렌티 바이러스 형질 도입 및 장내 Organoids의 다운 스트림 분석을위한 프로토콜

요약

In this video protocol we give a step by step explanation of lentiviral transduction in organoids of primary intestinal epithelium and of processing and downstream analysis of these cultures by quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry.

초록

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth factors. Since organoids are highly similar to the original tissue in terms of homeostatic stem cell differentiation, cell polarity and presence of all terminally differentiated cell types known to the adult intestinal epithelium, they serve as an essential resource in experimental research on the epithelium. The possibility to express transgenes or interfering RNA using lentiviral or retroviral vectors in organoids has increased opportunities for functional analysis of the intestinal epithelium and intestinal stem cells, surpassing traditional mouse transgenics in speed and cost. In the current video protocol we show how to utilize transduction of small intestinal organoids with lentiviral vectors illustrated by use of doxycylin inducible transgenes, or IPTG inducible short hairpin RNA for overexpression or gene knockdown. Furthermore, considering organoid culture yields minute cell counts that may even be reduced by experimental treatment, we explain how to process organoids for downstream analysis aimed at quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry. Techniques that enable transgene expression and gene knock down in intestinal organoids contribute to the research potential that these intestinal epithelial structures hold, establishing organoid culture as a new standard in cell culture.

서문

장 상피 세포는 암 줄기 세포에 대한 연구에서 폭 넓은 관심을 끌기가 발생했습니다 가장 빠르게 증식하는 신체 조직 중 하나입니다. 2009 년 기술은 3 차원 구조 ^(1)을 보존, 리겔에 소장 지하실의 오래 지속 문화를 생성하기 위해 출판되었다. 이러한 구조는, 장 organoids는 매체 BMP-시그널링 경로 저해제 소량 (노그)을 포함하여 정의 된 성장 인자의 수와 보충 둘러싼, 표준 기술을 사용하여 배양 할 수있다라고하고 1 (Rspo1)를 rspondin이 Wnt 신호 전달 경로 인핸서 및 표피 성장 인자 (EGF)는 모든 증식 ^{2-4 장을} 향상 알았다.

Organoids는 줄기 세포 계층을 유지하고, 그들이 비 - 돌연변이 된 것을 특징 전통적인 암 세포주를 능가 INT 작은 초기에있는 모든 세포 계통 세포 내로 그대로 편광 전시 분화를 표시estinal 상피. 그들은 유전자를 운반하는 형질 도입 될 수 있거나 간섭 RNA ⁵ 구축 때문에, 비용과 속도 측면에서 트랜스 제닉 마우스를 이용하여 실험을 능가 특정 유전 적 요소를 연구하는 데 사용된다. organoids 형질 전환 발현은 뮤린 레트로 바이러스 또는 렌티 바이러스 벡터 ^-6,7- 하나를 사용하여 수행 될 수있다. 유사 분열 세포에 독점적으로 인해 ^{8 열} 변환 가능한 뮤린 레트로 바이러스의 제한, 렌티 바이러스 형질 도입 더 흔히 organoids 같은 감염하기 어려운 세포를 위해 사용된다.

바이러스로 형질 도입하고 안정적​​으로 발현하는 형질 전환 organoids 분석 및 면역 정량 RNA를 포함하여, 하류의 분석 다수 사용할 수있다. 이와 함께, 주 장내 상피 세포에서 organoids의 문화는 특정 실험실 요구 사항없이 구현하기 쉬운 일상적인 기술로 진화하고 있으며, 가전의 새로운 표준이되었습니다장 상피 세포에 대한 연구에서 LL 문화.

바이러스 성 전달 및 organoids 후속 다운 스트림 분석 기술은 수행과 우리가 배양 organoids의 렌티 바이러스 전달하는 방법을 보여주는,이 비디오 프로토콜을 생성 organoid 실험을 돕기 위해 지루한. 우리는 또한 수율을 증가 때문에 RNA 기술 또는 면역 조직 화학 염색을 이용하여 다운 스트림 분석의 성능을 향상시킬 수있는 방법을 올바른 처리 organoids의 보여줍니다. 설명 된 기술들은 또한 결장 organoids에 적용 할 수 있지만, 프로토콜, 소장 지하실에서 유래 organoids 독점적으로 사용 하였다.

