 화살표 키를 사용하여 추적 창을 이동 또는 형상이 화면을 가리 만들고 윈도우가 자동으로 중앙에 있도록함으로써. 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭을 추적 뇌실을 완료하고 '형상 닫기'를 선택합니다.
6. 드롭 다운 메뉴를 사용하여 오른쪽 측면 뇌실을위한 새로운 윤곽 색상 (윤곽 유형)을 선택합니다. 왼쪽위한 단계 1.3.4과 우심실을 추적합니다.
7. 윤곽 이름과 색상의 변화가 필요한 경우, 오른쪽 윤곽을 클릭하고 적절한 색상을 선택 변경 윤곽 유형을 선택합니다.
8. 3 차원 복원을위한 일련의 윤곽을 정렬에 도움이 중간 선을 따라 마커를 추가합니다. 마커를 추가하려면 왼쪽에있는 마커 도구 모음에서 해당 마커를 ( 'X'를 사용)를 선택하고 추적 화면에 드롭합니다. 각 조직 섹션 추적의 윤곽과 함께 가져 오기 마커.
9. > 저장을 조직 추적, [파일을 저장하려면같은 데이터 파일 및 새 폴더와 파일 이름을 만듭니다. 수의 추적 [슬라이드 #] - [조직 #] 시리얼 섹션에서 흔적을 쉽게 식별. 예를 들어, 제 2 번째 슬라이드 조직 절편 각 뇌 디렉토리 내의 파일 이름 '2-3'을 갖는다.
10. 반복 심실 벽 부착 지역을 제외하고, 전체 뇌를 통해 심실을 추적하기 위해 뇌 조직의 각 시리얼 섹션 1.3.9에 1.3.4 단계를 반복합니다.
11. 심실 접착 부위에 그 지느러미 및 복부에서의 밀착성, 서브 - 세그먼트의 전방 영역의 영역이있는 경우. 각각의 심실 (예를 들어, '지느러미 좌심실'과 '복부 좌심실')에 대한 두 가지 새로운 형상 유형을 만듭니다. 접착 최초의 조직 슬라이스에서 완전한 심실 재구성이 생성 될 수 있도록 원래의 측면 뇌실의 윤곽과 새로운 지느러미와 복부 윤곽 모두 측면 뇌실을 추적.
12. 절에서는 ventricl에 후부E 벽 밀착성 각각 심실 (예를 들어, '후방 좌심실')의 후방 부에 대한 새로운 윤곽 색의 세트를 생성한다. 현재 접착 및 새로운 후방 윤곽 유형 모두이 첫 번째 재 합류 섹션을 두 번 추적.

1.4) 뇌실 3D 재건

1. 정렬 및 3D 재구성 및 체적 데이터를 생성 할 수있는 마우스 측면 심실의 시리얼 윤곽 트레이싱을 컴파일합니다.
2. 열기 3D 재건 프로그램. [파일]> [열기]를 클릭하고 첫 번째 추적 시리얼 부분의 윤곽 파일을 선택합니다. 왼쪽과 오른쪽 심실의 윤곽 트레이싱뿐만 아니라 추가 마커를 가져옵니다.
3. 윤곽선을 선택하려면, '개체 선택'버튼 (커서 아이콘)을 클릭하고 'Ctrl'키를 잡고 두 심실과 마커를 선택합니다. 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고, 윤곽의 Z 위치를 설정하려면 'Z 위치를 수정합니다'. 0 μm의 최초의 조직 절편을 설정합니다.
<리> 재건으로, 파일> 저장 데이터 파일을 저장합니다. 실수가 이루어진 경우 복구가 다시로드 이전 파일로 쉽게 있도록, 모든 파일 가져 오기 후 저장합니다.
4. 재건에 다음 조직 슬라이스를 추가하려면 디스플레이에 추가> 파일을 클릭합니다. 추가 할 .DAT 파일을 선택하고 '병합'상자를 선택합니다.
5. 다시 새로 가져온 추적 파일의 Z 위치를 조정하는 단계 1.4.3을 따르십시오. 다른 흔적을 이동 피하기 위해 메인 윈도우 만 새로 추가 된 왼쪽과 오른쪽 윤곽을 선택합니다. 50 μm의 섹션에 대해 이전 형상의 Z 위치에서 50 μm의 각각의 연속적인 추적 파일을 설정합니다. (첫 번째 윤곽 : Z = 0, 두 번째 윤곽 : Z = 50, 세 번째 윤곽 : 등 Z = 100)
6. , X, 선택 윤곽 및 마커의 Y 위치를 조정하려면 버튼을 클릭 '마우스로 번역을 사용'이전 조직의 윤곽과 정렬 윤곽을 드래그합니다. 계속 모두 현재 추적의 좌우 윤곽 선택된동기식 이동을 허용합니다.
7. 흔적은 중간 선 마커를 줄을 시계 방향 또는 시계 반대 방향으로 회전하려면, 'Z 축 회전'버튼을 선택합니다. , 마우스 오른쪽 버튼을 클릭, 수입 윤곽 및 마커 모두 선택 '설정 회전 각도'를 선택하고 'Y 회전'로 '180'를 입력 (왼쪽 윤곽이 오른쪽에있는 경우) Y 축에서 윤곽을 플립합니다.
8. 심실과 중간 선 마커 가장 단계 1.4.4에서와 같이, 재건 파일을 저장하기 전에 정렬되어 있는지 확인하십시오.
9. 반복 단계 이후의 각 조직 슬라이스 1.4.9에 1.4.5 모든 수입과 제대로 정렬 될 때까지.
10. 직렬 재건의 볼륨 데이터를 보려면, 분석> '마커 및 지역 분석'을 클릭하고 '3D 윤곽 개요'를 선택합니다. 왼쪽 패널에서 모든 윤곽을 선택하고 최종 3 차원 복원을 표시합니다 '3D 시각화'버튼을 클릭합니다.

2. 인간 : 뇌실의 뇌실 주위 세포 무결성 및 3D 모델링 분석

2.1) 인간 MRI 데이터 분석

참고 : 프로토콜은 3D 이미지 복원 및 측면 심실의 체적 정량을 만들고 길이 방향 오버레이 분석을 사용하여 시간에 따른 부피 변화를 평가하기 위해 나열되어 있습니다. 이는 데이터의 포함은 ²⁰ 세트에 대해 매우 중요한 기준이다 MR 데이터 수집 (예를 들어, 컴퓨터와 자석 강도, 단면 두께, 방향 및 해상도) 및 사후 - 취득 처리에 해당 일관성을 주목하는 것이 중요하다.