프로토콜

형질 시약 등의 폴리에틸렌 이민 (PEI) 1. 준비

1. H ₂ O 100 ㎖에 PEI의 약 150 mg을 녹이고
2. 솔루션은 분명해진다 완전히 용해 될 때까지 저어 때까지 염산을 첨가하여 pH를 7.4 솔루션을 조정합니다. 이것은 10 내지 60 분을 1 ㎎ / ㎖의 최종 농도로 물을 첨가 할 수있다.
3. 때 분명, 5 ml의의 분량에 ° C의 냉동고에서 -80 멸균 0.22 μm의 필터와 매장을 통해 PEI 솔루션을 필터링합니다.

렌티 바이러스 입자 2. 생산

1 일 :

1. 162cm ² 플라스크 또는 세포주 배양 배지에서 큰 페트리 접시 (10 % FCS, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 및 2 mM의 글루타민을 보충 보충 된 DMEM) 중 60 % -80 %의 컨 플루 분열 HEK293T 세포.

제 2 일 :

2. 함께 추가하여 총 플라스미드 DNA의 45 μg의를 포함하는 DNA 형질 솔루션을 준비렌티 바이러스 포장 벡터 (7 pVSVg의 μg의; pRSV 레브의 5 μg의 13 pMDL의 μg의) 이해와 관심의 shRNA의 유전자를 코딩하는 렌티 바이러스 플라스미드의 20 μg의. DMEM을 사용하여 1 ml의 부피로 조정한다.
3. DMEM 930 ㎕의 1 ㎎ / ㎖ PEI의 90 μl를 첨가하여 형질 PEI 용액을 제조하고 실온에서 5 분 동안 배양한다.
4. PEI 솔루션 DNA 형질 솔루션을 추가합니다. 와동 번 반전 및 DNA 형질 감염을 첨가하여 실온에서 5 분 동안 배양하거나.
5. HEK293T 세포에 DNA 형질 감염 용액 2 ㎖ 드립 37 ° C에서 가습 된 세포 배양 인큐베이터에서 4 시간 동안 배양한다.
6. 4 시간 후, PEI를 제거하기 위해 배지를 새로 고칩니다. 그것은 새로운 매체를 추가하기 전에 세포를 세척 할 필요가 없습니다.
   참고 : 4 시간 이상 PEI가 세포 독성 및 배양 시간은 HEK293T 세포에 해를 일으킬 수 있습니다.

주 4 :

7. 공중으로 교체새로운 문화 매체 rnatant. 뜨는 (바이러스 포함)을 유지; 이 단계 2.10에서 사용됩니다.
8. 15 ml의 플라스크에 뜨는을 넣습니다. 500 x g에서 5 분 동안 죽은 세포, 원심 분리기를 제거하십시오.
9. 큰 60 ML의 주사기를 사용하여 0.45 μm의 필터를 통해 뜨는을 밀어 넣습니다. 4 ℃에서 하룻밤 저장합니다.

제 5 일 :