1. 심실 분할
   참고 : ITK / 스냅 고해상도 T1 강조 자기 공명 영상에서 세그먼트에 심실 사용된다. 대안 적으로, 다른 Freesurfer 프리웨어 소프트웨어가 사용될 수있다.
   1. 열기 ITK / 스냅, 파일> 열기를 그레이 스케일 이미지. .nii 파일 (NITFI 파일) 원하는 파일 열기를 선택합니다.
   2. 각 아낫 스크롤omical 비행기, 지적 심실 이상 (협착 지역, 크고 작은 시간 뿔 등). 기본 도구 상자에서 '뱀 투자 수익 (ROI) 도구'를 클릭합니다. '세그먼트 3D'를 클릭하십시오. '강도 지역'옵션을 선택합니다.
   3. '사전 프로세스 이미지'를 클릭하십시오. 흰색에 투자 수익 (ROI)을 강조하기 위해 특정 강도 임계 값 아래 영역을 포함하는, '위'를 선택합니다. 슬라이드 막대를 사용하여 최대 강도를 기록합니다. 최대 강도 (기록이 값)의 15 % 임계 값을 설정합니다. '확인'을 10 클릭 한 다음 '다음'에 부드러움 매개 변수를 설정합니다.
   4. 각각의 심실에 10-12 작은 (크기 2) '거품'을 추가 : 두 전방 정면 경적에, 일곱 측면 뇌실 본체, 후두 뿔에 하나의 시간 뿔 하나의 우수한 표면을 따라 균등하게 간격 측면 뇌실. 및 설정 곡률 힘 0.4 '매개 변수 선택'을. 활성 윤곽 진화를 시작하려면 재생 기호를 클릭.
   5. 표면을 시각화 '업데이트 메쉬'를 클릭; '자동 업데이트'를 선택합니다. 측면 뇌실의 모든 분야가 관심 (ROI)의 영역에 포함되는 경우 분할을 중지합니다. 제 3 뇌실의 포함을 피하십시오. '마침'을 클릭합니다.
   6. 다음과 같은 방법으로 원하지 않는 영역을 제거하기 위해 필요한 경우 수동으로 이미지를 편집 (일반적으로 제 3 뇌실의 누설을 삭제해야합니다). 수동으로 여분의 영역을 제거하거나 수동으로 투자 수익 (ROI)을 넘어 모든 포함을 삭제 활성 도면의 레이블로 '클리어 라벨'와 '그림판'도구를 사용하는 '3D 메스'도구를 사용합니다.
   7. .nii 이미지로 분할 결과 ( 'NIFTI'파일 형식)을 저장합니다.
   8. 총 뇌실 볼륨을 얻으려면, '분할> 볼륨'및 통계를 선택; 색상 설정 라벨을 이용하여 심실의 총량을 얻었다.
2. MRIScans에서 측면 심실의 종 대표
   참고 : 사용망고 소프트웨어는, 길이 방향의 ROI는 질적 및 양적으로 시간이 지남에 따라 과목 내에서 뇌실 용적의 변화를 보여 중첩된다.
   1. 열기 망고. 녹색으로 최초의 투자 수익 (ROI) 시점 (기준)의 파일>로드 투자 수익 (ROI)을 클릭합니다. 파일> RED로 두 번째 투자 수익 (ROI) 시점의 부하 투자 수익 (ROI). 파일을 선택하여 종 오버레이를 저장>으로 저장; '- [두 번째 포인트 시대] .nii 파일 name_ [처음으로 포인트 시대]'등 각각의 이미지를 지정합니다.
   2. ITK-SNAP를 엽니 다. 이미지> 결합 된 투자 수익 (ROI) 파일의 분할>로드를 선택하여, '그레이 스케일 이미지'와 함께 투자 수익 (ROI)을 다시 엽니 다. 세로 볼륨 데이터는 다음과 같은 실행 얻으려면 : 분할> 볼륨 및 통계> 레이블 1 (빨간색은) 확장 볼륨을 =; 라벨 2 (녹색) 협착증 = 부피; 라벨 3 (파란색) = 기본 볼륨.