10. 상층 액의 두 번째 배치를 수집; 단계 2.8-2.9에서와 같이 원심 분리기 및 필터.
11. 90 분 동안 초 원심 분리기에서 50,000 XG에서 단계 2.9 초 원심 분리기 튜브 2.10 원심 분리기에서 상층 액을 풀.
12. 매우 신중 초 원심 튜브를 함유하는 캡슐을 꺼내어 원심 튜브의 내측 방향을 기억하고, 층류 후드에 넣고.
13. 펠릿은 관의 상측에 이도록 신중 방식으로 초 원심 분리기 튜브 캔트 매체 유지 열기 캡슐. 바이러스 성 펠렛을 시각화하기 어려울 수 있기 때문에,에 무엇을 기억튜브의 측면은 펠릿 형성됩니다. 마이크로 피펫을 타고 초원 심 분리기 튜브의 바닥의 측면에 볼 수있는 불투명 한 갈색 펠렛을 선동하지 않도록주의하면서 매체의 마지막 비트를 제거합니다.
14. 10 mM의 니코 티나 마이드, 10 Chir99021 μM, 10 μM Y27632 8 ㎍ / ㎖의 폴리 브렌이 보충 된 organoid 배양액 500 μL이 펠렛을 재현 탁. 높은 역가의 바이러스가 직접 organoids를 transduct하는 데 사용되기 때문에이 매체의 재 부상은 중요하다.
15. 선택적 : -80 ° C에서 250 μL의 두 일괄 적으로 분주이 매체에 바이러스를 동결.

Organoids 3. 렌티 바이러스 형질 도입

일 0 :

1. 약 50 작은 organoids를 획득하는 것을 목표로, 새로운 우물에 전달 이틀 전에 organoids의 전체 0.95 ^cm이 잘 분할합니다. 이전에 발행 된 프로토콜 ¹ (그림 3A, B)에 따라 organoids 분할합니다.
2. 낭성 하이퍼 증식 소낭 (도 3c)을 얻었다 Chir99021 10 μM 및 10 mM의 니코 티나 배지를 organoid 보완.
   참고 : 갓 분할 organoids가 Chir99021의 존재에서 재배되는 경우 낭성 납골당 가장 개발할 것입니다.

제 2 일 :

3. 이에 P1000 마이크로 피펫으로 혼합물을 방해, 피펫 팅 및 마트 리겔 중간 아래로 수확 organoids. 15 ML 튜브의 혼합물을 놓습니다.
4. 원위 개구부가 용융하여 감소되어있는 파스퇴르 피펫을 이용하여 상기 방해. 원심 분리기 organoids는 100 × g에서 5 분 동안 펠렛.
   참고 : 원심 분리기의 크기에 따라 다름, 다른 원심 분리 속도를 사용합니다. 그것은 organoids이 혼합물로부터 분리 파괴되는 정확한 속도를 찾는 것이 필요하다.
5. 상층 액을 제거하고 (0.25 % 트립신 유사) 미리 예열 1X 트립신의 500 μl를 추가합니다. 트립신에 organoids를 재현 탁하고 배양37 ° C의 물을 욕조에 3 분.
6. 세포주 배양 배지 3.5 ml를 첨가함으로써 트립신을 불 활성화 (DMEM은 10 % FCS, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 및 글루타민). 500 x g에서 5 분 동안 원심 분리기.
7. 매체의 약 20 μL에 펠렛을 떠나 뜨는을 제거합니다. 48 웰 플레이트에 잘으로 매체의이 마지막 소량 organoids을 전송합니다.
8. 단계 2.14, 재현 탁에 설명 및 3.10 단계로 계속 전달 매체에 높은 역가의 렌티 바이러스를 추가합니다. 낮은 전달 효율을 만나면, 3.9 단계를 첨가 할 수있다.
   참고 : 효율적인 전달을 위해, 일반적으로 organoids 잘 하나에 높은 역가의 렌티 바이러스의 250 μL 중 하나 나누어지는을 추가합니다. 이 프로토콜의 단계 2에서 기재 한 바와 같이 한 번의 생산에서 수집 된 모든 렌티 바이러스의 50 %를 나타낸다.
9. 선택적 : (32)에 미리 예열 원심 분리기에서 48 웰 플레이트 포함 organoids를 넣어 spinoculation를 수행 전달 효과를 향상시키기 위해6; C와 1 시간 동안 600 XG에서 회전합니다.
10. 문화 인큐베이터에서 organoid 바이러스 혼합물을 넣고 전달을 할 수 있도록 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 1 시간 동안 배양한다.
11. 선택적 : 추가로, 전달 효율을 향상 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 추가 3 시간 동안 organoids을 배양합니다.
12. organoids 펠릿 850 XG에서 5 분 동안의 microcentrifuge에 microcentrifuge 관과 원심 분리기로 전송, organoid 문화 매체의 1 ML을 추가하고 organoid 바이러스 혼합물을 재현 탁.
13. 상층 액을 제거하고 얼음처럼 차가운 리겔의 20 μL에 펠렛을 재현 탁. 이 따뜻한 될 때 물질이 굳어 있기 때문에, 여러 번에 대한 차가운 PBS로 pipetting에 의해 얼음 아래로 냉각되는 피펫 팁을 사용합니다.
14. 48 웰 플레이트에서 웰의 중앙에 방울을 넣어 고화 15 분 동안 37 ℃ 배양기에서 배양한다.
15. 15 분 후, 조심스럽게 organoid 보충 된 배양 배지 250 μl를 추가10 MM의 니코틴, 10 μM C​​hir99021 10 μM Y27632. 작은 혼란 organoid 조각은 24 시간 내에 작은 낭포 성 organoids에 형성 할 것이다.