2.2) 인간의 뇌실 주위 조직 준비 및 분석

1. 인체 조직 작업에 대한 안전 지침
   1. approp를 구합니다riate 안전 교육 (예., 혈액 매개 병원균 과정).
   2. 표준 (보편적 인) 안전주의 사항을 준수하십시오. 장갑을 착용 할 것. 일회용되지 않은 공통 장비 또는 표면을 만지기 전에 장갑을 변경합니다. '인체 조직 사용'명칭과 인체 조직과 작업 할 때 일상적으로 취급 된 항목을 레이블.
   3. 인체 조직과 접촉하는 모든 항목에 대한 오염 제거 방법을 따르십시오. 사전 처분에 24 시간의 최소 오염 된 액체 표백제 표백제 적신 수건 (예를 들어, 벤치 위) 또는 (예 : 집게) 표백제에 직접 객체를 배치하여 오염 된 표면을 처리합니다.
   4. 표백제에 종이 타월을 몸을 담글과 영향을받는 지역 (5 ~ 10 분)에 들고 포함 할 수있다 직접 피부에 인체 조직과 접촉하기위한 비상 계획을 준비합니다.
   5. 인체 조직과 접촉하는 모든 항목에 대한 적절한 폐기를 사​​용합니다.
2. 뇌실 전체 마운트 준비
   1. (B)그대로 반구와 eginning 큰 칼을 사용하여 전체 반구를 통해 1.5 cm 두께의 관상 부분을 슬라이스 (10 % 포르말린에 고정 0.1 M PBS로 철저하게 세척).
      참고 : 모든 고정 프로토콜 전에 항체 확인이 필요합니다.
   2. 라벨 섹션은 전면 측면 뇌실을 포함하는 첫 번째 섹션으로 시작하는 백업한다. 번호 (위에서 아래로)와 문자 (전방 후부하는) 및 항을 조각 라벨, 알파 숫자 라벨링 시스템을 사용합니다. 뇌실막 표면을 방해하지 마십시오.
   3. 미세 수술 메스를 사용하여, 전체 측벽에 대한 하나의 연속 섹션을 유지, 1cm 깊이 심실 벽을 해부하다. 잘 염색에 대한 적절한 크기의 섹션을 만들 필요에 따라 벽을 분할합니다. 심실 벽의 반대측에 절 결부 우수 / 열등 방향의 동정을 행 하였다.
   4. 이중 주입기를 사용하여 10 내지 20 분 동안 100 ° C에서 10 mM 시트르산 나트륨 완충액 (pH 6.0)으로 조직 절편을 배양하여 항원 검색을 수행R (최적의 배양 시간은 경험적으로 결정된다). PBS / 0.1 % 트리톤 X-100 (TX-PBS)로 3 회 헹군다.
   5. 실온에서 1 시간 동안 PBS / PBS-TX를 사용하여 10 %의 말 혈청 블록.
   6. 4 ℃에서 48 시간 동안 일차 항체에 품어. 다음 항체 조합 전체 마운트 발현 사이, 심실 벽의 안감을 시각화 : 마우스 항 - β-catenin의 (1 : 250); 염소 항 GFAP (1 : 250); 토끼 항 AQP4 (1 : 400).
   7. 어둠 속에서 모든 후속 단계를 수행합니다. 이차 항체 (1 : 500)와 함께 배양, 조직을 PBS에서 3 회 헹구 4 ° C에서 24 시간 또는 실온에서 2 시간 동안, 및 다른 PBS로 3 회 헹군다. 실온에서 7 분 동안 DAPI에서 조직을 품어은 PBS의 다른 3 린스로 하였다.
   8. 파라 필름과 왁스 바닥 접시를 덮어 최종 해부를위한 조직을 준비합니다. 미세 집게를 사용하여 접시에 조직을 배치 뇌실막 벽과의 접촉을 피하고, PBS로 접시를 채우십시오.
   9. 해부 현미경, 단단히에서 Secu옆으로 사용하여 핀에 조직 재. 22.5 ° 미세 수술 자상 칼, 측면 뇌실 벽 (약 300 μm의 두께) 균일 한 얇은 섹션을 만들 수 있습니다. 큰 부분이나 어려운 곡률이 섹션의 경우, 설치 및 노트 위치에 대한 최종 부분으로 절단하기 전에 작은 조각으로 잘라.
   10. 조심스럽게, 미세 집게를 사용하여 슬라이드에 지역의 위치와 방향의 메모를 복용 슬라이드에 해부 섹션 ependyma 측 놓습니다. 거품을 피하기 위해주의하면서 aquapolymount의 얇은 층으로 조직을 커버. 조직을 통해 coverslip에 배치 coverslip에 아래에있는 모든 차이를 보충하기 위해 필요에 따라 추가 aquapolymount를 추가합니다.
   11. 실온에서 2-3 일 동안은 어둡고 건조에 장착 된 섹션을 배치합니다. 4 ° C에서 slidebox에 보관할 것.
3. 면역 조직 학적 분석
   1. O 사용에 의해 결정되는 면역 형광을 볼 공 초점 현미경을 사용하여, 심실 표면에서 촬상 초점 평면을 설정할F의 β-catenin의 (뇌실막 세포의 꼭대기 adherens 접합 단백질 마커). 뇌실막 셀 커버리지 및 표면 astrogliosis (심실 표면에서 GFAP 염색)의 영역을 묘사.
   2. 전체 심실 표면 문서와 몽타주, 전체 표면을 커버하는 중첩 된 이미지를 사용합니다. 직렬 이미지의 몽타주를 만들려면, 어도비 포토샵을 엽니 다. , 오버레이 할 이미지를 선택하는 파일> 자동화> 진 Photomerge> 대화 형 레이아웃을 사용하여 필요한 경우 수동 조정을.
   3. 그대로 ependyma의 셀 커버리지 또는 심실 표면 신경교 증의 만화 표현을 생성하는 몽타주를 추적하기 위해 새 레이어를 만듭니다. 각 슬라이드 또는 투자 수익 (ROI)에 대해 반복합니다. 자기 공명 영상 재구성에 지역 대응하는 심실 벽과 링크의지도를 재구성하는 모든 섹션을 컴파일합니다.