제 5 일 :

16. 매체 리프레쉬 선택 항생제 보충 (퓨로 마이신에 대해, 4 ㎍ / ㎖의 사용).

7 일 :

17. 선택 항생제로 보충 표준 organoid 문화 매체에 대한 매체를 교체합니다.
    참고 : 신진는 Chir99021 탈퇴 후 2-3주 완료됩니다. 선택 후, organoids는 선택 항생제없이 재배 할 수있다.

정량적 RT-PCR이나 마이크로 어레이 4. Organoid RNA 준비

1. RNA 준비 기간은 제조 업체의 프로토콜에 따라 상용 키트를 사용합니다. organoids에서 매체를 제거하고 직선 리겔 포함 organoids의 돔에 β-머 캅토 에탄올로 보충 버퍼 RLT 350 μl를 추가. materi를 재현 탁P1000의 마이크로 피펫을 사용하여 피펫 팅 RLT에 알.
2. 제조 업체의 프로토콜에 따라 더 RNA 준비를 수행합니다.
3. 선택적 : 제조자의 프로토콜에 따라 50 μg의 총 RNA의 초기 입력을 요구 박수 피코 WTA 시스템을 이용하여 증폭 RNA 수율을 증가시킨다.
4. 선택적 : RNA 마이크로 어레이에 앞서 품질 관리, 제조 업체의 프로토콜에 따라 8.5 이상 (그림 5)의 RNA 무결성 번호 (RIN)을 목표로, 진핵 생물의 총 RNA 나노 칩을 사용하여 2100 bioanalyzer에 실행 샘플.

파라핀 퍼가기 및 면역 5. 처리 Organoids

1. 이전 매립 organoid 개시 파라핀 액을 유지하는 70 ° C에서 구멍 인큐베이터 피팅 12mm 직경 유리관 알루미늄 블록을 미리 가온.
2. 그대로 포함 된 organoids를 떠나, 자란 organoids와 함께 하나의 잘을 가지고 매체를 제거합니다.
3. 1 ML을 추가4 % PBS에서 파라 포름 알데히드 직선에 잘 그리고 1 시간 어디서나 4 ° C에서 하룻밤을 수정합니다.
4. 얼음 차가운 PBS 1 ml로 파라 포름 알데히드를 교체합니다.
   선택적 :이 단계 이후 4 ° C에서 1 주일까지 PBS에서 해결 organoids을 유지합니다.
5. PBS 1 ml의 고정 organoids를 재현 탁 유리 병에 넣습니다.
6. , organoids 1 분 동안 바닥에 침몰하자 PBS를 가만히 따르다 및 에오신 솔루션의 방울의 부부 매입 과정에서 organoids의 시각화를 가능하게 용해 된 70 % 에탄올로 대체합니다.
7. 실온에서 70 % 에탄올에 organoids를 남겨주세요. 30 분 후, 조심스럽게 때문에 약간 분홍빛이 도는 에오신 색의 눈으로 organoids를 시각화 할 수있는, 경사 70 % 에탄올을 제거합니다. 96 % 에탄올로 포함 솔루션을 교체합니다.
8. 단계를 반복 5.7, 다음 중 하나에 포함 솔루션을 교체 할 때마다. 70 % 에탄올, 90 % 에탄올, 96 % 에탄올, 100 % etha :이어서 다음의 솔루션을 통해 organoids 합격NOL, 100 % 에탄올, 크실렌, 크실렌.
9. 마지막 크실렌 세척을 가만히 따르다 및 튜브에 파라핀을 붓는다. 30 분 동안 70 ° C에서 미리 예열 알루미늄 블록에 즉시 튜브를 넣고 새로운 깨끗한 파라핀 파라핀을 교체합니다.
10. 큰 개방​​과 미리 예열 파스퇴르 피펫을 사용하여 파라핀 블록 금형에 오프 파라핀과 피펫 organoids을 붓고. 분젠 버너를 사용 파스퇴르 피펫을 따뜻하게 유지. 액체 파라핀의 작은 층에 파라핀 블록 금형의 모든 organoids를 놓습니다.
11. 가능한 많이, 가온 해부 바늘을 사용 파라핀 블록 금형의 중심을 향해 모든 organoids를 조작하려고. 분젠 버너를 사용 해부 바늘을 따뜻하게 유지.
12. 몰드 organoids의 지역화 양호한 경우에, 저온 금형 약간 파라핀 층 고화.
13. 상단에 더 파라핀을 부어 블록을 완료하고 표준 조직 학적 삽입 카세트를 추가합니다.

결과

Organoid 렌티 바이러스 전달

렌티 바이러스 입자를 사용 organoid 전달의 기술 이전 및 전달시 organoids의 올바른 취급에 따라 달라집니다. Organoids (도 3A) 배양했다가 단일 소낭 (도 3B)으로 파쇄 하였다. 이전에보고 된 바와 같이, GSK3 억제제 Chir99021의 존재 하에서 배양 한 이들 소낭은 낭성 지하실 ⁹ (도 3c)을되었다. 이어서 organoi...

토론

현재 비디오 기본 프로토콜은 장내 상피 및 정량 RNA 기술을 사용하여 면역 조직 화학 법 및 이들의 하류 organoids 분석 organoids의 렌티 바이러스 형질 도입을 설명한다.

렌티 바이러스 형질 도입은 종종 배양 플레이트에 부착 또는 부동 세포에서 수행된다. organoids의 입체 구조가 바이러스 입자가 침투하기 어려워 렌더링 그들을 이후 효능을 증가시키는 다수의 방법이 사용된다....

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polyethylene imine	Polysciences	23966-2
DMEM medium	Lonza	BE12-614F
Fetal calf serum	Lonza	DE14-801F
Penicillin-streptomycin	Invitrogen	15140-122
Glutamin	Invitrogen	25030-024
matrigel	BD	BD 356231
Advanced DMEM-F12	Gibco	12634-010
N2	Invitrogen	17502-048
B27	Invitrogen	17504-044
N-acetyl cysteine	Sigma	A9165-1G
mouse Egf	Invitrogen	PMG8045
Hepes 1 M	Invitrogen	15630-056
glutamax 100x	Invitrogen	35050-038
Chir 99021	Axon	1386
Y27632	Sigma	Y0503-5MG
polybrene	Sigma	107689
nicotinamide	Sigma	N0636
Trypsin	Lonza	BE02-007E
puromycin	Sigma	P 7255
Rneasy mini kit	Qiagen	74106
β-mercaptoethanol	Merck	8,057,400,250
Ovation Pico WTA system	NuGen	3300-12
paraformaldehyde	Sigma	252549-1L
glass vial conical 12 mm x 75 mm 5 ml	VWR	LSUKM12
Eosin Yellowish	VWR	1,159,350,025