결과

면역 염색 50 μm의 관상 섹션과 3D 재구성 (그림 3)에 따라 마우스 측면 심실의 윤곽 추적은 볼륨 데이터가 질병이나 부상에 대한 모델 시스템으로 마우스를 사용하여 다른 실험 패러다임에서 수집 할 수 있습니다. 이 절차에 긴급 뇌실 벽이 서로 접착 영역을 배제한다. 심실의 영역 subsegmenting 각 영역 (도 3C)에 대해 다른 색을 지정함으로써, 인접한 절편을 준수 할 수 있고, ...

토론

우리는 도구와 쥐 및 인간에서 뇌의 심실 시스템의 무결성을 평가할 수있다 프로토콜을 제시한다. 이러한 도구는, 그러나, 또한, ^14,21,22 또는 ^노화 과정에서 손상, 질환으로 인한 변화를 겪는 다른 뇌 구조 또는 기관 시스템에 적용될 수있다. 전략의 단면과 길이 MRI 시퀀스들의 정렬이 특정 영역 또는 관심있는 구조의 3 차원 볼륨 표현을 생성 할 수있는 소프트웨어의 인출 이점을 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphate buffered saline (PBS)	Life Technologies	21600-069
Paraformaldehyde (PFA)	Electron Microscopy Sciences	19210	Use at 4% in PBS, 4 °C
Normal Horse Serum	Life Technologies	16050	10% in PBS-TX (v/v)
Normal Goat Serum	Life Technologies	16210	10% in PBS-TX (v/v)
Triton X-100 (TX)	Sigma-Aldrich	T8787	0.1% in PBS (v/v)
Vibratome	Leica	VT1000S
Fluorescence Microscope	Zeiss	Imager.M2
Camera	Hamamatsu	ORCA R2
Microscope Stage Controller	Ludl Electronic Products	MAC 6000
Stereology software	MBF Bioscience	Stereo Investigator 11
Stereology software	ImageJ/NIH	NIH freeware
3D Reconstruction software	MBF Bioscience	Neurolucida Explorer
Confocal Microscope	Leica	TCS SP2
MRI Software
Freesurfer	https://surfer.nmr.mgh.harvard.edu/fswiki/DownloadAndInstall	Segmentation and Volume
ITK-Snap	http://www.itksnap.org/pmwiki/pmwiki.php		Segmentation and Volume
Multi-image Analysis GUI (Mango)	http://ric.uthscsa.edu/mango/		Longitudinal overlay
Whole Mount Equipment
22.5° microsurgical straight stab knife	Fisher Scientific	NC9854830
parafilm
wax bottom dissecting dish
pins
fine forceps
aquapolymount
Dissecting Microscope	Leica	MZ95
Whole Mount Antibodies
mouse anti-b-catenin	BD Bioschiences, San Jose, CA, USA		1:250
goat anti-GFAP	Santa Cruz Biotechnology		1:250
rabbit anti-AQP4 (aquaporin-4)	Sigma-Aldrich		1:400
Coronal Antibodies
Anti-S100β antibody	Sigma-Aldrich		1:500
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Life Technologies	D-1306	10 µg/ml in PBS